tesis - Universidad de Colima

UNIVERSIDAD DE COLIMA
FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES
BIOMEDICAS
“ OBTENCION Y CARACTERIZACION
DE VESICULAS DE
MEMBRANA TILACOIDEA DE CLOROPLASTOS DE
AMARANTHUS HYBRIDUS”.
I
TESIS
Para obtener el Título de:
MAESTRO EN CIENCIAS
con Especialidad en Fisiología
Presenta
Marcos Antonio Díaz Polanco
Colima, Col., Enero 1 996.
INTRODUCCION . . . . . . . . . . . .
.
.
1
ANTECEDENTES . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . .
ll
OBJETIVOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
13
..
MATERIAL Y METODOS . . . . . . , , . . . . , . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . , . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . .
14
RESULTADOS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
17
DISCUSION ..................................................................
29
CONCLUSIONES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
35
APENDICE . . . . . . . . . . . . . . . . . , , . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . . . . . . . . . . . . . . . . , . . . , . . . . . . . , . , . . . . . . 3. 6
LITERATURA CITADA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .
40
1
Los cloroplastos son los organelos vegetales responsables de llevar a
cabo la fotosíntesis, que es el proceso biológico mediante el cual la energía de
la luz solar es absorbida y utilizada para la formación de compuestos orgánicos
a partir de dióxido de carbono y agua. Los cloroplastos en plantas superiores
son cuerpos discoidales o elipsoidales que miden entre 2 µ y 10 µ de diámetro
y 1 µ de grosor (Gold, 1990). Una célula típica de hoja de espinaca contiene
entre 20 y 60 cloroplastos (Butterfass, 1979), cada uno de los cuales tiene un
volumen promedio de 34 µm3 y dimensiones de 5.5 x 2.1
(Menke,
m
1962).
Estar-r rodeados por dos membranas, cada una de aproximadamente 5 nm de
grosor; una membrana externa y una membrana interna; estas membranas estan
separadas por un espacio intermembrana de unos 10 nm (Alberts, 1990).
Los estudios de permeabilidad han demostrado que la membrana interna
regula el transporte de metabolitos, mientras que la membrana externa es
altamente permeable a muchas sustancias de bajo peso molecular (Heldt &
Sauer, 1971; Murakami et al., 1975; Douce & Joyard, 1979). Cuando son
examinadas con microscvpía electrónica por criofractura, la membrana interna
muestra mas partículas que la membrana externa (Sprey & Laetsch, 1976;
Simpson, 1978b; Cline et al., 1985), en cvncvrdancia con el mayor numero de
actividades enzimáticas y de transporte asociadas con aquella (Douce &
Joyard, 1979; Keegstra, 1986).
El estroma es el compartimento del cloroplasto comprendido entre la
membrana interna y la membrana tilacvide. Incluye las enzimas asociadas con
el ciclo de Calvin, particularmente ribulosa bifosfato carboxilaw’vxigenasa,
que contribuyen a la masa de componentes protéicvs, aunque también otras
2
enzimas están presentes (Robinson & Walker, 198 I ; J. W. Anderson, 198 1). El
estroma contiene multiples copias de DNA (aproximadamente 30 por
cloroplasto en muchos tipos de células de plantas superiores), 70s ribosomas,
mRNA’s y todos los otros elementos necesarios para la síntesis de proteínas
(Ellis,
1976). Granos de almidón y plastoglobulinas son otros de los
componentes estromales comunes (Coombs & Greenwood, 1976).
Las membranas conteniendo clorofila, responsables de las reacciones
dependientes de luz, son vesículas lamelares aplanadas (tifacsides) que suelen
ocupar una gran parte del volumen de los cloroplastos de organismos
eucarióticos. Las superficies exteriores de las membranas lamelares están a
menudo acomodadas muy de cerca a las superficies exteriores de las otras
lamelas dando lugar a un apilamiento de extensión variable llamado grana.
Todos los tilacoides del estroma y de grana dentro de un cloroplasto forman un
sistema de membrana continuo, el cual está organizado en una red altamente
compleja que encierra una cámara anastomosada, normalmente referida como
el lúmen ó espacio tilacoidal (ver dibujo 1).
DIBUJO 1. El cloroplasto contiene tres membranas distintas (la membrana externa,
la membrana interna y la membrana tilacoide) que define tres compartimentos internos
separados: el espacio intermembrana, el estroma y el espacio tilacoide. La membrana
tilacoide contiene todos los sistemas generadores de energía del cloroplasto.
3
La relación espacial precisa entre tilacoides de grana. y de estroma fue
establecida por medio de reconstrucciones de cloroplastos seccionados en serie
(Heslop-Harrison, 1963; Wehrmeyer, 1964 a, b; Paolillo, 1970; Thomson,
1974). Los modelos tridimensionales derivados de tales estudios describen
pilas de tilacoides de grana siendo intersectados en angula por tilacoides de
estroma paralelos, igualmente espaciados que giran hacia arriba y alrededor de
las pilas. En cada intersección entre un tilacoide de estroma y uno de grana, se
observa una región de membrana angosta parecida a un cuello que interconecta
los dos tipos de tilacoide. Muchos de estos rasgos pueden ser verificados en
micrografks de criofractura (Staehelin & Arntzen, 1986)
Los tilacoides contienen todos los elementos funcionales que son
necesarios para atrapar y transducir la energía de la Iuz en formas de energía
química. Estos incluyen complejos captadores de luz, dos tipos de centros de
reacción, diversos transportadores de electrones, un sistema para sintetizar
ATP, y enzimas para extraer electrones del agua. Los estudios bioquímicos y
estructurales han revelado que estos componentes están empaquetados en al
menos cinco tipos principales de complejos proteínicos intramembrana
discretos (Staehehn & Arntzen, 1986). Ver dibujo 2.
