Cambios en los progenitores GM

Cambios en los progenitores GM-CFU (unidad formadora de colonias de
granulocitos macrófagos) de neonatos de ratas madres tratadas
con filgrastim (rhG-CSF) durante el periodo de lactación.
Barrios, Lilian - Poletti, Oscar Héctor - Alegre, Cecilia
Challiol, Camila - Cocco, Natalia - Abraham, Raisa - Alvarez, Valeria
Cátedra Nº 1 de Fisiología Humana - Departamento de Ciencias Básicas - Facultad de Medicina - UNNE.
Mariano Moreno 1240 - (3400) Corrientes - Argentina.
E-mail: [email protected]
ANTECEDENTES
Una granulopoyesis normal con
presencia de neutrófilos circulantes biológicamente activos depende, en
parte, de la presencia y acción del factor estimulante de colonias de granulocitos (G-CSF), durante toda la vida
del individuo. (1).
El efecto de G-CSF en fetos y neonatos es actualmente un área en estudio (2-4). Al respecto, una acción
protectora de la alimentación con leche humana contra infecciones bacterianas ha sido descrita en los neonatos
siendo atribuida, entre otros a la presencia de citoquinas (5) en la secreción láctea.
En 1994, Gilmore y col, demostraron la presencia de G-CSF en la leche humana (6) y en 1999, Calhoun et al
(7) describen que, tanto el G-CSF endógeno presente en la leche de la madre, como factor estimulante de
colonias de granulocitos recombinante humano (rhG-CSF) agregado a la leche humana escapan a la proteo lisis
digestiva en lactantes, cuando son expuestos previamente a la secreción gástrica del neonato a niveles
fisiológicos de pH.
Esto sugiere que, tanto el G-CSG endógeno de la madre contenido en la secreción láctea, como rhG-CSF
eliminado por esta en la leche, estarían biológicamente disponibles para el lactante.
Sin embargo, no se conoce si la administración terapéutica de rhG-CSF a madres en período de lactación
produce cambios en la granulopoyesis de sus neonatos, debido al pasaje de este factor de crecimiento de la
madre al feto, a través de la leche materna. Este desconocimiento restringe la administración terapéutica del
rhG-CSF a la madre, durante todo el período de lactación
El objetivo del presente estudio fue investigar si las crías lactantes de madres que están siendo tratadas con rhGCSF presentan cambios en el contenido de los progenitores granulopoyéticos GM-CFU a nivel de médula ósea
femoral y tejido esplénico.
MATERIAL Y METODOS
Animales: se usaron ratas hembras Instituto de Biología que entraron en el protocolo de estudio a partir del
momento del parto, junto con sus crías.
Filgrastim (rhG-CSF): (Laboratorios Roche). 8 ratas madres fueron inyectadas los días lunes, miércoles y
viernes y 1 hora antes de ser sacrificadas para su estudio, vía sc, con 30 µg/kg de rhG-CSF disueltos en buffer
salino de fosfato (ph 7,4), desde el momento del parto y hasta el día 21 de lactación. Se eligió el período de 21
días de estudio debido a que es el momento en que normalmente se realiza el destete de los lactantes. Se eligió
el esquema de administración de G-CSF tres veces por semana por ser este, un esquema empleado en múltiples
pacientes con tratamientos de larga duración con filgrastim . 7 ratas control fueron inyectadas con diluyente.
A los 21 días, fueron sacrificadas para su estudio las 8 ratas madres a las que se administró filgrastim con sus
43 crías y las 7 madres control a las que se administró diluyente con sus 49 crías
Contajes celulares: Las células de médula ósea femoral y de bazo fueron procesadas con homogenador de vidrio
y contadas en hemocitómetro standard. Sus resultados son expresados por mg de tejido.
Morfología celular: fue evaluada en sangre periférica, médula ósea y bazo mediante frotis teñidos con May
Grünwald-Giemsa.
Determinaciones in vitro: cultivos en metilcelulosa - Se determinaron los progenitores GM – CFU de fémur y
bazo con el método de metilcelulosa descrito por Iscove y Sieber (8).
La cantidad de células fue de una concentración final de 5 x 104 /ml de medio de cultivo para estudio de GMCFU medulares y de 2 x 10 5 para GM – CFU esplénicas. La suspensión final se colocó en placas de petri
descartables y se dejó permanecer 8 días para estudio de GM-CFU, en estufa de cultivo con control electrónico
de temperatura a 37º C y atmósfera húmeda de 5 % de CO 2 (Cole Parmer Instruments).
Las colonias fueron contadas en microscopio invertido Nikon. Fueron consideradas colonias derivadas de GMCFU a colonias con una mezcla mayor de 8 células pequeñas; claras y redondeadas con células grandes
caracterizadas por una alta relación núcleo - citoplasmática. Las colonias fueron contadas a los 8 días de
cultivo.
