4 Ensayo cometa en fauna terrestre

4 Ensayo cometa en fauna terrestre
Donaji J. González-Mille, Guillermo Espinosa-Reyes,
César Ilizaliturri-Hernández, José de Jesús Mejía Saavedra,
Yolanda Jasso-Pineda, Fernando Díaz-Barriga
Introducción
El genoma es el conjunto de información genética necesaria para el funcionamiento de un ser vivo; dicha información está codificada en las moléculas de ADN.
Todos los componentes básicos del ADN (bases nitrogenadas, azúcares y grupos
fosfodiésteres) son posibles blancos de alteraciones químicas por agentes genotóxicos, como algunos hidrocarburos aromáticos policíclicos (HAP) presentes en
el petróleo crudo y sus productos derivados (Albert, 2004).
La teoría de la mutación somática del cáncer establece que los daños del genoma que producen mutaciones son la base para el desarrollo de varios tipos de
cáncer. Según esta teoría, un sólo impacto en el ADN, ocasionado por algún agente
genotóxico (en el sitio adecuado y que no sea reparado correctamente), puede
tener consecuencias severas para la célula. De manera general, estos impactos al
ADN se pueden dividir en mutaciones puntuales, aductos, aberraciones cromosómicas y rupturas de la molécula.
El ensayo cometa es una prueba ampliamente utilizada para detectar el
daño in vitro o in vivo causado al ADN por agentes genotóxicos en células
individuales (Fairbairn et al., 1995; Rojas et al., 1999; Tice et al., 2000). Se
caracteriza por ser un método sensible, rápido, sencillo, de bajo costo y aplicable
a varios tipos de células de eucariontes (Mckelvey-Martin et al., 1993; Collins
et al., 2008). Esta técnica, descrita por Singh et al. (1988), permite analizar
107
la migración del ADN debido a rupturas simples en la hebra del ADN y a sitios
álcali lábiles (Speit y Hartmann, 1999). Consiste básicamente en analizar células individuales que son lisadas y sometidas a una electroforesis. Durante la
electroforesis los fragmentos de ADN migran fuera del núcleo celular hacia el
ánodo y forman una cauda o cola que, al ser observada con el microscopio de
fluorescencia, tiene la apariencia de un cometa. La magnitud del daño es evaluada de acuerdo al número de células afectadas, a la longitud de la cola y a la
intensidad de la fluorescencia de los fragmentos. Con algunas modificaciones,
esta técnica puede usarse para evaluar la inducción de enlaces cruzados (proceso de intercambio de secciones de ADN entre dos cromosomas) y la alteración
de los mecanismos de reparación y muerte celular (apoptosis) (Fairbairn et al.,
1995; Speit y Hartmann, 1999; Tice et al., 2000).
En este capítulo se describirá la técnica del ensayo cometa para determinar el
daño al ADN en diferentes especies de fauna terrestre. Inicialmente se detallará el
método usado en linfocitos humanos (Singh et al., 1988), y posteriormente se
mencionarán las adecuaciones realizadas para las especies de fauna silvestre que
fueron evaluadas (sapos y lombrices de tierra).
Campo de aplicación
El ensayo cometa ha sido utilizado en estudios de monitoreo (Lebailly et al., 1997;
Dhawan et al., 2009) en sapos y lombrices de tierra con la finalidad de recabar
evidencia sobre el estrés ambiental al que han estado expuestos estos organismos
en sitios que presentan suelos contaminados con hidrocarburos.
Ensayo en linfocitos humanos
Fundamento del método
Este método se basa en la observación de células individuales (linfocitos) con
la finalidad de evaluar la fragmentación del ADN ocasionada por la exposición
a contaminantes genotóxicos. Consiste básicamente en los siguientes pasos:
obtener las células, fijarlas con agarosa en un portaobjetos, someterlas a una
solución de lisis con la finalidad de romper su membrana celular, desenrollar el
ADN en una solución amortiguadora, realizar la electroforesis y la determinación del daño al material genético.