4
himen
msmbrãnás
filá.6õidss
2kt+
21
I
‘+.----II-i w&s--.“...-w.“..e.-----“.---c’
Wman
uOid Mb
LHC
mbvil
PSR-LH
\
I
cyt
flbr
PSI-LH
DIBIJJO 2. Organización de los componentes de la membrana del cloroplasto que
participan en las reacciones de acoplamiento electrónico del transporte de electrones
fotosintético. Flechas de&~:das, sólidas reacciones de transferencia de electrones; flechas
ubiertLis transiciones químicas; flecha ~WZSUS movimientos de protones; flechadiscontinuas rutas de reciclamiento para PQ. Participan tres complejos de proteína
estructuralmente distintos en la ruta de transporte de electrones lineal de agua a NADP: un
complejo PS II, el cual esta unido a un complejo de citocromos f/bg por un grupo de
moléculas de plastoquinona solubles en lípidos, y un complejo PS 1 que recibe los
electrones del complejo de citocromos vía plastocianina, una proteína soluble en agua.
También se indica un ciclo de transporte de electrones por quinonas, o ciclo Q, el cual
causa la translocacion de un protón adicional por cada dos electrones que pasan a través de
la cadena de transporte electrónico lineal. Los protones depositados dentro del lumen del
tilacoide salen a través del complejo CFo-CFl ATP sintetasa translocador de protones. Los
complejos de pigmento-proteína que recolectan luz (LHC) sirven a ambos fotosistemas;
estos se asocian preferencialmente ya sea con PS I ó PS II y son designados LHC i ó LHC 1I
respectivamente. Una población de LHC II es móvil y puede servir ya sea a PS I ó PS II
viajando lateralmente entre las lamelas estromales (enriquecidas con centros PS 1) y pilas
de grana (enriquecidas con PS II). (Staehelin & Arntzen, 1983).
El primer evento en la fotosíntesis es la captación de luz por alguno de
los pigmentos que forman el complejo captador de luz. La excitación
5
electrónica inducida por la luz es transmitida al centro de reacción,
probablemente constituido por un dímero de clorofila, resultando en una
oxidación al ser transferido
un
electrón a la quinona. El hueco que se genera es
llenado por el elesMm resultante de la oxidacibn del agua. (Staehelin &
Arntzen, 1986) Ver dibujo 3.
MOLECULAS RE
LUZ
N ELECTRDN D E
“PAR ESPECIAL” D
MOLECULAS OE CLOROFILA DEL
CENTRO DE REACCION
TRANSPQRT&NDQ
Ubi ELECTROH DE
“ALTA ENERCIA”
COMPLEJO
PROTEINA-PIGMENTO
DEL
CENTRO DE REACCION
DIBUJO 3. El noventa y cinco por ciento o más del total de pigmento del complejo
captador de luz funciona para cosechar la energía de la luz y transferirla al resto del
pigmento que está localizado en un componente del centro de reacción fotoquímico donde
ocurre el evento fotoquímico primario. La combinación del complejo captador de luz con
aquellos pigmentos del centro de reacción a los cuales alimentan con energía, es un
fotosistema.
Vistos como una enzima, los sustratos de un centro de reacción serían un donador
débil de electrones (molécula A: como el agua) y un aceptor débil de electrones (molécula
8: como la quinona), y sus productos serían un aceptor fuerte de electrones (molécula A
oxidada) y un donador fuerte de electrones (molécula B reducida: como la hidroquinona).
6
La transferencia de energía dentro de un fotosistema ocurre con una
eficiencia muy alta como resultado de que las moléculas de pigmento estan
apropiadamente orientadas y espaciadas entre 10 A a 70 A unas de otras, Esta
organizacion es lograda por la asociación no covalente (en general) de las
moléculas de pigmento con una variedad de proteínas específicas, Estos
complejos de proteína - pigmento están embebidos en la membrana
fotosintética o, por lo menos, están fuertemente asociados con la superficie de
membrana.
Los complejos productores d.e oxígeno, citocromo bg/f y ATPasa,
procesan los electrones y hoyos formados durante el evento primario en el
fdosistema para producir ATP y NADPH requerido para la fijación de dióxido
de carbono y otros procesos metabólicos (Staehelin & Arntzen, 1986).
El centro de reacción excitado dona un electrón a una molécula aceptora
cuya identidad química depende del fotosistema (para el PSII es la
plastoquinona y para el PSI es la ferredoxina). Aunque las reacciones
fotoquímicas en los dos centros de reac;cion del fotosistema son diferentes,
ambos fotosistemas causan transformaciones de la energía almacenada en los
electrones y núcleos reordenados de la clorofila “a” excitada por luz,
convírtíendo la energía de excitación en una molécula aceptora de electrones
reducida y una clorofila oxidada. La donación de los electrones de la clorofila
en el fdosistema II a la plastoquinona genera una asimetría de cargas a través
del dieléctrico de la membrana. Esta asimetría es conservada al oxidarse el
agua para reducir a la clorofila y producir iones hidrogeno, así la asimetría de
carga es convertida a un potencial electroquímico transmembrana de iones
hidrógeno. En una manera todavía no comprendida, esta diferencia de
potencial de ión hidrogeno es utilizada para llevar a cabo la reacciõn de
transferencia del grupo fosforil en la síntesis de ATP (Staehelin & Arntzen,
1986).
La formación de gradientes de potencial electroquímico a través de las
membranas implica el transporte de partículas cargadas; en cloroplastos los
protones son bombeados desde el estroma hacia el espacio tilacoideo, lo cual
determina sus propiedades osmóticas y conduce a procesos de hinchamiento ó
enjutamiento de cloroplastos y tilacoides (Hoppe et al., 1982).
