Caracterización del agente causal de la pudrición de bulbo en

Caracterización del agente causal de la pudrición de bulbo en violeta de los Alpes
(Cyclamen persicum Mill.), en viveros de San Antonio del Tequendama.
Characterization of causal agent bulb rot Alpine violet (Cyclamen persicum Mill.) In
nurseries San Antonio del Tequendama.
DANIEL EDUARDO MOYA RUIZ; PAOLA MORENO LOPEZ.
RESUMEN
Las especies ornamentales son cada vez más una oportunidad para el crecimiento económico
de las regiones, San Antonio del Tequendama se ha convertido en un icono de la producción
ornamental el área cultivada con estas especies es cada vez mayor. La violeta de los alpes es
una de esas especies que gana cada vez más espacio en el mercado, esta planta se cultiva
bajo invernadero en materos de plástico de 14 centímetros de diámetro, se cultiva en
sustratos especializados durante 48 semanas antes de ofrecerlos a la venta. Sn embargo esta
planta presenta en cultivos de la finca los Alpes pudriciones de bulbo generando la marchitez
de las plantas, estas pudriciones avanzan consumiendo en promedio el 50% de la siembra,
este trabajo busca caracterizar el agente causal de la pudrición de bulbo y consolidar esta
información como herramienta base para el diseño de protocolos de manejo integrado de la
enfermedad.
ABSTACT
Ornamental species are increasingly an opportunity for economic growth in the regions, San
Antonio del Tequendama has become an icon of the ornamental production area cultivated
with these species is growing. Violet of the Alps is one of those species is gaining more space
in the market, this plant is grown under greenhouse materos plastic 14 cm in diameter, is
grown in specialized substrates for 48 weeks before offering them for sale . However Sn this
plant occurs in the farm's crops rot Alpes bulb generating plants wilt, these rots advance
consuming on average 50% of sowing, this work is to characterize the causative agent of bulb
rot and consolidate this information as a basic tool for the design of protocols for integrated
management of the disease.
INTRODUCCION
La violeta de los Alpes o ciclamen (Cyclamen persicum Mill.), es una especie tuberosa de
la familia Primulaceae, nativa de Palestina, Asia Menor e islas en los mares Egeo y
Mediterráneo del este (Larson, 1992). Es un cultivo ornamental de maceta apreciado por
su follaje y sus numerosas flores, cada una de estas dura cuatro semanas y la planta
puede mantenerse en floración durante meses. (Widmer, 1992). Es un cultivo importante
en Europa (Grey-Wilson, 1997), Japón (Koshioka y Masayuki, 1998) y EE.UU. (Boodley,
1996).
El vivero finca los Alpes, propiedad de la empresa Plantas y Plantas está ubicado en el
municipio de san Antonio del Tequendama y se dedica a la producción en masa de
ciclamen, con una trayectoria de 12 años en la siembra de esta planta en macetas de 14
centímetros de diámetro y bajo sustratos especializados, con una siembra mensual de
6000 plántulas. Este cultivo como cualquier otro presenta problemáticas agronómicas en
relación a su manejo. Desde hace algún tiempo se han encontrado plantas con pudrición
de bulbos y finalmente muerte de las mismas, generando un impacto significativo por la
reducción de la producción total en promedio en unas 3000 unidades y esto a su vez
genera en la empresa valores de pérdida económica de 12 millones de pesos mensuales.
(Comunicación personal empresa plantas y plantas 2015).
METODOLOGIA
UBICACIÓN
Las muestras de material vegetal con síntomas de la enfermedad que se utilizaron para
este trabajo se tomaron de la empresa Plantas y Plantas de Colombia S.A.S, el cultivo
estaba situado en la finca los Alpes ubicada en el km
14 vía Bogotá- Mesitas,
corregimiento de Santandercito del municipio de San Antonio del Tequendama, con una
altitud de 1645 m.s.n.m y temperatura media anual oscila entre 19 y 21ºC.