108
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Material y equipo
Agitadores magnéticos
Caja portalaminillas
Charola de aluminio de 30 x 20 cm
Chupones
Cubrebocas
Cubreobjetos de 24 x 50 cm
Frascos ámbar de 250 y 500 mL y 1 L con
tapón
Frascos de vidrio para baño de 50 mL
Gasa
Guantes de nitrilo
Matraces aforados de 50, 250 y 500 mL y
1L
Micropipetas de 0.5-10, 5-50, 20-200 y
200-1000 L
Papel absorbente
Papel aluminio
Papel encerado
Papel filtro No. 1
Papel Parafilm
Pipetas Pasteur
Pipetas serológicas de 5 y 10 mL
Pinzas de disección
Portaobjetos esmerilados de 25 x 75 mm
Probetas de 50 y 100 mL
Puntas para micropipetas de 0.5-250,
5-300 y 100-1000 L
Tijeras
Tubos Eppendorf de 2 mL
Tubos cónicos de 25 y 50 mL
Tubos Vacutainer con heparina
Estufa
Baño
Cámara de electroforesis
Fuente de poder
Agitador mecánico basculante para tubos
Balanza analítica
Baño maría
Cámara de electroforesis
Campana de extracción
Cronómetro
Cuarto frío a 4 ºC
Horno de microondas
Lámpara de luz amarilla
Microscopio equipado con luz fluorescente
y el software “Komet” 4.0 (o con ocular
graduado)
Refrigerador
Placa de agitación
Potenciómetro
Vórtex
E nsayo
cometa en fauna terrestre
109
Vasos Coplin de polipropileno
Vasos de precipitado de 1 L y 2 L
Reactivos
Ácido clorhídrico (HCl) grado analítico
Ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) para biología molecular
Agarosa de bajo punto de fusión para biología molecular
Agarosa regular para biología molecular
Agua desionizada
Bromuro de etidio grado analítico
Cloruro de sodio (NaCl) grado analítico
Dimetilsulfóxido (DMSO) para biología molecular, pureza ≥ 99.9 %
Etanol anhidro grado analítico
Hidróxido de sodio (NaOH) en perlas grado analítico
Triton X-100 grado analítico
Trizma Base grado analítico
Soluciones
Solución de agarosa regular al 1 %. Se pesa 0.25 g de agarosa y se disuelve en 25
mL de agua desionizada. Para ayudar a disolverla se utiliza el horno de microondas a una temperatura de 30 °C entre 7 y 10 s y se agita; de esta manera se
procede de forma repetitiva hasta que se disuelva completamente. La agarosa
se vierte en un frasco y se coloca en un baño a una temperatura de 50 °C. De
preferencia, esta solución debe prepararse cada vez que se realice un nuevo
ensayo.
Solución de agarosa regular al 0.6 %. Se pesan 0.075 g de agarosa y se disuelven
en 12.5 mL de agua desionizada. Se realizan los mismos pasos que se describen para la solución anterior. De preferencia, esta solución debe prepararse
cada vez que se realice un nuevo ensayo.
Solución de hidroxido de sodio 10 N. Se pesan 200 g de NaOH para disolverse en
500 mL de agua desionizada. La solución se debe preparar en una campana de
extracción con la ayuda de un baño maría y una placa de agitación. Las perlas
de NaOH deben agregarse de forma paulatina en un vaso de precipitado con
agua desionizada hasta disolverse. La solución se afora en un matraz de 500
110
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
mL y se filtra posteriormente con papel No. 1. Se almacena en un frasco ámbar
debidamente etiquetado en el cuarto frío (4 °C). Esta solución se puede almacenar en estas condiciones hasta por 30 días.
Solución de lisis. Se pesan 146.1 g de NaCl (2.5 M), 1.2 g de Trisma Base (10
mM), 8 g de NaOH (0.2 M) y 37.2 g de EDTA (100 mM) para disolverse
en 890 mL de agua desionizada. En la placa de agitación se coloca un vaso de
precipitado de 1 L y se agregan aproximadamente 500 mL de agua desionizada. Se agregan los reactivos en el siguiente orden: el NaCl, el Trisma Base y,
de forma alternada, el NaOH y el EDTA, es decir, se pone un poco de NaOH
y después un poco de EDTA y así sucesivamente. Cuando los reactivos están
disueltos, se mide el pH, el cual deberá tener un valor de 10. Con una pipeta
Pasteur se deberá agregar gota a gota la solución de NaOH 10 N para elevar los
valores de pH. En el caso de que el pH exceda el valor de 10, se deberá agregar
gota a gota HCl concentrado hasta obtener el valor deseado. Posteriormente
se agregan 100 mL de DMSO y 10 mL de Tritón 100 X. La solución se afora
en un matraz de 1 L y se filtra posteriormente con papel No 1. Se almacena
en un frasco ámbar debidamente etiquetado, a 4 °C durante por lo menos 1 h
para antes de ser utilizada.
Solución de ácido etilendiaminotetraacético 200 mM. Se pesan 3.72 g de EDTA
para disolverse en 50 mL de agua desionizada. El EDTA se debe agregar de forma paulatina en un vaso de precipitado con agua desionizada hasta disolverse.
