nuevo método de pcr anidada en tiempo real con evagreen para

2° Congreso Nacional de Química Médica
Hernández-Arteaga y col.
NUEVO MÉTODO DE PCR ANIDADA EN TIEMPO REAL
CON EVAGREEN PARA DETERMINAR LA CARGA DE
PAPILOMAVIRUS
Socorro Hernández-Arteaga, Mireya Sánchez-Garza, Rubén López-Revilla División de Biología
Molecular, IPICYT, 78216 San Luis Potosí, SLP. Correo electrónico: [email protected]
RESUMEN
El cáncer cervicouterino (CaCu) es la primera causa de muerte por cáncer en las
mujeres mexicanas. Su desarrollo requiere infección por virus del papiloma humano
(VPH). Los virus asociados al CaCu son ‘de alto riesgo’, como los tipos 16 y 18. La
amplificación de DNA viral mediante la reacción de polimerización en cadena (PCR)
permite diagnosticar la infección por VPH y tiene valor predictivo del riesgo de desarrollar
CaCu. La PCR en tiempo real (PCR-TR) permite determinar la carga viral (i.e., cuantificar
el número de copias de los genes blanco). La PCR-TR con SYBRGreen es la técnica más
usada para la investigación y el diagnóstico rutinario. El propósito de este trabajo fue
desarrollar un método de PCR-TR más sensible para determinar la carga viral de VPH16
empleando EvaGreen como fluorocromo. SiHa, línea celular derivada de un CaCu
invasor, contiene una copia del genoma de VPH16 por célula, pone a prueba la
sensibilidad de los métodos de detección. Para aumentar la sensibilidad desarrollamos un
método de PCR anidada en el cual preamplificamos un producto de la región E6/E7 de
VPH16 de 645 pb por PCR convencional y en la segunda reacción ‘anidada’ (en tiempo
real) amplificamos un producto de 249 pb empleando EvaGreen. Cuantificamos la carga
viral de muestras problema por interpolación con los valores del ciclo umbral (Ct) de
mezclas con 2.5×103-2.5×106 copias de pHV101 (plásmido con un inserto E6/E7-VPH16
de 645 pb). Detectamos las dos copias esperadas de VPH16 por célula SiHa y
determinamos el número de copias en las muestras cervicales con grado conocido de
displasia. Nuestro método, más sensible y barato que el de SYBRGreen, disminuiría los
costos para determinar la carga viral y contribuiría al estudio de la epidemiología
molecular de la infección del cérvix por VPH.
Palabras clave: Cáncer cervicouterino, PCR en tiempo real, Virus del papiloma humano
INTRODUCCIÓN
El cáncer cervicouterino (CaCu) es la segunda causa de muerte por cáncer entre
las mujeres de todo el mundo y la primera en los países en desarrollo incluyendo a
México. La falta de acceso oportuno al diagnóstico y tratamiento es la razón de su alta
prevalencia principalmente en mujeres pobres, de baja escolaridad, que habitan en las
áreas rurales y en las zonas marginadas de las ciudades. En México hubo alrededor de
13,400 muertes por cáncer cervicouterino en el año 2002 por lo cual cada hora y media
murió una mujer mexicana por este mal.
El desarrollo de las lesiones precancerosas y cancerosas está asociado a la
infección por virus del papiloma humano (VPH), trasmitidos a las mujeres por contacto
sexual genital con hombres infectados. Algunos virus causan verrugas o condilomas
(lesiones benignas que no progresan al cáncer, usualmente causadas por los tipos 6 y
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11), mientras que otros provocan la transformación neoplásica de las células del epitelio
del cuello uterino y por eso son llamados oncogénicos o ‘de alto riesgo’. Se ha
demostrado la presencia de genes de VPH de alto riesgo en el 99.7% de los casos de
CaCu invasor, por lo cual se acepta que los VPH de alto riesgo son el principal factor
necesario para el desarrollo del CaCu. Los virus de alto riesgo más frecuentes son los
tipos 16, 18 y 31.
El diagnóstico citológico de la infección por papilomavirus se realiza con el método
de Papanicolaou, que puede tener fallas por deficiencias en la calidad de las muestras,
baja sensibilidad (44-88%), y una alta proporción de falsos negativos (10-54%).
Actualmente hay diversos métodos moleculares más sensibles y específicos que
complementan al Papanicolaou para diagnosticar la infección por papilomavirus. La PCR
en tiempo real (PCR-TR) permite la cuantificación de secuencias nucleotídicas definidas.
La intensidad creciente de la fluorescencia del producto de amplificación en función del
número de ciclos de polimerización permite extrapolar el valor del ciclo umbral (Ct), el cual
es inversamente proporcional al número de las secuencias blanco presentes en las
muestras control (i.e., con un número conocido de copias de la secuencia blanco) y
problema.
La PCR-TR que emplea al SYBRGreen como flurorocromo es la técnica más
empleada actualmente para la investigación y el diagnóstico rutinario. En este trabajo
hemos desarrollado un método alternativo de PCR-TR más sensible y barato para la
cuantificación de la carga viral de VPH16 en muestras de raspados cervicales con un
nuevo fluorocromo llamado EvaGreen.
MÉTODOS
Oligonucleótidos. Utilizamos dos parejas de oligonucleótidos para la detección de
VPH de alto riesgo (Fujinaga et al. 1991). La primera (LCR/E7AS) genera un producto
E6/E7 de 645 pb que abarca del del nucleótido (nt) 26 al 671 en el genoma de HPV16 . La
segunda pareja (pU1M/pU2R) genera un producto de 249 pb incluido en la secuencia del
primero que abarca del nt 419 al 668.