Estas
muestras se transportaron al laboratorio de microbiología y fitopatología de la Universidad
de Cundinamarca en Fusagasugá donde se desarrolló toda la metodología de laboratorio
pertinente para la identificación hasta género bacteriano del agente causal de la pudrición
de bulbo de la violeta de los Alpes
MATERIAL VEGETAL
Para el desarrollo de este trabajo se tomaron plantas de violeta de los Alpes (C. persicum
Mill.), teniendo en cuanta criterios como la identificación de síntomas de clorosis y
manchas negras ascendentes en la parte basal de la arquitectura de la planta. Se
seleccionaron 8 muestras dividiéndolas en 4 estados diferentes de avance de la
enfermedad y tomando dos muestras por cada estado, esto con el fin de verificar las
características de la enfermedad y ver la relación de estos síntomas con un agente
patógeno.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS A PARTIR DE MATERIAL VEGETAL ENFERMO
Las muestras seleccionadas se llevaron al laboratorio de microbiología y fitopatología de
la Universidad de Cundinamarca sede Fusagasugá. Para realizar el aislamiento se
tomaron trozos de hojas y bulbos afectados se realiza el corte en la zona de avance del
síntoma (entre los tejidos sanos y afectados) generando trozos pequeños los cuales se
lavan con agua destilada estéril (ADE) (Agrios 2005). Se tomaron trozos del material
afectado los cuales se desinfectaron con hipoclorito de sodio (NaCl) al 2% durante 1 min
y posteriormente se lavaron tres veces con ADE, para ubicarlos en tubos de ensayo en
solución con ADE esta solución se maceró y se tomó una pequeña porción con micro
pipeta, esto con el fin de realizar la diluciones y la posterior siembra por agotamiento
mediante estría múltiple en cajas de Petri con agar nutritivo (AN). Las cajas de Petri se
incubaron durante 48 horas hasta la aparición de colonias, estas a su vez se repicaron de
manera individual en AN después de 24 horas para obtener cultivos puros y realizar
pruebas de patogenicidad (Agrios 2005).
IDENTIFICACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS
Géneros comunes de bacterias fitopatógenas y sus principales características
Pantoea
Acidovorax
Pseudomonas
Ralstonia
Burkholderia
Xanthomonas
Xylophilus
Agrobacterium
Clavibacter
Clostridium
Bacillus
Streptomyces
Gram postitivo
Erwinia
bioquímicas (adaptada de Schaad (1988)).
-
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
+
+
Crecimiento anaeróbico
+
+
-
-
-
-
-
-
-
-
+
+
-
Crecimiento aeróbico
Colonias amarillas en YDC
Colonias mucoides en YDC a 30
oC.
Pigmentos fluorescentes en KB.
Pigmentos no fluorescentes
difusibles al medio de cultivo en
KB
Ureasa
+
-
+
+
-
+
+
+
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+
Catalasa
Oxidasa
+
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VR+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
Formación de esporas
Presencia de micelio aéreo.
Licuefacción de gelatina
Citrato
VR+
+
VR+
+
VRVR+
VR+
+
+
VR+
+
+
+
VR+
VR+
+
+
-
+
-
+
+
-
+
PRUEBAS DE PATOGENICIDAD
Con el fin de determinar la capacidad de las colonias aisladas se hicieron dos pruebas de
patogenicidad. Para observar si se producían pudriciones blandas se utilizaron rodajas de
papa (Solanum tuberosum) y si causaban enfermedad en hospederos de los cuales
fueron aisladas se utilizaron plantas sanas de violeta de los Alpes (C. persicum Mill). Para
los dos ensayos Se tomaron porciones de colonias bacterianas sembradas con 24 horas
de anterioridad y se realizaron diluciones seriadas en base 10 (Transfiriendo 1ml de la
primera suspensión a tubos de ensayo con 9 ml agua destilada estéril (ADE)).
Seguidamente se realizaron mediciones con un espectrofotómetro Genesys 10S UV –
VIS Thermo scientific™, con absorbancias entre 0,08 y 0,1 a a una longitud de onda de
625nm, lo que equivale a una concentración bacteriana aproximada de 1.0 x 10 8 unidades
formadoras de colonia (Perilla et al., 2004).