La solución puede prepararse con la ayuda de una placa de agitación. Cuando
el reactivo esté disuelto se mide el pH, el cual deberá tener un valor de 10. Para
ajustar el pH se utiliza la solución de NaOH 10 N o HCl concentrado, como se
indicó para preparar la solución de lisis. La solución se afora en un matraz de 50
mL y se filtra con papel No. 1. Se almacena en un frasco ámbar debidamente
etiquetado, en el cuarto frío (4 °C) y en ausencia de luz directa. Esta solución
se puede almacenar en estas condiciones hasta por 30 días.
Solución amortiguadora para electroforesis. En un vaso de precipitado se agregan 48 mL de la solución de NaOH 10 N, 8 mL de la solución de EDTA 200
mM y 1544 mL de agua desionizada. Se mezcla y se mide el pH, el cual
debe tener un valor de 13 o mayor. Para ajustar el pH se utiliza la solución
de NaOH 10 N o HCl concentrado, como se indicó para preparar la solución
de lisis. La solución se afora en un vaso de precipitado de 2 L y se filtra con
papel No 1. Se almacena en un frasco ámbar debidamente etiquetado, en el
cuarto frío (4 °C).
E nsayo
cometa en fauna terrestre
111
Solución de Trisma Base 0.4 M. Se pesan 12.12 g de Trisma Base para disolverse en
250 mL de agua desionizada. El Trisma deberá agregarse de forma paulatina en un
vaso de precipitado con agua desionizada hasta disolverse. Se mezcla y se mide el
pH, el cual deberá tener un valor de 7.5. La solución puede prepararse con la ayuda
de una placa con agitador. Para ajustar el pH se utiliza la solución de NaOH 10 N
o HCl concentrado, como se indicó para preparar la solución de lisis. La solución se
afora en un matraz de 250 mL y se filtra con papel Whatman No. 1. Se almacena
en un frasco ámbar debidamente etiquetado, en el cuarto frío (4 °C).
Solución de agarosa de bajo punto de fusión al 0.5 %. Se pesan 0.125 g de agarosa
de bajo punto de fusión y se disuelven en 25 mL de agua desionizada. Para
ayudar a disolverla se utiliza un horno microondas a una temperatura de 30 °C
entre 7 y 10 s y se agita; de esta manera se procede de forma repetitiva hasta
que se disuelva completamente. La agarosa se vierte en un frasco y se coloca
en un baño a una temperatura de 37 °C. De preferencia, esta solución debe
prepararse cada vez que se realice un nuevo ensayo.
Solución stock de bromuro de etidio. Se pesan 0.002 g de bromuro de etidio y se
disuelven en 10 mL de agua desionizada. Esta solución debe ser protegida de
la luz directa, por lo que debe almacenarse en un frasco ámbar o, en su defecto,
en un tubo cónico de polipropileno cubierto con papel aluminio. El manejo del
bromuro de etidio debe hacerse en todo momento con guantes de nitrilo, y
debe evitarse el contacto directo con la piel.
Solución de trabajo de bromuro de etidio. A partir de la solución stock de bromuro
de etidio, se toma 1 mL y se disuelve en 9 mL de agua desionizada. La concentración final del bromuro de etidio deberá ser de 0.05 mM. Esta solución
debe ser protegida de la luz directa, por lo que debe almacenarse en un frasco
ámbar o, en su defecto, en un tubo cónico de polipropileno cubierto con papel
aluminio. El manejo del bromuro de etidio debe hacerse en todo momento con
guantes de nitrilo, y debe evitarse el contacto directo con la piel.
Procedimiento
Preparación de camas de electroforesis
Para la preparación de las camas de electroforesis deben usarse guantes en todo
momento. Se colocan las laminillas con el esmerilado hacia arriba en un vaso de
precipitado con etanol anhidro, se tapan con papel Parafilm y se dejan por un tiem112
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
po mínimo de 15 min. Mientras este tiempo transcurre, se cortan trozos de gasa
en forma de cuadros y se preparan con aluminio las charolas donde se colocarán
las laminillas. Las laminillas se toman con una pinza por el lado esmerilado y se
limpian con la gasa. Posteriormente se colocan en las charolas y se rotulan por la
parte esmerilada.
A cada laminilla se le colocan 150 µL de agarosa regular. La agarosa se distribuye por toda la laminilla con la ayuda de la punta del dedo limpio. Las laminillas
con la cama de agarosa se colocan en las charolas y se secan en el horno a una
temperatura de 65 a 70 °C. Una vez que estén bien secas y frías, pueden ser
almacenadas en cajas portalaminillas. Se deben utilizar antes de 2 semanas, de lo
contrario se desechan.
