Hidrólisis enzimática de los triacilglicéridos
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Prácticas de Bioquímica II Práctica: Hidrólisis enzimática de los triacilglicéridos HIDRÓLISIS ENZIMATICA DE LOS TRIACILGLICERIDOS Objetivos Al terminar este trabajo práctico el estudiante estará en capacidad de: - Realizar la hidrólisis enzimática de los triacilglicéridos de la leche. - Verificar la liberación de ácidos grasos producto de la hidrólisis de los triacilglicéridos. - Demostrar que las enzimas de un preparado de páncreas tienen actividad hidrolítica sobre los triacilglicéridos. - Discutir la importancia de las sales biliares en el proceso de digestión de las grasas. Introducción La hidrólisis de los triacilglicéridos es llevada a cabo por un conjunto de enzimas llamadas lipasas. Estas enzimas tienen distintas ubicaciones en el organismo de los animales superiores, pero actúan básicamente hidrolizando los enlaces ésteres que unen los ácidos grasos a la molécula de glicerol. En la superficie dorsal de la lengua las glándulas de Ebner secretan la lipasa lingual, una enzima poco soluble en agua que muestra especificidad por la hidrólisis de triacilglicéridos que contienen ácidos grasos insaturados de cadena corta, mediana y principalmente, de cadena larga. Dicha acción consiste en escindir el enlace éster sn-3 de los triacilglicéridos originando 1,2-diacilglicérido y ácidos grasos libres. Posteriormente, en el estómago se secreta una lipasa gástrica, cuyo mecanismo de acción es similar al descrito anteriormente para la lipasa lingual. 1 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica II Práctica: Hidrólisis enzimática de los triacilglicéridos Una vez que el contenido gástrico o quimo se encuentra en el duodeno ocurre la secreción de bilis, éste es un fluido que contiene sales biliares las cuales permiten la emulsificación de la grasa para favorecer el ataque hidrolítico de las enzimas vertidas con la secreción pancreática (ejemplo: la lipasa pancreática) y la absorción de los productos de la digestión. Por su parte, la lipasa pancreática hidroliza las uniones éster primarias (sn-1 y sn-3) de los triacilglicéridos. Dicha actividad origina como productos 2-monoacilglicéridos y ácidos grasos libres. Los 2-monoacilglicéridos son los principales productos de la digestión de los lípidos y sólo aproximadamente una cuarta parte de los triacilglicéridos ingeridos en la dieta son hidrolizados por completo hasta glicerol y ácidos grasos libres. O O CH2 O C R1 Lipasa CH OH R2 CH2 OH O CH2 O C O C R1 O CH2 OH O CH O C - Glicerol R3 + -O C R21 O -O C R3 3-Acidos grasos libres Triacilglicérido La hidrólisis de los triacilglicéridos puede ser estudiada in vitro utilizando como sustrato cualquier material biológico rico en grasas, un ejemplo de ello es la leche, que al incubarla con un extracto de páncreas por un periodo de tiempo determinado, tendrá lugar la hidrólisis de los triacilglicéridos. Esta reacción puede evidenciarse mediante titulación de los ácidos grasos producto de la hidrólisis, con NaOH (acidez titulable de la leche). La acidez titulable de la leche es mayor a medida que la lipasa pancreática hidroliza eficientemente mayor número de moléculas de triacilglicéridos. 2 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica II Práctica: Hidrólisis enzimática de los triacilglicéridos MATERIALES Y REACTIVOS - Soporte universal Matraces erlenmeyer Tubos de ensayo Vaso de precipitado de 50 mL Pipetas de 1, 2 y 10 mL Leche hervida Extracto de páncreas Fenolftaleína al 0,1% en etanol Hidróxido de sodio 0,01 N Ratas de laboratorio Equipo de disección Pancreatina comercial: Pese 1 g de pancreatina comercial y disuélvala en 100 mL de hidrocarbonato sódico al 0,4%. PARTE EXPERIMENTAL Hidrólisis de los triacilglicéridos de la leche Preparación de la lipasa: - Sacrifique 2 ratas de