RESULTADOS
ESTABLECIMIENTO DE LA SINTOMATOLOGÍA DE LA PUDRICIÓN DE BULBO
Como primer síntoma se evidencia la clorosis de las hojas de la base de la planta, estas
mismas hojas continúan en un proceso de senescencia el cual se puede evidenciar en la
imagen número dos además de la perdida de la turgencia de peciolos y pedúnculos por
igual en toda la planta.
ESTABLECIMIENTO DE LOS ESTADOS DE LA ENFERMEDAD
ESTADO # 1
Las plantas se mantienen turgentes, sin embargo se evidencia clorosis en las hojas
basales, además se empieza a evidenciar el ascenso de una mancha negra a través del
peciolo de la hoja.
ESTADO # 2
Las plantas pierden la turgencia, las hojas de la base mueren y asciende la coloración
negra por el peciolo hasta la hoja, provocando la senescencia prematura de hojas y flores.
ESTADO # 3
Muchas de las hojas se encuentran entrando en senescencia y la coloración oscura de
los peciolos inicia desde el
bulbo
y se ven infectados la mayoría de los peciolos
presentes.
ESTADO # 4
El bulbo de la planta presenta un color negro oscuro este asciende a través de todos los
órganos de la planta generando marchitamiento en general, se evidencia la presencia de
hongos saprófitos en las hojas muertas.
RESULTADO DE LA IDENTIFICACION DE BACTERIAS FITOPATOGENAS
Resultado de pruebas bioquímicas de los aislamientos realizados.
Aislamiento
PRUEBA
E1M1
E1M2
E2M1
E2M2
E3M1
E3M2
E4M1
E4M2
Tinción de Gram
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-
-
-
-
-
-
Reconfirmación
-
-
-
-
-
-
-
-
Forma
Bacilos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
Bacilos
Crecimiento en
+
+
+
+
+
+
+
+
del Gram con
KOH al 3%
medio Mac
Conkey
Crecimiento medio
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-
-
+
+
+
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+
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+
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Oxidasa
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Catalasa
+
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Ureasa
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Crecimiento
+
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-
+
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-
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+
+
+
+
+
+
+
YGC
(Colonias
amarillas)
Crecimiento en
Citrato de
Simmons
Pigmentos
fluorescentes en
KB
aeróbico
Crecimiento
anaeróbico
Licuefacción de la
gelatina
Dónde: Amarillo= genero Erwinia, Azul rey = pseudomonas, azul agua marina = ralstonia.
RESULTADO DE LAS PRUEBAS DE PATOGENICIDAD
Se obtuvo un inoculo bacteriano que se inyecto con jeringa en rodajas de papa sana y
sobre plantas sanas de violeta de los Alpes, en rodajas de papa al cabo de 8 días
después de la inoculación estas rodajas presentaron síntomas de pudrición blanda, así
mismo las plantas sanas de violeta presentaron sus primeros síntomas de infección 8 días
después de la inoculación, sin embargo estos síntomas no generan una infección total, es
al cabo de 15 días después de la inoculación que la enfermedad infesta a las plantas
sanas llevándolas al colapso y posterior muerte.
DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
•
Se lograron establecer 4 estados claros de la pudrición de bulbo de la violeta de
los Alpes (C. persicum Mill.), iniciando con una ligera clorosis en la hoja de la
planta y la aparición de necrosis en los peciolos, pasando por la pudrición del
bulbo, hasta el colapso total de la planta.
•
Se aislaron dos tipos de colonias a partir de los bulbos de plantas enfermas de
violeta de los Alpes (C. persicum Mill.), colonias color crema, levantadas y de
borde redondeado.
•
5 de las 8 colonias obtenidas en el laboratorio aisladas a partir de muestras de
bulbos de violeta de los Alpes infectados con pudrición, son colonias Gram
negativas,
oxidasa negativas,
ureasa positiva, fermentativas, no hidrolizan
gelatina y catalasa positiva.