Preparación de las laminillas en el vaso Coplin
En el vaso Coplin se agregan 50 mL de la solución de lisis. Esta solución se vierte
con una probeta. El vaso debe almacenarse en el cuarto frío por lo menos 1 h antes
de su uso.
Los portaobjetos o laminillas se sumergen en el vaso Coplin por lo menos 1
h antes de pasar a la electroforesis. El tiempo de permanencia de las laminillas en
estas condiciones no debe exceder de 2 semanas.
Preparación de las células
Se obtiene una muestra de sangre (3 mL) en un tubo Vacutainer con heparina y se
coloca en el agitador hasta que la muestra se encuentre completamente homogenizada, para evitar su coagulación. Con ayuda de la micropipeta, se toman alícuotas
de 15 µL de la muestra de sangre y se colocan en el fondo de los tubos Eppendorf;
después se agregan 225 µL de agarosa de bajo punto de fusión y se homogeniza
con el vórtex. De la mezcla se toman 75 µL y se colocan sobre una cama de electroforesis, y enseguida se les coloca un cubreobjetos. Las laminillas se colocan en
la charola de aluminio para llevarse a refrigeración 5 min. Transcurrido el tiempo, se
retira de forma delicada el cubreobjetos de la laminilla y se agregan de 75 a 80 µL
de agarosa de bajo punto de fusión. Se coloca un nuevo cubreobjetos y se pone en
la charola para llevarse a refrigeración 5 min más. Transcurrido el tiempo, se retira
de forma cuidadosa el cubreobjetos y se desecha. Las laminillas se colocan en pares
(espalda con espalda) en el vaso Coplin con la solución de lisis.
E nsayo
cometa en fauna terrestre
113
Electroforesis
En el cuarto frío se coloca la cámara de electroforesis en la mesa. Debe asegurarse
que la cámara esté en posición totalmente horizontal, y para ello se verifica que la
burbuja indicadora se encuentre en posición centrada; de lo contrario, se ajustan
las patas hasta la posición adecuada. Después, la cámara se conecta a la fuente de
poder, de acuerdo con el color y la polaridad de los cables (rojo-positivo, negronegativo). El trabajo a partir de este momento debe realizarse en completa oscuridad y solo con ayuda de la lámpara de luz amarilla, con la finalidad de no dañar el
ADN con la luz.
Se coloca la solución de electroforesis en la cámara, hasta la plataforma por
ambos lados, sin que la solución se junte. Después se colocan las laminillas en la
cámara, tomándolas con las pinzas por la parte esmerilada y asegurándose de que
estén en la dirección correcta. Se vierte la solución de electroforesis hasta cubrir las
laminillas, asegurándose de que no queden burbujas debajo de las laminillas. Las
laminillas se quedan en la solución de electroforesis durante 20 min (tiempo de
desenrollamiento).
Mientras transcurre este tiempo, se configuran los parámetros de la fuente de
poder a 25 V, 300 A y 20 min. Transcurrido el tiempo, se coloca la tapa y se procede a encender la fuente de poder con los parámetros configurados previamente.
Se observa unos segundos la formación de espuma y un valor constante de 300
A, lo que indica que la electroforesis se está llevando a cabo correctamente. Si el
valor de 300 A disminuye, se deberá colocar más solución de electroforesis por un
costado de la cámara hasta obtener el valor deseado. Después se coloca la placa
metálica que cubre la cámara. Una vez finalizado el tiempo de la electroforesis se
debe apagar la fuente, para quitar la tapa.
Las laminillas se sacan con las pinzas y se secan por debajo con papel absorbente. Las laminillas se colocan en la charola de lavados y se les agrega solución
de Trisma Base 0.4 M, aproximadamente el volumen completo de una pipeta
Pasteur por muestra. Se dejan reposar 5 min y se repite el lavado. Se escurren y se
les agrega etanol anhidro, aproximadamente el volumen completo de una pipeta
Pasteur por muestra. Se dejan reposar 5 min más y se repite el lavado con etanol.
Finalmente, las laminillas se escurren y son colocadas en el vaso Coplin con etanol
anhidro otros 5 min. Se sacan, se limpian por debajo con papel absorbente, se dejan
secar y se guardan en una caja portalaminillas.
114
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Tinción de las células
Inmediatamente antes de la observación al microscopio, a la laminilla que se va
a leer se le agregan 25 µL de la solución de trabajo de bromuro de etidio y se le
coloca un cubreobjetos.