laboratorio. Coloque en un mortero el páncreas de una rata y en el otro, el páncreas y la vesícula biliar del otro animal sacrificado. Con ayuda del mazo, por separado triture los órganos agregando aproximadamente 20 mL de solución fisiológica fría. - Colar los extractos a través de gasa para eliminar los restos de tejido pancreático y biliar. - Lleve los extractos hasta un volumen de 25 mL con solución fisiológica. - Rotule 3 vasos de precipitado y agregue lo que se indica en el siguiente cuadro: REACTIVOS TUBO 1 TUBO 2 TUBO 3 Leche completa 10 mL 10 mL 10 mL Extracto de lipasa Liofilizada 1 mL ____ ___ Extracto de páncreas sin bilis ____ 1 mL ____ Extracto de páncreas con bilis ____ ____ 1 mL 3 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica II Práctica: Hidrólisis enzimática de los triacilglicéridos Tome 2 mL de cada una de las mezclas y colóquelos en un erlenmeyer de 125 mL, agregue 2 gotas de fenolftaleína a todos los erlenmeyer y titule con una solución de hidróxido de sodio (NaOH) 0,01 N, hasta la aparición de un color rosa pálido. Incube la mezcla restante a 37 °C. Transcurridos 15 minutos tome 2 mL de la mezcla incubada y titule del modo descrito anteriormente. Este proceso debe repetirse hasta que el volumen de hidróxido gastado sea muy similar al de la titulación precedente. La primera titulación es una medida del contenido de ácidos grasos libres en la leche al inicio del experimento. La cantidad de NaOH consumido en las subsiguientes titulaciones, corresponde a los ácidos grasos liberados durante la hidrólisis de los triacilglicéridos. Anote los resultados y calcule: 1. Miliequivalentes (mEq) de NaOH gastados en cada titulación. 2. Miliequivalentes (mEq) de ácidos grasos liberados a los 15, 30 y 45 minutos de actividad enzimática. El cálculo de los mEq de NaOH se realiza despejándolos a partir de la definición de Normalidad. mEq de NaOH = N del NaOH x volumen de NaOH gastado en mL La diferencia obtenida entre los resultados de la primera valoración y de las siguientes determinará los mEq de ácidos grasos liberados, como se señala a continuación: mEq de ácidos grasos liberados = mEq NaOH finales – mEq NaOH iniciales (tiempo 0) 4 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica II Práctica: Hidrólisis enzimática de los triacilglicéridos Anote todos los resultados obtenidos en el siguiente cuadro: TUBO 0 min 15 min 30 min 45 min mL NaOH gastados 1 mEq NaOH mEq ácidos grasos liberados mL NaOH gastados 2 mEq NaOH mEq ácidos grasos liberados mL NaOH gastados 3 mEq NaOH mEq ácidos grasos liberados Grafique la actividad enzimática expresada en meq de ácidos grasos liberados en función del tiempo y analice los resultados obtenidos considerando los aspectos teóricos discutidos en clase. AUTOEVALUACIÓN 1. Realice un esquema del proceso fisiológico a través del cual las sales biliares emulsifican las grasas. 2. Explique como ocurre la hidrólisis de los triacilglicéridos. 3. Mencione las enzimas encargadas de la digestión de los triacilglicéridos. 4. Explique la diferencia observada en el gasto de NaOH entre los dos extractos, es decir con y sin presencia de sales biliares. 5 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now. Prácticas de Bioquímica II Práctica: Hidrólisis enzimática de los triacilglicéridos BIBLIOGRAFÍA Alemany, M; Font, S. Práctica de Bioquímica. Edit Alhambra. España. Braverman, J. B. Introducción a la bioquímica de los alimentos. Editorial Omega. 3era edición. España. 1980. Murray, R; Mayes, P; Granner, D; Rodwell, V. Bioquímica de Harper. Manual Moderno. 15a edición. México, D.F.-Santafé de Bogotá. 2001. Herrera, H. Elementos de Bioquímica. 1993. Editorial Interamericana. Rawn, D. J. Bioquímica. Edit Interamericana. Mac Graw Hill. España 1.989. Tomo I. 6 Easy PDF Creator is professional software to create PDF. If you wish to remove this line, buy it now.