•
Por medio de la siembra en medios selectivos y pruebas bioquímicas se pudo
determinar que el agente causal de la pudrición de bulbo en violetas de los Alpes,
cultivadas bajo invernadero en san Antonio del Tequendama. Se encuentra
asociado a una infección bacteriana de colonias ubicadas del género Erwinia en
colonias bacterianas de los estados 1, 2 y 3.
•
Se encontraron también los géneros Pseudomonas y Ralstonia.
•
Todos los aislamientos inoculados tanto en las rodajas de papa (S. tuberosum)
como en las plantas sanas de violeta de los Alpes (C. persicum Mill.) presentaron
síntomas asociados a pudrición bacteriana. En el caso de los géneros diferentes a
Erwinia se sospecha de una posible asociación de otros agentes fitopatógenos o
de una contaminación.
•
Por medio de la pruebas de patogenicidad se logró establecer el periodo de
incubación de 8 días, a 20°C y 85% de humedad relativa.
•
La sintomatología de la enfermedad establecida, es de importancia en momento
de generar monitoreo en los cultivos, esta herramienta de monitoreo permite dar
un mejor manejo a la incidencia de la enfermedad.
. BIBLIOGRAFÍA
AGRIOS, G. 1986. Fitopatologia. Ediciones limusa. Mejico.
BARRET, T. 1975. Preparation of bacterial vaccine in: R.N. Godman (Ed). proccedings of
the first workshop of phytobacteriology. University of Missuri press. Columbia. P 73.
BILLING, E 1987. Bacteria as plant pathogens. Van nostrand reinhold Co. Ltd. Berkshire,
inglaterra.
BOOODLEY,J.W. 1996. The commercial greenhouse.2da edicion.ed. delmar publishers.
New York, 612 p.
FLUHARTY, D. M., AND W. L. PACKARD. 1967. Differentiation of Gram-positive and
Gram-negative bacteria without staining. Am. J. Vet. Clin. Pathol. 1:31-35.
FLORES
A., R.; LAGUNES T., A. 1998. La Horticultura Ornamental en México. Ed.
Instituto Nacional de Estadística, Geografía e Informática - Colegio de Postgraduados.
Aguascalientes, Ags. México. 88 p.
FLORES, A. R; RODRIGUEZ, M.A; MEJIA, J.M. 2009. Producción de plantas en maceta.
Academia de floricultura del departamento de fitotecnia De la universidad autónoma
Chapingo, MEXICO. P. 31 -39
GARDAN, L., GOUY, C., CHRISTEN, R., and SAMSON, R. 2003. Elevation of three
subspecies
of Pectobacterium
carotovorum to
atrosepticum sp. nov., Pectobacterium
species
level: Pectobacterium
betavascularum sp. nov. and Pectobacterium
wasabiae sp. nov. International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology
53:381–391
GAVINI FJ, MERGAERT A, BEJI C, MIELCAREK D, IZARD K, KERSTERS, DE LEY J.
Transfer of Enterobacter agglomerans (Beijerinck 1888) Ewing and Fife 1972 to Pantoea
gen nov. as Pantoea dispersa sp. Nov. Journal Syst. Bacteriol.1989. 39: 337-345.
GITAITIS, R., MACDONALD, G., TORRANCE, R., HARTLEY, R., SUMNER, D. R., GAY,
J. D., AND JOHNSON, W. C., III. 1998. Bacterial streak and bulb rot of sweet onion: II.
Epiphytic survival of Pseudomonas viridiflava in association with multiple weed hosts.
Plant Dis. 82:935-938.
GREY-WILSON, C. 1997. Cyclamen.
A Guide for Gardeners, Horticulturists and
Botanists. Ed. B.T. Bats ford Ltd. Londres. 192 p.
GRANADA E, GUTIERREZ B, CASTILLO N. 1996. Identificación de bacterias
fitopatogenas universidad nacional de Colombia. Sede Bogotá.
HOLT. J, N.R. KRIEG; P.H. SNEATH, T. STANLEY Y T. WILLIAMS. 1994. begey´s
manual of determinate bacteriology. Williams and Wilkins. Baltimore, Mary land
JANSE, J. D. 1996. Potato brown rot in Western Europe – History, presence occurrence
and some remarks on possible origin, epidemiology and control strategies. Bull.