Lectura de resultados
Se toma una laminilla previamente teñida y se coloca en el microscopio. Se enfoca
con el objetivo de 20X hasta ver de forma adecuada el campo. Después se procede
a la lectura con la técnica circular (la lectura se inicia en el centro de la laminilla y
se continua la lectura en círculos o zig-zag (se empieza a leer la laminilla desde el
extremo superior izquierdo hacia el extremo superior derecho y se continua a partir
de este punto con movimientos en zig-zag).
En el software Komet v 4.0 se pulsa “Experiment” y se le asignan 2 ID (muestras), después se pulsa “Live”. El programa contabiliza 100 células (50 muestra y
50 duplicado). En caso de no contar con el software de análisis de imágenes, la
cuantificación del daño en las células se puede realizar con un ocular graduado, con
el cual se deberá medir la longitud de la cola (en micras) de 100 células.
Cálculos
El panel de expertos del taller internacional de procedimientos y pruebas sobre
genotoxicidad (IWGTP, sus siglas en inglés) menciona que para reportar los resultados obtenidos mediante el ensayo cometa, es recomendable el uso de dos
medidas: el Olive Tail Moment (OTM, definido como el producto de la longitud de
la cola y la fracción de ADN total de la cola. Solo se obtiene en caso de contar con
el software Komet 4) y las categorías de daño de acuerdo con la longitud de la cola
del cometa (las cuales se usan cuando no se cuenta con el software mencionado)
(Kumaravel et al., 2009) (figura 4.1).
Si el análisis se lleva a cabo con el software Komet 4, se obtendrá una serie de
parámetros (entre ellos el OTM), los cuales con generados de las diversas medidas
de daño que se toman de las células. En la figura 4.2 se muestra un ejemplo de
pantalla del software durante la medición del daño en las células. Una vez finalizada
la cuantificación del daño en las células se obtiene una hoja de cálculo (figura 4.3)
E nsayo
cometa en fauna terrestre
115
Figura 4.1. Medición del Olive Tail Moment (OTM) y categorización del daño de acuerdo
con la longitud (en micras) de la cola: 0 = sin daño; 1 = daño leve; 2 = daño moderado;
3 = daño alto; 4 = daño grave
en donde se tienen los datos de todos los parámetros obtenidos de cada una de las
células medidas por individuo, además de algunas medidas estadísticas de tendencia central, dispersión y variabilidad de estos mismos parámetros por individuo.
Figura 4.2. Ejemplo de pantalla de software Komet durante la medición de las células
116
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
E nsayo
cometa en fauna terrestre
117
Figura 4.3. Ejemplo de hoja de cálculo obtenida de la cuantificación del daño en las células
Como se mencionó anteriormente, en caso de no contar con el software de
medición se pueden establecer categorías de daño en las células a partir de la longitud de la cola del cometa. Las categorías de daño que se pueden asignar en las
células de acuerdo con el tamaño de la cola del cometa son las siguientes: 1) Clase
0 -sin daño-, daño no visible; 2) Clase 1 -daño leve-, la longitud de la cola es menor
que el diámetro del núcleo; 3) Clase 2 -daño moderado-, la longitud de la cola es de
1 a 2 veces el diámetro del núcleo; 4) Clase 3 -daño alto-, la longitud de la cola es
de 2 a 3 veces el diámetro del núcleo; y 5) clase 4 –daño grave-, la longitud de la
cola es más de 3 veces el diámetro del núcleo (Kobayashi et al., 1995). El puntaje
total de las 100 células se obtiene por la multiplicación de la suma del número de
células en cada clase por la clase de daño (0-4), y el rango va de 0 (todas sin daño)
a 400 (todas con el máximo daño) (ver ejemplo en la tabla 4.1).
Tabla 4.1. Ejemplo de cálculos por clase de daño
Clase
0
0
0
0
0
(n)
2
7
5
8
1
25.5
12.4
2.6
3.8
2
63.5
75.6
54.6
46.6
3
11
12.0
42.8
49.6
4
0
0
0
0
Células
analizadas
Scores
200
700
500
800
185.5
199.6
240.2
245.9
En la tabla 4.2 se presenta un resumen de las condiciones recomendadas para
la realización del ensayo en linfocitos humanos.