Las mediciones de dispersión de luz han sido un medio conveniente de
medir la penetración unidireccional de sustancias a través de su cubierta
cuando ocurren cambios osmóticos en la talla de los mismos. Los estudios de
recaptura han demostrado efectivamente que la cubierta de cloroplastos
intactos es impermeable a sorbito1 (Heldt & Sauer, 1971). Sin embargo, el
término “impermeable” debe ser usado en un sentido restringido. Solamente
significa que la tasa de penetración es muy baja para ser medida dentro del
tiempo apropiado para experimentación con organelos frágiles tales como
cloroplastos. En soluciones de sorbito1 mayores a 0.1 M, el cloroplasto es un
osmómetro casi perfecto. En 0.16 M de sorbitol, los cloroplastos aislados son
esféricos (Heldt & Sauer, 1971); y un cloroplasto promedio, en estas
condiciones, ocupa un volumen de 50 Pm3 (Heber & Heldt, 1981).
Cuando se añaden gradualmente sales tales como KCl a cloroplastos
intactos, la dispersión de la luz se incrementa gradualmente (Heber & Purczeld,
1977) indicando que los cloroplastos responden osmométricamente a la
adición de sal. La recaptura está limitada por la permeabilidad de la cubierta
del cloroplasto a K+ (Heber & Purczeld, 1977). Cuando se añade valinomicina,
la cual incrementa específicamente la permeabilidad de la membrana al K+, se
observa un rápido hinchamiento del cloroplasto en la presencia de aniones tales
como cloruro, fluoruro, ioduro, bromuro, nitrato, nitrito.
8
Cuando se rompe la cubierta del cloroplasto, la penetración de aniones 6
ácidos a través de las membranas tilacoides dentro del espacio intratilacoidal
puede ser medido por dispersión de luz en un modo similar como con
cloroplastos intactos. Las tasas de hinchamiento de tilacoide inducidas por
valinomicina se esperarían mucho mas rápidas que aquellas de hinchamiento
de cloroplastos porque el área de la membrana tilacoide es mas grande por un
factor de 25 que el &-ea superficial de cloroplastos intactos. Sin embargo, el
hinchamiento de tifacoides bien preservados en la presencia de KCl, KBr o KI
y valinomicina es mucho mas lenta que la de cloroplastos intactos (Heber &
Heldt, 198 1), indicando que los coeficientes de permeabilidad de la cubierta
para halogenuros son mucho mas altos que para membranas tilacoides.
Las pocas mediciones de flujos pasivos de H+ indican que la
permeabilidad de la cubierta es mayor que la de la membrana tilacoide
(Gimmler et al, 1974).
Todas las propiedades físicas y químicas tienen una base estructural.
Así, una comprensión completa de las funciones de la membrana fotosintética
requiere un conocimiento detallado de la organización estructural de tales
membranas. Durante los últimos 25 años se ha hecho un progreso significativo
en el analisis de las reacciones fotoquímicas catalizadas por la clorofila, en la
identificación de las moléculas asociadas con estos procesos, y en la
elucidación del arreglo tridimensional de estas moléculas en las membranas
fotosintéticas.
Uno de los métodos más adecuados para estudiar la organización
supramolecular de las membranas tilacoides es la técnica de criofractura
(grabado). La principal ventaja de esta técnica es que provee imágenes de
réplicas de alta resolución de las superficies exoplásmica (SE) y protophísmica
(SP). La exoplásmica es la superficie en contacto con el estroma y la
9
protoplásmica con el lúmen. También ofrece una imagen fiel de las caras de
fractura. Las caras de fractura son producidas por división mecánica de las
bicapas de membrana congeladas (ver dibujo 4). Este tipo de fractura ocurre
porque las interacciones hidrofobicas que estabilizan a las membranas
biológicas son sensibles a la temperatura; a temperaturas menores o iguales a 100 O C son reducidas a tal grado que las interfaces hidrofóbicas representan
planos de debilidad.
DIBUJO 4. Las dos caras de fractura de membrana complementarias son
designadas CE ó Cara-E y CP 6 Cara-P. CE se refiere a la cara de fractura de la membrana
exoplásmica, CP a la cara de fractura de la membrana protoplásmica. Las superfkies de
membrana correspondientes son etiquetadas como SE y SP. Como los tilacoides del
estroma y de los grana dan lugar a diferentes tipos de Caras-E y P, se han usado subíndices
para designar si una cara de fractura dada ó área superficial corresponde a una región de
membrana apilada (a) o no apilada (n) (ej. CPa, CEn, etc.).
El examen cuidadoso de una rnicrografla típica de membrana tilacoide
fracturada por congelamiento revela que cada tipo de cara de fractura (CEa,
CEn, CPa, CPn) exhibe una poblacion distinta de partículas intramembrana,
consistente con el hecho de que el apilamiento de membrana produce una
diferenciación estructural y fwcional de las membranas tilacoides. Las
imágenes, a juzgar por la densidad y distribución en tallas de ‘tas partkulas
intramembrana, sugieren que cada tipo de complejo de proteína de membrana
10
funcional dá lugar a una partícula de una talla característica. Por esta razón,
una de las principales metas a largo plazo de estudios de criofractura de
membranas tilacoides ha sido la identificación positiva de diferentes categorías
de partículas intramembrana y el desarrollo de mapas supramoleculares de la
distribución de estos complejos funcionales en el plano de la membrana,
Ademas de proveer información sobre la distribucion espacial de los
componentes de la cadena de transporte electrónico, tales mapas podrían
proporcionar información directa sobre el número exacto de complejos
específicos en un ásea de membrana dada y sobre el espaciamiento entre estos
y otras unidades funcionales. Una vez que ha sido establecida una correlacion
entre un tipo específico de partícula y una unidad funcional específica, puede
ser posible estudiar cómo las perturbaciones en la organización de la
membrana afectan su función, y viceversa.
I ANTECEDENTES
Y JUSTIFICACION. I
El estudio del sistema fotosintético de las plantas se ha enfocado
principalmente a los aspectos químicos del proceso. Las corrientes acarreadas
por iones o por la separación de cargas durante la excitación electrónica
inducida por luz a través de las membranas cloroplásticas ha sido poco
estudiada. Los estudios de permeabilidad indican la presencia de selectividad
en las membranas. Además la expresión final de la absorción de luz es un
gradiente electroquímico a través de la membrana tilacoidea. Por lo anterior
resulta interesante estudiar las propiedades electrofisiológicas de la membrana
fotosintética tratando de establecer su correlación con el estímulo luminoso que
inicia el proceso fotosintético.