Análisis estadístico: los datos obtenidos se analizaron mediante el Test no paramétrico de Mann-Whitney en
procesador estadístico Instat de Graph Pad 3. Los datos son expresados como promedio ± un error standard y se
consideró significativa una p< de .05.
RESULTADOS
Cambios en el contenido de progenitores hematopoyéticos
Como puede observarse en la Figura 1 : en los lactante de madres que fueron tratadas con rhG-CSF las células
progenitoras granulocíticas, tanto el número de GM-CFU femorales como esplénicas sufrieron una
disminución, que fue significativa a nivel femoral.. Las células progenitoras BFU-E y CFU- E, progenitores de la
serie eritrocítica, no sufrieron cambios salvo en el número de BFU-E de bazo, que disminuyó en forma
significativa
Figura 1: Número de células progenitoras GM-CFU; BFU- E y CFU-E de médula
ósea femoral y bazo x mg de tejido de crías lactantes de ratas madres inyectadas
desde el momento del parto, con 30 ug/kg de rhG-CSF y sacrificadas a los 21 días
post - parto (Lactantes + rhG-CSF: barras punteadas negras)
Crías lactantes de
ratas madres inyectadas con diluyente constituyen el lote control (Lactantes Control:
barras punteadas grises). Los resultados se expresan como promedio ± error
estándar. ** : p< .01.
Cambios en el porcentaje de precursores granulocíticos de médula ósea femoral
Las crías lactantes de madres tratadas con rhG-CSF aumentaron en forma significativa tanto el porcentaje de
células precursoras granulocíticas de médula ósea femoral (estadio de mieloblasto hasta neutrófilos maduros)
(Figura 2) como de bazo (datos no mostrados), comparados con los animales lactantes control cuyas madres
fueron inyectadas con diluyente
Figura 2: Porcentaje de células granulocíticas medulares femorales x mg de tejido.
Lactantes + rhG-CSF (barra punteada negra): crías lactantes de ratas madres
inyectadas desde el momento del parto con 30 ug/kg de rhG-CSF los días lunes,
miércoles y viernes y 1 hora antes del sacrificio de todos los animales a los 21 días
posteriores al parto. Lactantes Control (barra punteada gris): crías lactantes de ratas
madres inyectadas con diluyente. Los resultados se expresan como promedio ± error
estándar. ** : p< .01.
DISCUSION Y CONCLUSIONES
Trabajos previos han demostrado la presencia de G-CSF en la leche humana (6) y la resistencia de rhG-CSF
agregado a la leche humana, a la degradación por acción de las secreciones digestivas del neonato (7).
Estos hallazgos permitían suponer que, animales amamantados por ratas madres tratadas con rhG-CSF,
podrían mostrar cambios en su granulopoyesis, relacionados a efectos ya demostrados de este factor de
crecimiento hematopoyético.
G-CSF es un factor de crecimiento que causa neutrofilia en sangre circulante, acompañada de aumento del
porcentaje de células precursoras granulocíticas medulares y esplénicas en ratas y ratones adultos (9); y acorta
el período de neutropenia en humanos y animales tratados con quimioterapia (10) y en pacientes con
neutropenia crónica (9).
En nuestro trabajo, el aumento significativo de la población de precursores granulocíticos , que observamos
tanto en médula ósea femoral como en bazo en los lactantes de madres tratadas con rhG-CSF, podría ser
atribuido al efecto del rhG-CSF administrado a la madre y que, eliminado por esta en la leche, sería absorbido
por los lactantes. Una vez en la circulación el rhG-CSF actuaría sobre las células medulares femorales y
esplénicas involucradas en la granulopoyesis del lactante La disminución del número de células progenitoras
granulocíticas GM-CFU, tanto a nivel medular femoral como esplénico, observada en las ratas lactantes de
madres tratadas con rhG-CSF, puede ser atribuida a la aceleración de maduración de estas células progenitoras
por efecto del rhG-CSF, aportado por la leche de la madre. En tanto que, la disminución significativa del número
de BFU-E a nivel de bazo ,podría estar indicando que en las ratas de 21 días de edad (día en que fueron
sacrificados todos los lactantes para su estudio) no hay aún un manejo tan preciso de la hematopoyesis como en
las ratas adultas que, ante el estímulo para aumentar la granulopoyesis que significa el tratamiento con rhG-CSF,
aumentan la población mieloidea medular a expensas de la derivación de parte de la eritropoyesis al bazo (9).
Nuestros resultados nos permiten concluir que los cambios observados en la granulopoyesis de ratas lactantes
cuyas madres han recibido la administración de rhG-CSF, son consistentes con la absorción a nivel intestinal,
por parte de dichos lactantes, de este factor de crecimiento eliminado en la leche de la madre.
BIBLIOGRAFIA
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