Métodos de inoculación - Departamento de Protección Vegetal

Inoculación en plantas
Métodos de inoculación
Curso: Métodos en fitopatología
Unidad de Fitopatología
Dto. de Protección Vegetal
Facultad de Agronomía.
„ La inoculación en plantas la realizamos con el fin de
„
„
„
„
producir enfermedad a las mismas o, en el caso de
controladores biológicos, para protegerlas del ataque de
patógenos.
Debemos disponer de inóculo viable.
Debemos poner ese inóculo en contacto con la planta.
La planta debe estar en un estadio susceptible.
Debemos dar las condiciones necesarias para que ese
inóculo colonice la planta y se produzca la enfermedad.
Dr. Pedro Mondino
24 de abril al 5 de mayo de 2012
Inoculación de plantas
Inoculación de plantas
„ El inóculo de hongos puede ser: Esporas o
„ Es muy importante conocer cual es la cantidad
micelio, mientras que en el caso de bacterias es
la propia célula bacteriana.
„ En general se debe tener en cuenta cual es la
manera en que naturalmente penetra a la planta
dicho inóculo.
„ Por ejemplo: en aquellos casos en que el
patógeno penetra por heridas será conveniente
depositar el inóculo en una herida.
mínima de inóculo necesaria para producir
infección.
„ En un ensayo en que inoculamos una serie de
plantas es necesario que todas sean inoculadas
de la misma manera y con cantidades similares
de inóculo.
„ Luego de la inoculación es común mantener a
las plantas en condiciones de humedad y
temperatura apropiadas para que el patógeno
pueda desarrollarse.
Inoculación de plantas
„ Podemos inocular para probar patogenicidad.
En ese caso, si no lo hacemos de manera
correcta podemos llegar a resultados erróneos
en el diagnóstico.
„ Podemos inocular plantas para evaluar el
efecto de alguna medida de control. Por
ejemplo evaluar el efecto de un fungicida o de
un producto biológico.
Inoculación de plantas
„ En los ensayos es esperable que las plantas
testigo manifiesten la enfermedad, mientras que
las plantas tratadas (si el tratamiento es
efectivo) los niveles de enfermedad sean
menores.
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Inoculación de bacterias
Inoculación de bacterias
„ Las bacterias pueden inocularse mediante la
aspersión de los órganos de la planta con una
suspensión de células bacterianas.
„ Es necesario saber ajustar la concentración en
la suspensión de bacterias.
„ Inoculación de hojas con una suspensión bacteriana. Mediante
carborundum se producen pequeñas heridas.
Inoculación de bacterias
„ Resultado de la Inoculación de hojas.
Inoculación de bacterias
Inoculación de bacterias
„ Embolsado para mantener la humedad de los brotes inoculados.
Inoculación de bacterias
„ Inoculación de Pseudomonas syringae pv papulans en frutos
„ Aparición de síntomas.
de manzana mediante aspersión con una suspensión de
esporas.
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Inoculación de bacterias
Inoculación de bacterias
„ Papa infectada por Ralstonia solanacearum mostrando la
„ El racimo de frutos luego de inoculados son embolsados para evitar
zooglea.
inoculaciones naturales.
Inoculación de bacterias
„ Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearum
mostrando marchitamiento de la hoja. La inoculación se
realizó mediante punción en una yema lateral.
Inoculación de bacterias
„ Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearum
mostrando marchitamiento de la hoja.
Inoculación de bacterias
„ Planta de papa inoculada con Ralstonia solanacearum
mostrando marchitamiento de la hoja. La inoculación se
realizó mediante punción en una yema lateral.
Inoculación de bacterias
„ Inoculacion de Xanthomonas campestris pv cucurbitae
mediante aspersion de cotiledones
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Test de hipersensibilidad en NO
Huésped
Inoculación de suelo
„ Ralstonia inoculada mediante riego con suspension
bacteriana
„ Método de inoculación mediante infiltración del mesófilo..
Test de hipersensibilidad en NO
Huésped
Test de hipersensibilidad en NO
Huésped
„ Resultado de la inoculación (mesófilo infiltrado) izq.
„ Resultado positivo (reacción de hipersensibilidad) der.
Diferentes tipos de inoculación
„ Resultado positivo
Inoculación de frutos
„ Inoculación en plantas de olivo de hojas, tallos, raíces y cuello
„ A partir de una colonia esporulada se realiza una suspensión de
conidios en suero fisiológico estéril.
Tallos
„ Pequeñas heridas de 1 a 2 mm de profundidad se practican con
un objeto punzante en la zona ecuatorial de los frutos.
„ Cada herida es inoculada con 10 microlitros de una suspensión
de esporas de 104 esporas/ml
Cuello
Raíz
Hojas
4
Inoculacion de frutos
Inoculación de frutos
„ Inoculación de frutos cítricos con 10 µl una
suspensión de esporas de Penicillium digitatum (104
conidios/ml)
Frutos de manzana inoculados
Inoculación de frutos
Desinfección
superficial
Secado a temp.
ambiente (2hs)
Inoculación de heridas con
suspensión de antagonista
Almacenamiento 1
mes a 5ºC
Inoculación de heridas con
suspensión de patógeno
Inoculación de frutos
„ Inoculación de frutos de kiwi con una suspensión de
Herida
control
Herida protegida
Inoculación de frutos
„ Inoculación se zapallos con Fusarium spp.
esporas de Botrytis cinerea
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Inoculación de frutos
„ Inoculación de zapallos con Fusarium spp.