Muñiz et al. (1995) reportan el registro, en la membrana tilacoidea, de
corrientes iónicas inducidas por estímulos luminosos en el rango de 9 a 18 pA.
Esta corriente corresponde a la entrada de II+ desde el estroma hacia el espacio
tilacoideo. Los pulsos de luz largos (mayores a 8 mseg.) inducen una respuesta
con un curso temporal complejo; una fase inicial de gran amplitud seguida de
una fase de decaimiento y una inversión de la dirección de la corriente al
terminar el pulso de luz. La amplitud del componente inicial en una respuesta
está determinada por la duración del estímulo luminoso previo y el tiempo
transcurrido entre los estímulos.
Una de las preguntas que surgieron de las observaciones hechas en este
estudio y que fué uno de los objetivos del presente trabajo fué el de conocer el
área superficial de esta membrana para calcular la densidad de corriente y
compararla con los resultados de otros autores sobre la actividad de los
fotosistemas 1 y II y su densidad superficial. Además, esta caracterización de la
12
membrana tilacoidea facilitará en estudios posteriores el registro de canales
iánicos y fotocorrientes mediante el uso de La técnica de “patch clamp” para
entender mejor como se lleva a cabo el proceso fotosintéticoZ
Este trabajo pues, está orientado a desarrollar la técnica para obtener
vesículas de membrana tilacoide utilizables para estudios electrofisiológicos.
13
I OBJETIVO. 1
1. Determinar las condiciones osmóticas y los valores de pH en los
cuales se provoque la formación del mayor número de esferas de tilacoide con
los mayores diámetros a partir de cloroplastos aislados de hojas frescas de
Amuranthus hybridus.
14
MATERIAL Y METODOS.
Se utilizaron hojas de Amarunthus hybridus;
estas plantas fueron
cultivadas en palanganas utilizando tierra acondicionada con “Happy flower”
cuya fórmula consiste en: 1). abono natural (tabaco); 2). fertilizante
nitrogenado (26.5 % de nitrogeno); 3). vermiculita como acondicionador que
provoca la porosidad de la tierra permitiendo la oxigenación de las raíses y que
aumenta la capacidad retentiva del agua que se aplica, evitando riegos
fkesuentes que producen marchitamiento pudrision y lixiviasion.
Se midio la osmolaridad de las soluciones extraídas de hojas frescas sin
nervaduras. Para esto, las hojas se cosecharon a las 8:30, 12:OO y 20:00 horas,
Algunas hojas fueron envueltas, en la misma planta, con papel aluminio a las
8:30 para impedir su iluminación; estas hojas se cosecharon a las 12:OO hrs. y
sus osmolaridades se compararon con las hojas iluminadas.
En las tablas 1, 2 y 3 se presenta la composición químka de las ocho
soluciones utilizadas para aislar cloroplastos de hojas de Amarmthus hybridzo,
en donde: mOsm = miliosmolar y mM = milimolar. La osmolaridad de las
soluciones aisladoras (S.A.) fué verificada en un osmómetro de presión de
vapor 5500 “Wescor” presentando una variación de f 10 %. Se utilizó Trizma
para ajustar el pH de las ocho soluciones a tres valores: 5.0, 7.2 y 8.0 (24
soluciones diferentes).
1.
Las hojas, con edades comprendidas entre los 10 y 30 días de nacida,
fueron colectadas entre 8:30 y 9:00 A.M. y se conservaron a 4 “C para reducir
Ia presencia de almidones.
Las nervaduras fueron separadas y el resto de la hoja, inmersa en la
solución aisladora, se corto en pequeños fragmentos con una navaja delgada de
acero inoxidable; con este procedimiento rompemos Zas células y los
cloroplastos son liberados a la solución aisladora. Se colocó una alícuota de la
preparacion en la cámara experimental de teflón can fondo de cristal. Las
observaciones se iniciaron 30 minutos después con el propósito de permitir el
depósito de los cloroplastos en el fondo de la cámara y la manifestación del
choque osmótico. El choque osmótico permitió el aumento en talla de los
cloroplastos hasta la ruptura de la envoltura externa y el hinchamiento de la
membrana tilacoide para dar lugar a la formación de vesículas de tilacoide
(blebs),
El orígen tilacoide del bleb se estableció realizando observaciones
directas del hinchamiento de un cloroplasto en solución hipotónica hasta su
ruptura y el surgimiento del tilacoide hinchado para formar vesículas de
membrana esférica fblebs). Cabe señalar que es muy dificil separar fisicamente
la membrana interna de la membrana externa del cloroplasto (Douce & Joyard,
1979); esto se debe a la presencia de partículas vinculadoras, “linkers”, entre
las dos membranas. Esta información apoya la idea que los blebs observados al
microscopio se trataban realmente de membranas tilacoideas hinchadas y no de
la membrana interna del cloroplasto.
Las observaciones se realizaron en un microscopio Nikon DIAPHOTTMD. Se midieron los diámetros de 100 cloroplastos y 100 blebs para cada una
de las 24 soluciones con un escalímetro (LEITZ WTZLAR) incluído en uno
de los oculares del microscopio; el rango de incertidumbre de éste fué de f 1.2
micras. Las mediciones se realizaron en los tres diferentes valores de pH de
cada una de las soluciones aisladoras, La búsqueda de 100 eventos tanto para
cloroplastos como para blebs se realizó en una misma preparación “barriendo”,
de ser necesario, todo el campo visual en el microscopio. Las observaciones se
sometieron a tres tipos de análisis estadístico realizados en la hoja de cálculo de
EXCEL 4.0:
a). Análisis de Varianza (ANOVA) de un factor.
b). Análisis de Varianza de Dos Factores sin Replicación.
c). Prueba t de Student: Dos Muestras Pareadas para
Promedios.
