Bases moleculares de la tolerancia al frío inducida por el

Bases moleculares de la tolerancia al frío inducida
acondicionamiento a altas temperaturas en frutos cítricos
por
el
B. Establés1, M.T. Lafuente1, J. Forment2, J. Gadea2 y L. González-Candelas1
1
Grupo de Fisiología y Biotecnología de Postcosecha. Instituto de Agroquímica y
Tecnología de Alimentos (IATA-CSIC), Apdo. Correos 73, 46100, Burjassot (Valencia).
2
Laboratorio de Genómica. Instituto de Biología Molecular y Celular de Plantas (IBMCP,
UPV-CSIC), Avenida de los Naranjos, s/n, 46022 Valencia.
Palabras clave: acondicionamiento térmico, daños de frío, factor de transcripción,
genómica funcional, micromatriz de cDNA.
Resumen
Entre los cultivares de cítricos que desarrollan daños de frío (DF) se
encuentra la variedad de mandarina ‘Fortune’. El tratamiento de ‘curado’ (3d
37ºC) previo al almacenamiento a 1ºC, temperatura que causa DF, previene la
aparición de DF. Para profundizar en el conocimiento de las respuestas tempranas y
tardías asociadas con la tolerancia al frío inducida mediante el ‘curado’, se
construyó una biblioteca de cDNA de flavedo de frutos de mandarina ‘Fortune’
acondicionados y almacenados hasta 10 días en frío y se analizó el patrón de
expresión, mediante análisis Northern, de 22 factores de transcripción aislados de
dicha biblioteca. Los genes estudiados se clasificaron en diferentes patrones de
expresión de acuerdo a su regulación en respuesta al frío, al calor y a la
combinación de calor y frío. Algunos de ellos, como los genes que codifican
proteínas del complejo TFIID y de la familia WRKY, podrían estar asociados con el
efecto beneficioso del tratamiento de curado incrementando la tolerancia al frío de
las mandarinas ‘Fortune’. Además, se llevaron a cabo experimentos de hibridación
de micromatrices de cDNA que contienen 6875 genes de la colección del Consorcio de
Genómica Funcional de Cítricos (CFGP), que permitieron identificar otros genes y
procesos biológicos relevantes en esta resistencia inducida frente al estrés de frío.
INTRODUCCIÓN
La conservación a bajas temperaturas de los productos hortofrutícolas es la técnica
más empleada para mantener la calidad y prolongar su vida útil. En los frutos cítricos, el
almacenamiento a temperaturas próximas a 1ºC es exigido como tratamiento de
cuarentena para su exportación a países como EEUU y Japón. Numerosos estudios han
revelado que el acondicionamiento de los sistemas vegetales a altas temperaturas, pero no
letales, aumenta la tolerancia al frío de los cultivares susceptibles a desarrollar daños de
frío (DF). En el caso concreto de la mandarina ‘Fortune’, variedad sensible al frío
utilizada como modelo de estudio, se ha demostrado que un acondicionamiento de 3 días
a 37ºC (curado) previene la aparición de DF, caracterizados por la aparición de picado y
de áreas de color pardo en la parte más externa de la corteza (flavedo) cuando los frutos
se conservan a 1ºC (Lafuente et al. 2005).
La mayor parte de los esfuerzos realizados hasta el momento se han dirigido a
entender los cambios bioquímicos y fisiológicos asociados a los DF mientras que los
cambios moleculares asociados a los tratamientos de acondicionamiento térmico que
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inducen aclimatación al frío han sido poco estudiados (Lafuente et al. 2005). Teniendo en
cuenta resultados previos que indican que el curado tiene un efecto marcado sobre la
expresión de genes relevantes en la maquinaria transcripcional de las células vegetales
(Sanchez-Ballesta et al., 2003), en este trabajo se ha llevado a cabo el análisis de la
expresión de 22 factores de transcripción, aislados de una biblioteca de cDNA construída
a partir del flavedo de frutos acondicionados y almacenados a 1ºC.
El segundo objetivo de este trabajo ha sido el estudio e identificación de otros
genes potencialmente implicados en la tolerancia al frío inducida por el tratamiento de
curado en frutos de mandarina ‘Fortune’, mediante experimentos de hibridación de una
micromatriz de cDNA de la colección del CFGP que contiene 6875 unigenes procedentes
de distintas etapas del ciclo fisiológico de los cítricos, o que se inducen frente a diversas
situaciones de estrés en frutos u otras partes de la planta (Forment et al., 2005).