OEPP/EPPO Bull. 26:679-985.
KREJZAR V., MERTELÍK J., PÁNKOVÁ I., KLOUDOVÁ K., KŮDELA V. (2008):
Pseudomonas marginalis associated with soft rot of Zantedeschia spp. Plant. Protect. Sci.,
44: 85–90.
KUNSTMANN, JUAN PABLO, CIAMPI, LUIGI, BÖHM, LAURA, BARRERA, SYLVIA, &
COLLADO, LUIS.
(2006). Determinación de Especies de Erwinia (grupo carotovora)
como Agentes Causales de (Pudrición Blanda) en Cala (Zantedeschia spp.). Agricultura
Técnica,66(3), 247-255.
KADO, C.I. Y M.G. HASKETT. 1970. Selective media for asolation of Agrobacterium,
Corynebacterium, Erwinia, pseudomonas and Xanthomonas. Phytopathology 6: 969- 976.
KADO, C.I. 2006. Erwinia and related genera. Prokaryotes. 6:443–450
KONEMAN EW, ALLEN SD, JANDA WM, SCHRECKENBERGER PC, Winn WC.
1999. "Diagnóstico Microbiológico". 5ª ed. Ed. Médica Panamericana SA. Buenos Aires.
KOSHIOKA, M.; MASAYUKI, A. 1998. World trends and requirements: Japan.
Proceedings of the Third International Symposium on New Floricultural Crops, Perth,
Western Australia, 1-4 Octubre 1996. Acta Horticulturae No. 454. pp. 19-28.
LARSON. R. A. 1992. Introduction to Floriculture. 2nd Edition. Academic Press, Inc. San
Diego, California, USA. 407 p.
LIN, Y. 1980. Use of potassium hydroxide technique for the differentiation of Gram-positive
and Gram-negative bacteria. Brew. Dig. 55:36-37.
MOREL, G, MOREL, P. Recuperado de www.cyclamen.com
PERILLA, M., AJELLO, G., BOPP C., ELLIOT, J., FACKLAM, R., KNAPP, J., POPOVIC,
T., WELLS,J., DOWELL, S. 2004. Manual de Laboratorio para la Identificación y Prueba
de Susceptibilidad a los antimicrobianos de Patógenos Bacterianos de Importancia para la
Salud Pública en el Mundo en Desarrollo. Organización mundial de la salud. OMS.
SCHAAD, N.W.(Ed). 1994. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria.
American phytophatological society, ST. Paul, Minnesota. 148 p.
SCHAAD, N. W. 1988. Laboratory guide for identification of plant pathogenic bacteria. The
American Phytopathological Society St. 2a, Edicion. Minnesota, USA. 164 p.
SCHAAD, N.W., JONES, J.B., and CHUN, W. 2001. Laboratory Guide for Identification of
Plant Pathogenic Bacteria. The American Phytopathological Society Press. St. Paul,
Minnesota, USA. 373 p.
SHEVCHIK, V.E., AND HUGOUVIEUX–COTTE–PATTAT, N. 2003. PaeX, a second
pectin acetylesterase of Erwinia chrysanthemi 3937. Journal of Bacteriology 185:3091–
100.
SUSLOW, T.M. SCHORTH Y M.ISAKA. 1982. application of a rapid method for gram
differentiation of plant pathogenic and saprofitic acteria without staining phytopathologic.
72: 917-918
WIDMER, R.E.; STUART, M.C.; LYONS, R.E. 1991. Seven month 4" cyclamen
– WIDMER PLAN. PP. 477-480. In: Ball RedBook 15° Edición. V. Ball (Ed). Ed. Geo. J.
Ball Publishing. Chicago.
YAP, M.N., BARAK, J.D., and CHARKOWSKi, A.O. 2004. Genomic diversity of Erwinia
carotovora subsp. carotovoraand its correlation with virulence. Applied and Environmental
Microbiology 70:3013–3023.