Identificación global de genes de frutos cítricos relacionados con la

Identificación global de genes de frutos cítricos relacionados con la
infección postcosecha por Penicillium digitatum. Implicación del etileno.
S. Alamar, J. Gadea, J. Forment, L. Zacarías, L. González-Candelas, y J. F. Marcos
Departamento de Ciencia de los Alimentos. Instituto de Agroquímica y Tecnología de
Alimentos (IATA) – CSIC. Burjassot, España
Palabras clave: Expresión génica, micromatrices, Clemenules, Penicillium, etileno.
Resumen
La infección por Penicillium digitatum ocasiona pérdidas importantes durante
el almacenamiento postcosecha de frutos cítricos. Dentro del proyecto español de
genómica funcional de cítricos (CFGP, http://citrusgenomics.ibmcp-ivia.upv.es) se
ha diseñado una micromatriz que contiene clones de cDNA pertenecientes a 6.875
genes distintos del genoma de cítricos. Esta herramienta se está utilizando para el
análisis de los cambios de expresión génica a escala genómica, en distintas situaciones de interés agronómico. La hibridación y análisis de dicha micromatriz con muestras de frutos de mandarina control, frutos tratados con etileno, frutos heridos o
frutos heridos e infectados por Penicillium digitatum ha permitido la identificación
de grupos de genes con expresión diferencial en los distintos procesos estudiados. La
anotación funcional global de los resultados muestra la relevancia del metabolismo
secundario en la respuesta a la infección. Además, se ha analizado mediante hibridación Northern la expresión de determinados genes, confirmando sus cambios de
expresión. Los resultados sugieren los mecanismos fisiológicos y moleculares de
respuesta del fruto cítrico a la infección por P. digitatum, y confirman que el etileno
está actuando como mediador de la expresión de genes implicados en este proceso.
INTRODUCCIÓN
La infección por hongos provoca pérdidas importantes durante la postcosecha de
frutos cítricos, siendo la podredumbre verde causada por Penicillium digitatum la
principal alteración patológica. A pesar de su importancia agroalimentaria, hay pocos
estudios sobre la respuesta a nivel molecular de los frutos cítricos a la infección, y éstos
se limitan fundamentalmente al análisis de la expresión de determinados genes implicados
en patogénesis en otros vegetales. La infección de frutos cítricos por P. digitatum
conlleva la producción de grandes cantidades de etileno, habiéndose demostrado la
implicación de esta hormona en la defensa del fruto frente a la infección (Marcos et al.,
2005).
El proyecto de genómica funcional de cítricos (CFGP) ha generado una
micromatriz con 6.875 genes distintos procedentes de 25 colecciones de cDNAs
obtenidas a partir de distintos tejidos, en diferentes estadios fisiológicos, y en respuesta a
diferentes tipos de estrés (Forment et al., 2005). Dentro del CFGP, el objetivo de este
trabajo ha sido estudiar los cambios globales de transcripción génica implicados en las
respuestas de defensa del fruto cítrico al proceso de infección con P. digitatum y el
estudio de la implicación del etileno como mediador en estos cambios de expresión,
mediante el uso de la micromatriz de cDNA.
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MATERIALES Y MÉTODOS.
Se usaron frutos maduros de clementina de Nules (Citrus clementina). Se
compararon cuatro tipos de tratamientos: (i) Frutos sometidos a tratamiento con etileno
(10 ppm) durante 16 horas, en ausencia de infección (condición E), (ii) frutos heridos y
procesados a las 24 horas (W), (iii) frutos heridos e inoculados con P. digitatum (106
conidios/mL) y procesados a las 24 horas (I), y (iv) frutos control mantenidos 24 horas en
las mismas condiciones de conservación postcosecha (C). Para el estudio de la producción
de etileno y los análisis Northern de expresión se analizaron además muestras a las 8, 16,
y 48 horas de los tratamientos C, W e I. Se realizaron tres réplicas biológicas durante dos
campañas de recolección de fruta.
En las hibridaciones de micromatrices se realizaron dos réplicas técnicas de cada
una de las tres réplicas biológicas, para las condiciones C, E, W e I. Las hibridaciones se
hicieron a partir de muestras de cDNA obtenidas de RNA total de la muestra problema, y
frente a una muestra de referencia obtenida por mezcla de todas las muestras usadas en el
experimento. Los cDNAs se marcaron con los fluoróforos Cy5 (muestra) y Cy3
(referencia). Las imágenes de hibridación se capturaron y cuantificaron con el programa
GenePix Pro 6.0. El análisis estadístico de las diferencias de expresión y su anotación
funcional se realizó mediante los paquetes informáticos TM4 (http://www.tm4.org) y
GEPAS (http://gepas.bioinfo.cipf.es). Las hibridaciones Northern se realizaron mediante
protocolos estándar.
RESULTADOS Y DISCUSIÓN.
Regulación diferencial de la producción de etileno.
En plantas superiores, los dos pasos finales de la biosíntesis de etileno están
catalizados por la ACC sintasa (ACS) y ACC oxidasa (ACO), codificadas por complejas
familias multigénicas. Se midió la producción de etileno de frutos control, frutos heridos
y frutos infectados a las 0, 8, 16, 24 y 48 horas y se analizó en paralelo la expresión de los
genes ACO, ACS1 y ACS2 en los mismos frutos (Fig. 1). Los resultados mostraron que la
producción de etileno en frutos infectados aumenta considerablemente a partir de las 24
horas (cuando la infección todavía no es visible), y que esta producción se correlaciona
con la expresión de ACS1, a las 16 horas primero, y ACS2 y ACO, más tardíamente. El
pico de expresión temprana de ACS2 (8 horas) parece estar relacionado con un mínimo
aumento transitorio de la biosíntesis de etileno que también se observa en frutos heridos
pero no infectados.