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal y condiciones de almacenamiento
Frutos de mandarina de la variedad ‘Fortune’ (Citrus clementine Hort. Ex Tanaka
X Citrus reticulata, Blanco) se recolectaron al azar de árboles adultos de la localidad de
Burriana (Castellón). Los frutos se dividieron al azar en 3 lotes. El primero se
acondicionó durante 3 días a 37ºC y con una humedad relativa (HR) del 90-95 %
(curado) y posteriormente se transfirió a una cámara de almacenamiento a 2ºC
(temperatura de DF) y 80-85% HR. El segundo y tercer lote se almacenaron
inmediatamente después de la recolección a 12ºC (temperatura control que no causa DF)
y a 2ºC respectivamente, y el 80-85% HR. El periodo de almacenamiento para los 3 lotes
fue de 60 días. El Indice de DF (IDF) de los frutos acondicionados y no acondicionados
se calculó de forma periódica a lo largo de los 60 días de almacenamiento siguiendo una
escala visual del 0 (sin daño) al 3 (daño severo) de acuerdo con la intensidad del
manchado.
Construcción de una biblioteca de cDNA y análisis de secuencias
La construcción de la genoteca se llevó a cabo a partir de poly(A+) RNA de
flavedo de frutos de la mandarina Fortune acondicionados desde 4 horas hasta 3 días a
37ºC y de frutos acondicionados 3 días a 37ºC (curados) y almacenados posteriormente 1,
3 y 10 días a 1ºC, utilizando los kits comerciales ‘ZAP-cDNA Síntesis Kit’(Stratagene)
para la síntesis del cDNA y ‘ZAP-cDNA GigapacK III Gold Cloning Kit’ (Stratagene)
para el empaquetamiento y transfección. El análisis de las secuencias se realizó con el
programa informático Seqtools (http:// www.dnatools.org/seqtools.html) utilizando en la
búsqueda de secuencias homólogas el algoritmo BLASTX. Para la anotación funcional se
utilizó la base de datos de proteínas de A .thaliana del MIPS (Munich Information Center
for Protein Sequences, http://mips.gsf.de).
Análisis Northern del patrón de expresión
Se seleccionaron 22 ESTs de la bibliotca de cDNA que presentaban similitud con
diversos factores de transcripción. Estos cDNAs se marcaron con (32P)dATP y se
hibridaron con muestras de RNA procedentes de flavedo de frutos de mandarina
‘Fortune’ acondicionados (3d 37ºC) y no acondicionados, y almacenados durante
diferentes periodos de tiempo a 1ºC, siguiendo protocolos ya descritos (Ballester et al.
2006).
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Hibridación de micromatrices de cDNA y análisis estadístico
La hibridación de micromatrices se llevó a cabo según el método descrito por
Forment et al. (2005). Con objeto de detectar genes que se expresaran de forma
diferencial en respuesta al calor, al frío o a la combinación de calor + frío, se estudiaron 4
situaciones diferentes: 1) Frutos recién traídos del campo (RTC); 2) Frutos curados (C);
3) Frutos curados y almacenados 20 días a 2ºC (C+F); 4) Frutos almacenados a 2ºC
durante 20 días (F). El cDNA procedente de estas muestras, marcadas con el fluoróforo
Cy5, se hibridó junto a una muestra de referencia formada por una mezcla de todas ellas y
marcada con el fluoróforo Cy3, con las micromatrices de cDNA del CFGP. La
cuantificación de las imágenes se realizó con el programa Genepix Pro 6.0 (Axon
Instruments, Union City, CA) y los resultados fueron analizados estadísticamente con los
paquetes informáticos TM4 (http://www.tigr.org/) y GEPAS (http://www.gepas.org/).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
A partir de la biblioteca de cDNA se secuenciaron 1152 clones que representan
984 genes distintos (unigenes). En la Figura 1 se muestra la distribución por categorías
funcionales de los genes aislados. Cabe señalar que un 46% de los unigenes aislados de la
biblioteca de cDNA son específicos de la misma con respecto a un conjunto de 46
bibliotecas de cDNA que engloban alrededor de 13000 unigenes depositados en la base
de datos del CFGP (Forment et al., 2005).