Tabla 4.2. Resumen de las condiciones recomendadas para el ensayo cometa en linfocitos
humanos
Volumen de muestra
Volumen de agarosa
Tiempo de desenrollamiento
Tiempo de electroforesis
Luz
Temperatura
Número de réplicas
118
15 µL
225 µL
20 min
20 min
Desenrollamiento y electroforesis en ausencia de luz
Desenrollamiento y electroforesis a 4 ºC
2
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Tabla 4.2 Continúa
Número de células a evaluar
Respuesta a medir
100 (50 por laminilla)
Olive Tail Moment (OTM) o longitud de la
cola del cometa
Modificaciones realizadas en el ensayo cometa
para su aplicación en fauna silvestre
Sapos
Se recomienda el uso de los sapos ya que, por su ciclo de vida, durante su etapa
adulta se consideran organismos terrestres. Además, la distribución ecológica
de estos organismos coincide con la presencia de muchos sitios impactados por
hidrocarburos en las costas del golfo de México.
Para la captura de los organismos se propone utilizar trampas de barrera y embudo. Las trampas se pueden elaborar de material plástico como barrera y botes
de 20 L como recipientes de colecta. La trampa debe estar conformada por tres
vértices con una extensión de 5 m por vértice (figura 4.4). La técnica de captura
consiste en colocar las trampas de barrera sobre las orillas de las riberas o de las
charcas. La disposición de la trampa puede hacerse de forma lineal o de forma
cruzada, dependiendo del terreno. Deben ser colocadas por la tarde y revisadas en
el transcurso de la noche y por la mañana. También pueden realizarse trayectos
nocturnos en áreas de 1 ha y recolectar los organismos con red y a mano. Los
organismos pueden irse colocando en cubetas y mantenerse ahí hasta la toma de
muestras.
La muestra de sangre de los sapos (1 a 2 mL) puede obtenerse por punción
cardiaca con jeringas heparinizadas. Posteriormente, la sangre se almacena en tubos Vacutainer con heparina y se mantienen en agitación hasta que la muestra
esté completamente homogenizada. Es importante recalcar que no debe utilizarse
EDTA como anticoagulante ya que puede lisar los eritrocitos de algunas especies
de anfibios y reptiles.
El ensayo se realiza siguiendo el mismo procedimiento descrito para los linfocitos humanos, a excepción del volumen de sangre y los tiempos de desenrollamiento y electroforesis. Debido a la densidad de células nucleadas (eritrocitos) en
la sangre de los anfibios, es necesario diluirla. Para ello se toman alícuotas de 10 µL
E nsayo
cometa en fauna terrestre
119
Figura 4.4. Trampa de barrera y embudo: a) esquemas donde se muestra la ubicación de
las cubetas (al final de cada barrera se coloca una cubeta enterrada al ras de suelo); b)
trampas colocadas en los sitios de muestreo
a)
b)
de la muestra de sangre y se colocan en el fondo de los tubos Eppendorf, después
se agregan 300 µL de agarosa de bajo punto de fusión y se homogeniza con el
vórtex. De esta mezcla se toman alícuotas de 15 µL y se colocan en el fondo de los
tubos Eppendorf, después se agregan 225 µL de agarosa de bajo punto de fusión y
se homogeniza con el vórtex. A partir de este paso se continúa con el procedimiento descrito para los linfocitos. En la electroforesis únicamente se deberá modificar
el tiempo de desenrollamiento del ADN a 5 min, y el de electroforesis a 10 min. En
la tabla 4.3 se presenta un resumen de las condiciones recomendadas para realizar
el ensayo en sapos.
Lombrices
Se recomienda el uso de lombrices de tierra para este ensayo ya que, al ser componentes importantes del edafón (fauna del suelo), tienen un papel primordial
en los ciclos biogeoquímicos, en la aireación y en la adición de nutrientes al suelo. Además, son organismos que viven en contacto directo con el suelo, que es
una de las matrices ambientales importantes cuando se realiza una evaluación
120
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Tabla 4.3. Resumen de las condiciones recomendadas para el ensayo cometa en eritrocitos
de sapo
Volumen de muestra
Volumen de agarosa
Tiempo de desenrollamiento
Tiempo de electroforesis
Luz
Temperatura
Número de réplicas
Número de células a evaluar
Respuesta a medir
10 µL (1a dilución)
15 µL (2a dilución)
300 µL (1a dilución)
225 µL (2a dilución)
5 min
10 min
Desenrollamiento y electroforesis en ausencia de luz
Desenrollamiento y electroforesis a 4 ºC
2
100 (50 por laminilla)
Olive Tail Moment (OTM) o longitud de la cola del
cometa
de riesgo. Los resultados de varios estudios ecotoxicológicos muestran su utilidad como organismos bioindicadores de la salud del suelo (Ogunseitan, 2002;
Espinosa-Reyes et al., 2010).