- Los detalles del método analítico se describen en el apéndice.
- Todas las comparaciones estadísticas se realizaron con una prueba
unidireccional ó de una cola (excepto “ANOVA:
Dos Factores sin
Replicación”: prueba bidireccional ó de dos colas) con un nivel de confianza de
99 %.
17
Osmoiaridad
en Hojas de Amaran~hs hybridm
En la tabla 4 se muestran las osmolaridades encontradas en las
soluciones extraídas de una cantidad de hojas similares (10 hojas) de
Amarmthus
hybriu’zrs
en tres horas diferentes del dia; “n” indica el número de
mediciones y es el valor que se encuentra a la derecha del valor de osmolaridad
promedio. Esto se realiz(, con el fin de verif’icar el rango de variación funcional
de la osmolaridad de la solucir)n donde se encuentran inmersos los cloroplastos
y apoyar la idea de utilizar una solución aisladora “normal” 250 mOsm. La
tabla 5 muestra las osmolaridades encontradas a las 12 del día en hojas de
Amaronthus hybridus en presencia y ausencia de luz. Las hojas sin luz se
cubrieron ea la misma planta con papel aluminio a las 8:30 y fueron
cosechadas a las 12:00 hrs.
4.
DIFERENTES
PROMEDIO
12:oo
486
n=5
1.8
358
ll=5
0.7
P.M.
8:00
P.M.
5.
KmA
DEL
DIA
8:30
A.M.
CON
LUZ
1290
P.M.
SlN
OSMOLARIDAD
PROMEDIO
(mOsm)
ERROR
ESTANDAR
399
n=5
1.0
380
ll=5
0.6
602
n=4
2.2
DIFERENTES
ENTRE SI *
LUZ
12:oo
P.M.
CON
ls.Jz
* Los espacios en blanco relacionan las concentraciones promedio que
son signiíkativamente
diferentes entre sí.
Diámetros Promedio Controhndo pH y Concentración.
En las tablas 6, 7 y 8 se muestran los promedios de los tamaños de
cloroplastos y blebs obtenidos en cada solución. “DS” significa desviación
stándard y es el valor que se encuentra en letra más oscura a la derecha del
diámetro promedio.
19
6.
pH =5.0
I
CLOROPLASTOS:
D~R/~I%TR(-~S
CONCENTRA
PROMEDIO
CION (mOsm)
(micras) Y
1000
500
250
120
60
30
10
5
“DS”
7.2 1.3
9.1 1.2
9.3 1.1
9.8 1.1
9.8 1.0
8.9 1.3
9.0 1.3
8.4 1.5
EvENTOS
OBSERVA
DOS
100
100
100
100
100
100
100
100
1
BLEBS:
DiAMETROS
PROMEDIO
(micras) Y
“DS”
12.0 1.5
10.5 2.1
12.2 1.5
12.2 1.5
12.7 1.4
12.4 1.6
12.5 1.7
11.9 1.9
I
EVEN-TOS
OBSERVA
DOS
66
27
i
100
100
---EE-i
7.
PI-I =7.2
CONCENTRA
CION (mOsm)
1000
500
250
120
60
30
10
5
BLEBS:
CLOROPLASTOS:
DIAMETROS EVENTOS DIAMETROS EVENTOS
PROMEDIO OBSERVA PROMEDIO OBSERVA
(micras) Y
DOS
(micras) Y
DOS
“DS”
“DS”
7.8
1,7
100
12.3 3.1
34
8.0 1.2
100
12.5 2.5
60
8.1 1.0
100
13.7 2.1
58
12.0 1.4
100
15.3 2.0
100
12.8 1.9
100
17.1 3.0
100
8.0 1.5
3
18.4
1.8
100
ll.2 1.1
3
18.5 2.1
100
6.2 1.3
6
12.7 2.2
17
I
8.
I
DIAMETROS EVENTOS DIAMETROS EVENTOS
BROMEBIO O B S E R V A P R O M E D I O O B S E R V A
(micras) Y
DOS
(mieras) Y
DOS
?IgJS”
VS”
100
9.6 ll.5
5
5.0 0.8
1000
SO0
250
120
60
30
10
5
BLEBS:
CLOROPLASTOS:
--._-- - ~. .- ~-.
CONCENTRA
CION (mOsm)
I
SS 0.8
6.5 0.7
10.4 1.3
6.9 1.1
13.2 1.0
10.4 3.0
0
,, 0
100
100
100
62
3
3
0
11.2
11.9
13.1
13.0
9.9
10.5
10.2
2.0
í.7
1.5
2.0
1.4
í.8
2.0
36
100
100
100
100
100
46
Comparación Estadística del pH y la Concentración.
Se utilizó la herramienta estadística “ANOVA” (análisis de varianza)
para indagar si los diámetros promedio (variable dependiente) de los blebs
observados eran significativamente diferentes entre cada concentración y entre
cada valor de pH (variables independientes), donde: SC = suma de cuadrados
de los diáunetros individuales de los blebs; gl = grados de libertad; CM =
cuadrado medio (SC/gl); F = valor de F calculado; P-valor = probabilidad de
rechazar erróneamente la hipí>tesis nula: “la media es igual en todas las
soluciones” cuando en realidad es verdadera; F crit. = valor de F esperado de
tablas (gl de variable independiente VS. gl del error). Ver tabla 9.
21
9.
FCENEDE
VAR/AC/UN
Anova: Dos Factores
Sid Repheión
SC
Hileras (pH)
Il 478.2
Columnas
41688.65
[cãncentracih)
Error
39786.73
TC&?!1
92953.58
T
299 t38.38864t2.019453t8.17E-19t
1.217348 t
7 15955.521 j 313.293 / 0 12.647838 /
2093 19.00943
2399
Conclusión: como el valor de F calculado es mayor que el valor de F
esperado de tablas tanto para hileras como para columnas entonces se rechaza
la hipotesis nula: “Todas las medias son iguales” y se acepta la hipótesis
alterna: “No todas las medias son iguales”.