Control con número de copias conocido. Amplificamos el producto E6/E7 de 645
pb a partir de un plásmido con la misma secuencia clonada en el vector pHV101 derivado
de pGEM, para contar con un control con un número conocido de copias. Considerando el
tamaño de la construcción calculamos que en 10 ng de pHV101 hay 2.5×109 copias del
fragmento clonado.
Fluorocromos. EvaGreen y SYBRGreen a concentración final 1×. El volumen total
de las mezclas de PCR fue de 50 µl con el kit de Invitrogen (No. Cat. 11615-010). Las
concentraciones finales de cada componente fueron MgCl2 3 mM; oligonucleótidos 0.15
µM; dNTPs 0.05 mM; Taq DNA polimerasa 30 mU/ml. Como DNA molde utilizamos
2.5×104-2.5×107 copias de pHV101. El programa de amplificación en el Icycler (BioRad)
fue de 50 ciclos, con desnaturalización a 95°C por 15 seg, annealing a 58°C por 1 min y
extensión a 72°C por 1 min.
Preamplificación. Usamos cinco tipos de mezclas: 1) con 2.5×106 copias de
pHV101, 2) control negativo sin DNA (blanco), 3) control positivo con 50 ng de DNA de
células SiHa, 4) control negativo con 50 ng de DNA de sangre humana normal y 5)
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muestras problema de raspados cervicales con displasia por VPH16, las cuales fueron
sometidas a 10 ciclos de PCR convencional utilizando la pareja de oligonucleótidos E6/E7
de 645 pb y el programa descrito.
PCR anidada en tiempo real con EvaGreen usando como molde el producto
preamplificado. Preparamos las mezclas de PCR agregando 1 µl de la mezcla
preamplificada, EvaGreen y la pareja de oligonucleótidos interna de 249 pb. Para obtener
la familia de curvas control con un número de copias conocido empleamos diluciones
logarítmicas a partir de la mezcla de pHV101 preamplificada para contar con estándares
de 2.5×102 a 2.5×106 copias. Los controles y las muestras problema preamplificadas
también sirvieron de molde para la PCR en tiempo real. Incluimos como control negativo
una muestra del DNA de SiHa preamplificada que contenía sólo el oligonucleótido F de la
pareja de 249 pb.
RESULTADOS
Sensibilidad. En mezclas para la amplificación de E6/E7 645 pb con 2.5×104-2.5×107
copias iniciales de pHV101 obtuvimos dos familias de curvas consistentes y
proporcionales con EvaGreen y SYBRGreen. Para la curva con 2.5×107 copias iniciales,
el valor de Ct (ciclo umbral) con EvaGreen fue 11.95 mientras que para SYBRGreen fue
16.00. Para mezclas con 2.5×104 copias la curva no permitió obtener el valor de Ct con
SYBRGreen mientras que con EvaGreen el valor de Ct fue 22.50 y fue conservada la
proporcionalidad y la consistencia con el resto de los los valores de la familia de curvas
(Tabla1).
Copias de pHV101
7
2.5 × 10
6
2.5 × 10
5
2.5 × 10
4
2.5 × 10
Valores de Ct
SYBRGreen
16.00
19.20
22.2
Amplificación nula
EvaGreen
11.95
15.36
19.18
22.50
Tabla 1. EvaGreen es 10 veces más sensible que SYBRGreen
PCR anidada en tiempo real con EvaGreen. Los valores de Ct y ∆Ct (diferencia entre
los valores de Ct vecinos que para diluciones logarítmicas teóricamente debe ser 3.3)
obtenidos en tiempo real fueron consistentes en cada una de las curvas obtenidas con
diferente número de copias iniciales de pHV101 y de muestras problema. El coeficiente de
correlación lineal obtenido con los valores del logaritmo del número de copias vs el valor
de Ct fue de 0.998 y el valor de la pendiente de la recta construida con los valores de Ct
de la familia de curvas de pHV101 fue -3.7. La interpolación de los valores de Ct
obtenidos con el control positivo con DNA de células SiHa permitió detectar 1 copia de
genoma viral por célula; en este experimento también calculamos por interpolación la
carga viral de las muestras problema.
Especificidad. Para analizar la especificidad de los productos de amplificación
analizamos la extinción térmica de la fluorescencia en las mezclas con diferentes números
de copias de pHV101 y de cada muestra problema. Encontramos patrón con un pico con
extinción máxima de la fluorescencia a 85.5°C en todas las muestras con pHV101, en el
control positivo con DNA de SiHa y en todas las muestras problema, pero no en la
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muestra con un solo oligonucleótido (Fig. 1).
Fig. 1. El patrón de extinción de fluorescencia coincide para el producto principal de pHV101, SiHa y las
muestras problema. Valor máximo de extinción = 85.5°C.
Correlación de la carga viral con el grado de displasia. Hicimos un análisis
preliminar de 10 muestras con infección única por VPH16 tipificadas previamente en
nuestro laboratorio que mostró una correlación directa de la carga viral con el grado de
displasia (Fig. 2).
Figura 2. Correlación de la carga viral con el grado de displasia del cérvix. Clave de las muestras con lesiones
displásicas: 1, NIC1; 2, NIC2; 3, NIC3; 4, CaCu invasor.
CONCLUSIONES
1. El uso de EvaGreen hace a nuestro método de PCR en tiempo real más sensible y
barato e igualmente específico y reproducible que el de SYBRGreen.
2. Hasta donde sabemos, nuestro método de PCR anidada en tiempo real con EvaGreen
es el primero que se ha desarrollado.
3. Con este método logramos detectar una copia del genoma de VPH16 por célula y
confirmamos que la carga viral correlaciona con el grado de displasia cervical.
REFERENCIAS
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Fujinaga Y, Shimada M, Okasawa K, Fukushima M, Kato I, Fujinaga K. Simultaneous detection and typing
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