Inoculación de hojas mediante aspersión
de suspensión de esporas
„ Manchas de las hojas y fruto de manzanos
causados por Glomerella cingulata en Río Grande
do Sul, Brasil.
„ Método: aspersión con una suspensión de 106
conidios/ml
Inoculacion con discos de micelio
„ Botryosphaeria spp.
„ Mediante sacabocado se marcan los discos de micelio
sobre la placa
Inoculacion con discos de micelio
„ Los discos son colocados sobre la rama previamente herida
superficialmente.
„ Posteriormente se cubre con film
Inoculación con discos de micelio
Inoculación con discos de micelio
„ Cada rama se identifica.
„ Resultado de la inoculación con diferentes aislamientos de
Botryosphaeria spp.
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Inoculación con discos de micelio
„ Resultado de la inoculación en plántulas de arándano
con discos de micelio de Botryosphaeria clavispora.
Inoculación de suelo
„ Pseudocercosporella herpotrichoides (Fron.)
Deighton, agente causal de la mancha ocular del
trigo.
„ Inoculación de suelo estéril mezclando con trozos de
tallos afectados, y sembrando semillas de una
variedad susceptible, desinfectadas superficialmente.
Inoculación del sustrato
Inoculación en bandejas
„ Inoculación con discos de micelio de Pythium
„ Inoculación de lechuga con discos de micelio de
Sclerotinia sclerotiorum
Inoculación de tallos mediante discos de
micelio
Inoculación al suelo.
„ Mediante riego de una
suspensión de conidios
(haciendo heridas o no)
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Inoculación de semillas
Inoculación de semillas
„ Inoculación de plantines de citrus
„ Resultado
Inoculación de semillas
Cuantificación de esporas
„ Uso de la cámara de Neubauer
„ Bacterización de semillas
Cámara de Neubauer
„ Se trata de un portaobjetos con una depresión en el centro.
„ en el fondo de la cual se ha marcado con la ayuda de un
Cámara de Neubauer
„ Esquema
diamante una cuadrícula .
„ Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos
lineas consecutivas de 0.25 mm.
„ Así pues el área de un cuadrado corresponde a 1 milimetro
cuadrado.
„ La depresión central del cubreobjetos está hundida 0.1 mm
respecto a la superficie.
„ De forma que cuando se cubre con un cubreobjetos éste dista
de la superficie marcada 0.1 milímetro, y el volumen
comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos es de 0.1
milímetro cúbico, es decir 0.1 microlitro.
8
Cámara de Neubauer
„ Si contamos las cuatro áreas sombreada (L)
observando un total de 20 esporas (en las cuatro áreas
sumadas)
„ la concentración en la suspensión será :
„ concentración en la suspensión (esporas / mL) =
(20/4) y eso multiplicado por 10.000
„ 5 x 104 esporas por mililitro.
Cámara de Neubauer
„ En la cámara de Neubauer el límite mínimo de conteo
es de 1 x 104 esporas/ml.
5 esporas por cada 0,1 microlitro
50 por microlitro
50.000 por mililitro
Recuento en placa
Recuento en placa
„ Consiste en sembrar en placas con medio de cultivo
„ Se preparan diluciones sucesivas de 1 en 10.
alícuotas de la suspensión de microorganismos.
„ las condiciones óptimas de conteo se dan cuando se
desarrollan entre 30 y 300 colonias por placa.
„ Como las colonias pueden originarse tanto de una
célula como de un grupo de células, se utiliza el
término: UNIDADES FORMADORAS DE
COLONIAS (u.f.c.).
„ Para la segunda dilución se toma 1 mL de la primer
dilución y se descarga en 9 mL de diluyente y así
sucesivamente
„ Las diluciones a sembrar se eligen según la carga
esperada o permitida.
„ Generalmente, se siembran no menos de tres
diluciones consecutivas.
„
Diluciones
Ej.: 1:10 (10-1), 1:100 (10-2), 1:1000 (10-3).
Diluciones
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Recuento en placa
Recuento en placa
„ Este método permite determinar sólo las células
microbianas viables
„ Esquema
Siembra en superficie
„ Se deposita 0.1 mL de cada dilución en la superficie
„
„
„
„
de las placas que ya contienen el medio de cultivo.
Se realiza duplicado para cada dilución.
Se emplea la misma pipeta para todas las diluciones
comenzando por la más diluida.
Se debe extender sobre toda la superficie de la placa
usando un rastrillo estéril.
Se usa un único rastrillo para todas las diluciones en el
mismo orden (de la más diluida a la más concentrada)
Escala de Mc Farland
Uso de la filtración
„ Cuando la concentración es baja mediante filtración y
siembra del filtro se pueden medir la concentración de
bacterias en medio liquido.
Escala de Mcfarland
Tubo
Cl2Ba al 1%
SO4H2 al 1%
u.f.c./ml.
1
0,1
9,9
3,0 x 108
2
0,2
9,8
6,0 x 108
3
0,3
9,7
9,0 x 108
4
0,4
9,6
1,2 x 109
5
0,5
9,5
1,5 x 109
6
0,6
9,4
1,8 x 109
7
0,7
9,3
2,1 x 109
8
0,8
9,2
2,4 x 109
9
0,9
9,1
2,7 x 109
10
1.0
9,0
3,0 x 109
10