Para determinar de una manera mas específica si Ios dirúnetros promedio
de los blebs eran significativamente diferentes entre las distintas soluciones
para cada valor de pH, se realizaron las siguientes pruebas estadísticas: (ver
tablas 10, ll, 12).
10.
pH = 5.0
Factor
7
Entre
Grupos
bntra del 1782.562 1 668
t1 IL45628
L.--
2.668506
6.16685
22
ll.
1pH = 7.2
Anova: Un
Factor
Fuenfed~
V~H~Cc/an
SC
Entre
3037.309
Grupus
Dentro de 3105.106
Grupos
TChl
6192.415
g/
7
GW
F
/%fLiYiur
FCfl/
441 ll442 79.68353 5.31 E-80 2.671214
561
5.534948
568,.. .~
i
12.
] pH = 8.0
Anova: Un
Factor
Fr/e/e
de
SC
g/
CM
F
Fc,? j
Conclusión: para los tres casos el valor de F caIcuIado es mayor que el
valor de F esperado de tablas, por lo tanto se rechaza la hipótesis nula: “Todas
las medias son iguales” y se acepta la hipótesis alterna: “No todas Ias medias
son iguales”.
23
Diferencias en Talla entre CloropIastos y BIebs.
En las tablas 13, 14 y 15 se muestran las diferencias en diámetro que
para los distintos valores de pH existen entre cloroplastos en solución aisladora
normal (250 mOsm), y blebs en el rango de soluciones aisladoras en que
alcanzaron los diámetros mátximos (véanse tablas 6,7 y 8)
13.
pH = 5.0
CLOROPLASTOS
BLEBS
OSMOLARID.4D
(mOsm)
250
250 a 10
DIAMETROS
PROMEDIO AIJMENTO
(micras)
(%)”
9.3
35
12.4
4.
pH = 7.2
CLOROPLASTOS
BLEBS
DIAMETROS
OSMOLARIDAD PROMEDIO AUMENTO
(mOsm)
(micras)
(%)*
250
8.1
30 a 10
18.5
130
15.
pH = 8.0
CLOROPLASTOS
BL.E.BS
DIAMETROS
OSMOLARIDAD PROMEDIO AUMENTÓ
(mOsm)
(micras)
% *
6.5
250
120 a 60
* Los valores indican la talla de blebs respecto al de cloroplastos
expresado en porcentaje.
24
Comprobación Estadística de Diferencias en Taila de los Cloroplastos y
Ios BIebs en las Condiciones de pH y Osmolaridad Utilizadas.
- En Ia tabla 16 se muestran las diferencias en dihmetro de cloroplastos a
diferentes osmdaridades, para cada valor de pH.
16.
25
- En la tabla 17 se muestran las diferencias en diámetro de blebs a
diferentes osmolaridades, para cada valor de pH.
17.
* Sólo se incluyen las osmolaridades en las que se pudieron obtener un
total de 100 eventos (cloroplastos y blebs) para efectos de aplicación de la
prueba estadística correspondiente.
** Los números iguales relacionan los promedios de diámetro que no
son signifícativamente diferentes entre sí. Los diámetros promedio sin número
son significativamente diferentes con los demás.
26
- En las tablas 18 y 19 se muestran las diferencias en diámetro de los
cloroplastas y los blebs para los distintos valores de pH, en la asmalaridad
normal y aquellas en las que alcanzaron sus dihrnetros máximos
respectivamente.
18.
PH
5.0
7.2
8.0
CLOROPLASTOS
OSMOLARIDAD
DL4METROS DIFERENTES
PROMEDIO
ENTRE Sl
(mOsm) *
**
(micras)
250
9.3
250
8.1
250
6.5
k
19.
* La osmolaridad para cloroplastos corresponde a la solución aisladora
normal; la osmolaridad para biebs corresponde a aquellas donde se alcanzaron
los diámetros máximos.
** Los espacios en blanco relacionan los promedios de diámetro que son
significativamente diferentes entre sí.
27
- En las tablas 20, 21 y 22 se muestran las diferencias en diámetro entre
cloroplastos en solución aisladora normal y blebs en soluciones aisladoras
donde alcanzaron los diámetros máximos, a un pH dado.
20.
pH = 50
CLOROPLASTOS
BLEBS
OSMOLARIDAD DIAMETROS DIFERENTES
(mOsm)
PROMEDIO
ENTRE SI *
(mic ras)
250
9.2
250 a 10
12.4
21.
pH = 7.2
CLOROPLASTOS
BLEBS
OSMOLARIDAD DJAMETROS DIFERENTES
(mOsm)
PROMEDIO
ENTRE SI *
(micras)
250
8.0
30a 10
18.5
22.
OSMOLARIDAD DIAMETROS DIFERENTES
pH = 8.0
ENTRE SI *
(mOsm)
PROMEDIO
(micras)
CLOROPLASTOS
250
6.5
120 a 60
13.1
1 BLEBS
I
I
I
1
28
- En las tablas 23,24 y 25 se muestran las diferencias en diámetro entre
cloroplastos y blebs en solución aisladora normal, a un pH dado.
23.
pH = 5.0
CLOROPLASTOS
BLEBS
1OSMOLARJDAD
(mOsm)
250
250
1 DIAMETROS 1 DIFERENTES 1
PROMEDIO
ENTRE SI *
(micras)
9.3
12.2
24.
pH = 8.0
CLOROPLASTOS
BLEBS
OSMOLARIDAD DIAMETROS DIFERENTES
(mOsm)
PROMEDIO
ENTBE SI *
(micras)
250
6.5
250
ll.9
* Los espacios en blanco relacionan los diámetros promedio que son
significativamente diferentes entre sí.