La captura de las lombrices es manual; para ello se delimita un área determinada en el sitio de estudio y posteriormente se trazan al azar varios transectos de
aproximadamente 50 m (la distancia puede variar dependiendo del sitio donde se
realice la colecta de los organismos). Con una pala de jardinería, se excava el suelo
para poder recolectar lombrices. Con la finalidad de estresar lo menos posible a los
organismos, se debe extraer un terrón completo (de aproximadamente 2 kg de
suelo). Posteriormente se coloca en una bandeja y se transporta al laboratorio.
En las lombrices, las células con las que se realiza el ensayo cometa se denominan celomocitos. Estos desempeñan en los invertebrados muchas de las funciones
de las células sanguíneas de los vertebrados, tales como la defensa y la fagocitosis.
En las lombrices de tierra se obtiene una mezcla de celomocitos con medio de cultivo RPMI. Se utilizan 30 µL de esa mezcla (procedimiento descrito más adelante)
y se sigue el mismo método de desenrollamiento y electroforesis que se describió
para linfocitos, pero se modifica el tiempo de desenrollamiento del ADN a 5 min y
el de electroforesis a 5 min.
E nsayo
cometa en fauna terrestre
121
Material y equipo
Para las pruebas con lombrices, además del material y equipo mencionados para
los ensayos en linfocitos, se requiere de agujas de insulina.
Reactivos
Para las pruebas con lombrices, además de los reactivos mencionados para los
ensayos en linfocitos (ver sección 4.3.3), se requiere medio de cultivo comercial Roswell Park Memorial Institute (RPMI 1640).
Procedimiento
Obtención de fluido celómico
Se colocan 150 µL de medio RPMI 1640 en un tubo Eppendorf de 2 mL. Dentro
de este medio se coloca una lombriz previamente enjuagada en agua corriente. La
lombriz se mantiene dentro del tubo durante 2 min, y en este lapso se le estimula
dándole dos punciones con una aguja de insulina hasta que libere el fluido celómico
(figura 4.5).
Figura 4.5. Proceso de obtención del fluido celómico: a) captura; b)
lombriz en el tubo Eppendorf; c) punción con aguja de insulina
colocación de la
No deben hacerse más de dos punciones para no estresar al organismo. La
mezcla del medio RPMI y el fluido celómico se homogeniza en un vórtex durante
5 s. De esta mezcla se obtienen 30 µL, se colocan en un tubo Eppendorf y se les
122
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
agregan 200 µL de agarosa de bajo punto de fusión. Se homogeniza en el vórtex
durante otros 5 s. Finalmente se obtienen 75 µL de esta mezcla y se colocan en
una laminilla. En la tabla 4.4 se presenta un resumen de las condiciones que se
recomiendan para la realización del ensayo cometa en lombrices.
Tabla 4.4. Resumen de las condiciones recomendadas para el ensayo cometa en celomocitos
de lombriz de tierra
Volumen de muestra
Volumen de agarosa
Tiempo de desenrollamiento
Tiempo de electroforesis
Luz
Temperatura
Número de réplicas
Número de células a evaluar
Respuesta a medir
30 µL
200 µL (1ª dilución)
5 min
5 min
Desenrollamiento y electroforesis en ausencia de luz
Desenrollamiento y electroforesis a 4 ºC
2
100 (50 por laminilla)
Olive Tail Moment (OTM) o longitud de la cola de
cometa
Control de calidad
Para el adecuado desarrollo y la obtención de resultados confiables con estos
ensayos, es necesario atender los siguientes aspectos:
Las soluciones de agarosa deben manejarse con cuidado para asegurar una adecuada migración de las células durante la electroforesis. Hay que cuidar que no
hierva durante su preparación; si esto sucede, se debe desechar. Se debe cuidar que
en las soluciones se disuelva por completo y que no deje residuos en suspensión;
esto se reconoce por su tonalidad completamente transparente. Si esto no sucede,
es necesario se prepararla de nuevo. Si la agarosa se solidifica antes de preparar las
laminillas o las células, la solución debe prepararse de nuevo.
Para obtener una capa uniforme de agarosa, hay que tener cuidado de no pasar
muchas veces el dedo sobre la laminilla, pues esto podría causar migración irregular
de las células.
Durante el manejo del bromuro de etidio debe evitarse el contacto debido a sus
propiedades genotóxicas. Es necesario manejarse en todo momento con guantes
de nitrilo y evitarse el contacto directo con la piel.
E nsayo
cometa en fauna terrestre
123
Durante la preparación de las soluciones se recomienda utilizar agitación y
agregar los reactivos en un orden específico; esto no debe alterarse, para garantizar
la adecuada disolución de todos los componentes.