El análisis de expresión de los 22 factores de transcripción seleccionados permitió
su clasificación teniendo en cuenta su regulación por frío, calor y la combinación de calor
y frío. Los genes cuyo nivel de expresión se ve alterado (inducción o represión) en
respuesta al calor y/o a la combinación de calor y frío en los frutos curados y
almacenados en frío podrían estar asociados al efecto beneficioso del curado previniendo
la aparición de DF. Entre ellos destacan tres genes que presenta homología con factores
de transcripción de la familia WRKY y dos constituyentes del complejo TFIID de inicio
de la transcripción en eucariotas, concretamente una “TATA-binding protein” (TBP) y el
factor de transcripción TFIIA.
Análisis estadístico de micromatrices de cDNA
El análisis estadístico a nivel de genes individuales, reveló que 284 genes
responden de forma significativa al calor, 290 al frío y 451 a la combinación de calor y
frío.
En un nivel superior de análisis, en el que se estudian rutas y procesos biológicos
como un conjunto en lugar de genes individuales, se observó que un 30% de los genes
que se reprimen en respuesta al frío directo desempeñan una función en la síntesis de
proteínas y que el 12% de los genes cuya expresión es mayor en frutos acondicionados
previamente al almacenamiento en frío están implicados en la síntesis de aminoácidos.
Sin embargo, es interesante señalar que este proceso biológico no está estadísticamente
sobrerepresentado en respuesta al calor per se. Desde este punto de vista podría sugerirse
que uno de los efectos beneficiosos del curado reduciendo los DF se basa en un
mecanismo compensatorio de la disminución en la síntesis de proteínas que se produce
en respuesta al frío.
385
Agradecimientos
Estas investigaciones han sido financiadas por los proyectos AGL2002-01727 y
GEN2001-4885-C05 del Ministerio de Educación y Ciencia, y por ayudas de la
Conselleria de Agricultura, Pesca y Alimentación de la Generalitat Valenciana.
Agradecemos la ayuda prestada por Dolores Aroca y Ana Izquierdo, personal técnico del
laboratorio.
Referencias
Ballester, A.R., Lafuente, M.T. and González-Candelas, L. 2006. Spatial study of
antioxidant enzymes, peroxidase and phenylalanine ammonia-lyase in the citrus fruitPenicillium digitatum interaction. Postharvest Biology and Technology. 39: 115-124.
Forment, J. et al. 2005. Development of a citrus genome-wide EST collection and cDNA
microarray as resources for genomic studies. Plant Molecular Biology. 57: 375-391.
Lafuente, M.T. et al. 2005. Understanding the Basis of Chilling Injury in Citrus Fruit.
Acta Hort. 682: 831-841.
Sanchez-Ballesta, M.T., Lluch, Y., Gosalbes, M.J., Zacarias, L., Granell, A. and
Lafuente, M.T. 2003. A survey of genes differentially expressed during long-term
heat-induced chilling tolerance in citrus fruit. Planta. 218:65-70.
Figuras
REGULA TION OF /
INTERA CTION WITH
CELLULA R
ENVIRONM ENT
1%
CELL RESCUE,
CELLULA R
DEFENSE A ND
COM M UNICA TION/S
VIRULENCE
IGNA L
4%
TRA NSDUCTION
M ECHA NISM
CELLULA
R
3%
TRA NSP ORT A ND
TRA NSP ORT
M ECHA NISM S
2%
CONTROL OF
CELLULA R
ORGA NIZA TION SUB CELLULA R
LOCA LISA TION
1%
CELL FA TE
1%
1%
TRA NSP ORT
FA CILITA TION
1%
M ETA B OLISM
43%
P ROTEIN FA TE
8%
P ROTEIN
SYNTHESIS
8%
TRA NSCRIP TION
13%
CELL CYCLE A ND
DNA P ROCESSING
11%
ENERGY
3%
Figura 1: Distribución de ESTs de la biblioteca de cDNA en categorías
funcionales utilizando la base de datos de proteínas de A. thaliana (Munich
Information Center for Protein Sequences, http://mips.gsf.de).
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