** Para el pH de 7.2 se utilizó Ia concentración de 120 mOsm debido a
la falta de observaciones de blebs en la concentración de 250 mOsm.
29
Se utilizó el osmómetro para hacer el analisis de la osmolaridad de las
hojas LI diferentes horas del día, observándose un rango de variación que oscila
entre los 300 y 600 mOsm; estas concentraciones al parecer son menores
durante la noche y en las primeras horas del día, y aumentan a las 1200 del
día. En estos cambios de la osmolaridad podría estar involucrado el
movimiento estomático de las hojas el cual se ve afectado por tres factores
principalmente: el agua, el dióxido de carbono y la luz.
Agua: las plantas pueden detectar una reducción de agua y operar un
mecanismo o movimiento específico que cierre los estomas. Uno de tales
mecanismos de control hidroactivo está bajo la influencia de la hormona ácido
abscísico (ABA), cuya secuencia de control es la siguiente: cuando existe agua
en abundancia no se forma ABA y los estomas están abiertos; cuando se
produce una ligera reducción del agua, se forma una pequeña cantidad de ABA
y los estomas se cierran ligeramente. Al mismo tiempo la acción del ABA hace
a los estomas mucho más sensibles a las necesidades del 602, así que la
fotosíntesis no es obstaculizada. Al producirse un severo deficit de agua (si
bien todavía inferior al potencial hídrico foliar crítico) se forman grandes
cantidades de ABA y los estomas se cierran.
El CO2 tiene un marcado efecto sobre los estomas. Las bajas
concentraciones de CO2 promueven la apertura estomática, y las altas causan
el cierre rápido a la luz o a la oscuridad. Sin embargo, la exposición a la luz
bajo condiciones de alta concentración de CO2 pronto causará la apertura,
porque el CO2 del interior de la hoja es consumido en la fotosíntesis. Por lo
tanto existen mecanismos de control que evitan ía inhibición de la tasa
fotosintética, mientras el agua no sea hrnitante, pero los cierran con el fin de
impedir la innecesaria pérdida de agua cuando la fotosíntesis no puede operar
debido a la ausencia de luz.
Un fuerte factor de control es la luz. Los estomas normalmente se abren
a la luz y se cierran en la oscuridad. El efecto luminoso sobre los estomas
podría ser una consecuencia de la fotosíntesis que ocurre en las células
oclusivas (las cuales, a diferencia de otras células epidérmicas, poseen
cloroplastos). Esto afecta la apertura estomatica de tres maneras. Primero, la
fotosíntesis reduce la concentración de COzi que es un poderoso estímulo para
la apertura de los estomas. Segundo, las sustancias osmóticamente activas
como los azúcares son producidas en la fotosíntesis, lo cual coadyuva a abatir
el potencial hídrico de las células oclusivas. Tercero, la fotofosforilación podría
suministrar el ATP necesario para conducir los bombeos transportadores de
iones que movilizan el K+ u otras sustancias al interior de las células oclusivas.
(Bidwell, 1979).
Además, el incremento en la osmolaridad implica la presencia de
partículas osmóticamente activas que podrían formarse por el proceso de la
fotosíntesis. La disminución del CO2 durante la fotosíntesis es un estímulo
para la apertura estomática en presenci.a de luz; por otra parte, en nuestras
condiciones (la planta en suelos húmedos) la producción de ABA sería nula o
bien se formaría una pequeña cantidad cerrando ligeramente los estomas pero
haciéndolos mucho más sensibles a las necesidades del COZ. Por tal motivo, la
respuesta estomática primaria dedido a la falta de agua, es decir el cierre de
31
estomas pasaría a un nivel de importancia mínimo, mientras que una respuesta
estomática secundaria en base a la concentración del CO2 y presencia de luz
pasaría a un primer nivel de importancia, manteniendo cierta apertura
estomática que favorecería el incremento de osmolaridad como consecuencia
de la fotosíntesis y que se observó en las hojas cosechadas al mediodía (1290
l-m.).
La tabla 5 de resultados nos muestra que mientras la osmolaridad de las
hojas aumenta conforme avanza el día, en presencia de luz, no ocurre en
ausencia de luz. Las diferencias son estadísticamente significativas con luz y
sin luz. Esto nos sugiere que estos incrementos de osmolaridad se deben a la
actividad fotosintética de la hoja en presencia de luz más que a una
transpiración excesiva.
Como ya se mencionó anteriormente, las hojas utilizadas para la
obtención de cloroplastos y medición de diametros fueron colectadas por la
mañana (entre 8:30 y 900 A.M.). De acuerdo con esto y tomando en cuenta los
valores de osmolaridad de las tablas 4 y 5 a esa misma hora se sugirió tomar el
valor de 250 mOsm como “normal” para hacer las comparaciones
correspondientes. Además de acuerdo con los resultados mostrados en la tabla
16, no existen diferencias estadísticas significativas en los diámetros de
cloroplastos entre 2.50 y 500 mOsm a pH de 5.0 y 7.2.
Las mediciones de la distribución de tallas de cloroplastos y blebs
aislados de Amaranthus hybridus que se reportan en las tablas 6, 7 y 8 de
resultados muestran que cambian con las condiciones de osmolaridad donde
están inmersas.
La aplicación de la prueba estadística “ANOVA:
DOS FACTORES” en
la tabla 9 de resultados permitió estimar los efectos directos de la osmolaridad
y el pH, sobre una población de diámetros de blebs. Dentro de este analisis, las
comparaciones hechas entre los distintos valores de pH resultaron en una “F”
calculada mayor que la “F” crítica de tablas. De igual manera, las
comparaciones hechas entre las distintas osmolaridades resultaron en una “F”
calculada mayor que la “F” de tablas; por lo tanto, nuestra hipótesis nula: “La
media es igual en cada uno de los niveles del factor” se rechaza, y se acepta la
hipótesis altema:“No todas las medias son iguales”. Por otra parte, la diferencia
que se observa entre la “F” calculada y la “F” de tablas para la osmolaridad es
mayor que para el pH, lo cual nos indica que la osmolaridad tiene una mayor
influencia sobre las tallas de los blebs que el pH.