Se recomienda colocar papel encerado en los tapones de los frascos ámbar donde se almacenen las soluciones, para evitar que se peguen.
Las muestras de sangre humana tienen una viabilidad para su uso en el ensayo,
y por ello deben evaluarse antes de 3 h. Durante la preparación de las células es
necesario tener cuidado de no formar burbujas al mezclar la sangre con la agarosa
en la laminilla, de no tocar la cama de agarosa en la laminilla con la punta de la
pipeta, y de colocar espalda con espalda las laminillas en el vaso Coplin. Con ello se
puede evitar que las muestras se dañen y que se presente migración irregular de las
células durante la electroforesis.
Durante la colocación de las laminillas en la cámara de electroforesis, deben
enjugarse las pinzas cada vez que se desee tomar una nueva laminilla. Dentro de
la cámara, se debe fijar la parte posterior de las laminillas y colocar en la dirección
correcta con respecto al flujo eléctrico para evitar que se pierdan las muestras.
Referencias
Albert, L. 2004. Toxicología Ambiental. Universidad Autónoma de Ciudad Juárez. Ciudad
Juárez, Chihuahua, México.
Collins, A.R., Oscoz, A.A., Brunborg, G., Gaivão, I., Giovannelli, L., Kruszewski, M., Smith,
C.C., Štătina, R. 2008. The comet assay: topical issues. Mutagenesis. 23, 143-151.
Dhawan, A., Bajpayee, M., Parmar, D. 2009. Comet assay: a reliable tool for the assessment
of DNA damage in different models. Cell Biology and Toxicology. 25, 5-32.
Espinosa-Reyes, G., Ilizaliturri, C., González-Mille, D., Costilla, R., Díaz-Barriga, F., Cuevas,
M.C., Martínez, M.A., Mejía-Saavedra, J. DNA Damage in earthworms (Eisenia spp.)
as indicator of environmental stress in the industrial zone Coatzacoalcos, Veracruz,
Mexico. Journal of Environmental Science and Health Part A. 45, 49-55.
Fairbairn, D.W., Olive, P.L., O’ Neill, K.L. 1995. The comet assay: a comprehensive review.
Mutation Research. 339, 37-59.
Kobayashi, H., Sugiyama, C., Morikawa, Y., Hayashi, M., Sofuni, T. 1995. A comparison between manual microscopic analysis and computerized imagen analysis in the single cell gel
electrophoresis. Mammalian Mutagenicity Study Group Communications. 3, 121-133.
Kumaravel, T.S., Vilhar, B., Faux, S.P., Jha, A.N. 2009. Comet Assay measurements: a perspective. Cell Biology and Toxicology. 25, 53-64.
124
Métodos ecotoxicológicos para la evaluación de suelos contaminados con hidrocarburos
Lebailly, P., Vigreux, C., Godard, T., Sichel, F., Bar, E., Letalaër, J.Y., Henry, M., Gauduchon,
P. 1997. Assesment of DNA damage induced in vitro by etoposide and two fungicides
(carbendazim and chlorothalonil) in human lymphocytes with the comet assay. Mutation Research. 375, 205-217.
Mckelvey-Martin, V.J., Green, M.H.L., Schmezer, P., Pool-Zobel, B.L., De Méo, M.P., Collins
A. 1993. The single cell gel electrophoresis assay (comet assay): A European review.
Mutation Research. 288, 47-63.
Ogunseitan, O.A. 2002. Microbial Proteins as Biomarkers of Ecosystem Health. In: Scow,
K.M., Fogg, G.E., Hinton, D.E., Jonson, M.L. (editores). Integrated Assessment of
Ecosystem Health. Lewis Publishers. Boca Raton, Florida, EUA.
Rojas, E., López, M.C., Valverde, M. 1999. Single cell gel electrophoresis assay: methodology and applications. Journal of Chromatography B. 722, 225-254.
Singh, N.P., McCoy, M.T., Tice, R.R., Schneider, E.L. 1988. A single technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research.
175, 184-191.
Speit, G., Hartmann, A. 1999. The comet assay (Single-cell gel test): a sensitive genotoxicity test for detection of DNA damage and repair. Methods in Molecular Biology.
113, 203-212.
Tice, R.R., Agurell, E., Andreson, D., Burlinson, B., Hartmann, A., Kobayashi, H., Miyamae,
Y., Rojas, E., Ryu, J.C., Sasaki, F. 2000. Single cell gel/Comet assay: Guidelines for in
vitro and in vivo genetic toxicology testing. Environmental and Molecular Mutagenesis. 35, 206-221.
E nsayo
cometa en fauna terrestre
125