Hibridaciones de micromatrices.
Se realizaron un total de 24 hibridaciones (3 réplicas biológicas con 2 réplicas
técnicas de cada tratamiento). El análisis de las señales de hibridación confirmó la
existencia de grupos de unigenes con expresión diferencial, inducidos o reprimidos, en
cada una de las condiciones estudiadas (Fig. 2). Se encontraron 302 genes inducidos
durante la infección (4.3% del total de analizados), de los que 103 se inducen además por
la aplicación de etileno. También se encontró un número significativo de genes con
expresión diferencial específica en alguno de los tratamientos. El patrón más común es el
de genes que se inducen por herida, y en mayor medida por infección (Fig. 3, DAHP, un
gen clave de la ruta de biosíntesis de aminoácidos aromáticos). En muchos casos, esta
inducción durante la infección estaría mediada por etileno (Fig. 3, ACT, una acetil
transferasa cuya sonda hibrida con 2-3 mRNAs que, además, tienen respuestas
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diferenciales). Algunos muestran un perfil de expresión particularmente interesante, como
es el caso de la β-caroteno hidroxilasa (BCH) de la ruta de biosíntesis de carotenoides que
se reprime durante la infección (Fig.3). Sin embargo, la biosíntesis de carotenoides se
induce por aplicación exógena de etileno. Estos ejemplos, y su comparación con ACO,
ACS1 y ACS2 (Fig. 2) son una pequeña muestra que ilustra la existencia de distintos
patrones temporales de expresión, y de una regulación compleja en respuesta a la
infección que en algunos casos estaría mediada al menos parcialmente por etileno.
Anotación funcional de los cambios de expresión génica a escala genómica.
Mediante el uso de herramientas informáticas de anotación funcional de los
resultados de hibridación de micromatrices (FatiGO, http://gepas.bioinfo.cipf.es), se han
encontrado ontologías génicas (GO) que se encuentran significativamente sobre- o infrarepresentadas en los grupos de genes diferenciales. Como ejemplo, se muestra el
resultado resumido del análisis de los términos GO de proceso biológico en los genes
inducidos por la infección (Tabla 1). Los resultados indican una implicación de rutas de
metabolismo secundario, metabolismo de aminoácidos aromáticos y metabolismo de la
metionina en la respuesta a la infección.
Agradecimientos
Estas investigaciones han sido financiadas por los proyectos GEN2001-4885-C05,
AGL2000-1443 del Ministerio de Educación y Ciencia, y por ayudas de la Consellería de
Agricultura, Pesca y Alimentación de la Generalitat Valenciana.
Bibliografía
Forment, J., Gadea, J., Huerta, L., Abizanda, L., Agusti, J., Alamar, S. et al. 2005.
Development of a citrus genome-wide EST collection and cDNA microarray as
resources for genomic studies. Plant Mol. Biol. 57: 375-391.
Marcos, J.F., González-Candelas, L. and Zacarías, L. 2005. Involvement of ethylene
biosynthesis and perception in the susceptibility of citrus fruits to Penicillium
digitatum infection and the accumulation of defence-related mRNAs. J. Exp. Bot.
56: 2183-2193.
Figura 1. (A) Evolución temporal de la producción de etileno en frutos cítricos control,
heridos o infectados por P. digitatum, y (B) su correlación con la expresión de los tres
últimos genes de su biosíntesis: ACO, ACS1 y ACS2.
C2H4 (nL/g.h)
(A)
(B)
CONTROL
7,00
CONTROL
HERIDA
INFECCIÓN
0
6,00
ACS1
0,80
0,40
ACS2
0,00
0
8
16
24
Tiempo (horas)
48
ACO
415
8
16
24
HERIDA
48
8
16
24
INFECCIÓN
48
8
16
24
48
Figura 2. Número de unigenes con expresión diferencial, por inducción o represión, en
cada una de las condiciones de estudio o por combinación de ellas.
CONTROL
CONTROL
ETILENO
7831
ETILENO
8020
174
21
57
54
0
41
49
HERIDA
3
INFECCIÓN
67
56
HERIDA
132
INFECCIÓN
12
0
INDUCCIÓN
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REPRESIÓN
Figura 3. Hibridación Northern de tres genes con expresión diferencial en infección
y/o etileno. Por orden: 3-desoxi-D-arabinoheptulosonato-7-fosfato sintasa, β-Caroteno
hidroxilasa y Acetiltransferasa.
A
E
HERIDA
CONTROL
PRETR.
0
8
16
24
48
8
16
24
INFECCIÓN
48
8
16
24
48
DHAP
BCH
ACT
Tabla 1. Ontologías Génicas (Proceso Biológico) significativas entre los genes
inducidos durante la infección de frutos de Mandarina por P. digitatum
Proceso Biológico * (genes inducidos/genes totales)
p-valor (FDR) Nivel GO
Metabolismo proteico celular (IR) (11/353)
0.0277
6
Biosíntesis de S-adenosil-metionina (SR) (3/3)
0.0303
6
Biosíntesis de derivados de aminoácidos (SR) (7/25)
0.0357
7
Metabolismo de la metionina (SR) (4/6))
0.0375
8
Biosíntesis de ácidos grasos (SR) (6/17)
0.0483
6
* (SR) Anotación GO sobre-representada al Nivel GO especificado; (IR), ídem. infrarepresentada.
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