La prueba de “ANOVA: UN FACTOR” de las tablas íO, ll y 12 de
resultados se aplicó para evaluar bajo qué condiciones de pH las diferencias
entre las osmolaridades son significativamente mayores. De acuerdo con esto,
se observó que la diferencia entre la “F” calculada y la “F” de tablas fué mayor
a un pH de 7.2, siguiéndole en segundo lugar el pH de 8.0 y por último el pH
de 5.0 (ver figura 1).
33
BLEBS:
RELACION p H - C O N C E N T R A C I O N
DIAMETRO
(micras)
FIGURA 1
Antes de probar que las observaciones de diámetros hechas en una
muestra de cIoroplastos están de alguna manera correlacionadas con las
observaciones hechas en una muestra de blebs (tablas 13, 14 y 15 de
resultados), se utilizó la “PRUEBA t DE STUDENT: DOS MUESTRAS
PAREADAS PARA PROMEDIOS” (tablas 16 - 25 de resultados) para evaluar
las diferencias estadisticas entre:
aj cada una de las ocho osmolaridades probadas, a un pH dado (tablas
16 y 17).
bj cada uno de los valores de pH, a una osmolarídad dada (tablas 18 y
19).
cj cloroplastos en solución aisladora normal y blebs en soluciones
donde alcanzaron los diámetros máximos, a un pH dado (tablas 20,
21 y 22).
- Para todos los casos las diferencias fueron significativas.
34
De acuerdo con esto y utilizando la misma prueba estadística, se
encontró que el diámetro promedio de las observaciones hechas en cloropIastos
a una osmolaridad de 250 mOsm es significativamente diferente del diámetro
promedio máximo alcanzado por los blebs en cada uno de los valores de pki
probadas. Por lo tanto el cambio en diáînetro de blebs respecto aJ de
cloroplastos a un pH de 7.2 fue del 130 %; del 100 % a un pH de 8.0 y de un
35 % a un pH de 5.0 (ver @ura 2).
REtACtON CtOROPtASfOS
l
250
- B~EBS
CONCENTRACION [mOsm)
FIGUFtA 2
También se encontraron diferencias significativas entre los diarnetros
promedio de los cloroplastos así como entre los diámetros promedio de blebs.
Así mismo se wmprobo que existen diferencias significativas entre el
diámetro promedio de cloroplastos y el de blebs a una misma osmolaridad
(tablas 24, 25 y 26); esto confirma que en realidad estábamos observando dos
eventos diferentes (cloroplastos y blebs).
1. De los dos factores involucrados en el hinchamiento de tilacoides para
estos experimentos, la osmolaridad de la solución aisladora fué dominante
sobre el pH.
2. Ei valor óptimo de pH para obtener los mayores diámetros de biebs
fué de 7.2.
3. Las mejores osmoiaridades utilizadas a pH 7.2 para inducir la
formación de blebs fwron: 30 y 10 mOsm.
4. Ei aumento en taiia de blebs respecto al de cloroplastos fué del 13G%
a un pH de 7.2.
ANO-VA UN FACTOR:
Suma de Cuadrados Total:
SCqQ=;E;r,(Y,-Y)Z
SCE=C( Yij’Yj) ’
Suma de Cuadrados Dentro de Grupos:
Suma de Cuadrados Entre Grupos:
Grados de libertad:
Total=n-- 1
Dentro de GrupOS = nT - C
Entre grupos = c - 1
Cuadrado Medio Dentro de Grupos:
CME = -%&
nT - c
Cuadrado Medio Entre Grupos:
CM,, = S c ,
c-l
Valor de “F” Calculada:
pd-ZMTR
CME
Valor de Probabilidad:
t = &L$ = El resultado se busca en
tablas percentiles con
S~W
nT = c grados de libertad.
s2(x]=cM, + L-p.
n
Valor de “F” Crítica:
n
37
ANOVA DOS FACTORES
sc&* =
Suma de Cuadrados Total:
i=li j=lIr.(Xij-x>z
Suma de Cuadrados de Hileras: SCH= c [ii ( Xi - X ) 2 ]
Suma de Cuadrados de Columnas:
Grados de Libertad:
SC,=rL)I(X,-X)21
Total=n,- 1
Error=(r- l)(c- 1)
Columnas = c - 1
Cuadrado Medio del Error:
CME =
Cuadrado Medio de Hileras:
CMH = 2q.g
(r-l)
Hileras = r - 1
Sc,
(r-1) (c-l)
Cuadrado Medio de Cohmnas: CMc = .&
(c-l)
Valor de “F” Calculada: Hileras:FfT = aI, Columnas: F = .ac
CME
CME
38
Valor de Probabilidad:
tC = “1L~2 = El resultado se busca en
tablas percentiles con (cr l)(r- 1)
9 xi
grados de libertad.
G(X)= CME + CM,
n
n
h = -‘/ Fcalculada
Valor de “F” Crítica:
F crit.
=
= El resultado se busca
en tablas percentiíes con
(c-l ) (r- 1) grados de libertad.
(c- 1) 6 (r- 1)
(c-l)(r-1)
39
PRITEBA t DE STUDENT:
DOS MUESTRAS PAREADAS PARA
PROMEDIOS
Media:
X=clx.,)
n
Varianza:
Coeficiente de Pearsons:
r=
z (Xi - X) (,Y; - Y)
d[ c (X; - X)2 ] [ 2 (Y; - w2 1
= c (X; - X) (Yi - r
n-l
Varianza Combinada:
s2c
Grados de Libertad:
n-f
Valor de “t” Calculado:
t= -----d
S&i-
d z ----------n
= El resultado se busca en
tablas percentiles con (n - 1)
grados de libertad.
LITERATURA CITADA.
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