SELECCIÓN DEL MEJOR ESPERMATOZOIDE
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SELECCIÓN DEL MEJOR ESPERMATOZOIDE MIGUEL ANGEL FERNÁNDEZ PÉREZ INTRODUCCIÓN Los continuos avances en el campo de la reproducción asistida han contribuido a la mejora de los resultados de los diversos tratamientos aplicados en parejas estéri‐ les. Pero aún así, todavía quedan muchos casos por resolver en los que la aplicación de las técnicas actuales no son suficientes para obtener el resultado deseado. En los programas de fecundación in vitro la obtención de ovocitos es limitada en cuanto a su número, pues obviamente no podemos obtener todos los que quisié‐ ramos, ya sea para elegir el que creemos que es el mejor, o para fecundar muchos y elegir luego el embrión de mejor calidad para su transferencia. Entre otros factores, la calidad de los óvulos está muy vinculada a la estimulación ovárica, siendo esta la que decida probablemente en gran medida si los ovocitos obtenidos son competen‐ tes o no. Los espermatozoides, a diferencia de los óvulos, sí se disponen de mucha más cantidad (la mayoría de las veces) entre los cuales poder elegir el mejor. Y todos sabemos que el espermatozoide va a determinar el desarrollo temprano y tardío del embrión, así como su euploidia1, 2. Por tanto, la necesidad de saber elegir el mejor espermatozoide es fundamen‐ tal de cara a tener éxito en el tratamiento, ya que de esta manera reduciríamos el riesgo de fecundar el mejor ovocito obtenido con un espermatozoide defectuoso, comprometiendo el resultado3. Además, en aquellos países donde la limitación del número de óvulos a fecundar está impuesta por cuestiones legales, se hace especial‐ mente interesante la selección del mejor espermatozoide4. Actualmente en los procesos de ICSI la selección de los espermatozoides se realiza fundamentalmente en base a su morfología y a su motilidad. Es decir, siguien‐ do los criterios de la OMS5 para la identificación de un espermatozoide normal. Pero estos criterios son muy relativos y limitados, ya no solo para la realización de ICSI6, sino como herramienta diagnóstica, pues no necesariamente son datos que indiquen una buena salud espermática7. [1] Actualización Obstetricia y Ginecología 2011 El objetivo fundamental del presente estudio es abordar los diferentes méto‐ dos de selección espermática existentes en la bibliografía, con especial atención a la selección de espermatozoides a alta magnificación como método de selección ade‐ cuado en los procesos de ICSI. TECNICAS DE SELECCIÓN ESPERMATICA Entre los métodos actuales de selección espermática, el empleo de la centrifu‐ gación por gradientes de densidad así como la técnica de Swim‐up, ambas conocidas por todos nosotros, seleccionan espermatozoides siguiendo estos criterios8. Pero no son técnicas lo suficientemente eficaces para seleccionar el mejor espermatozoide, por lo que se hace necesario el desarrollo de nuevas técnicas con tal propósito. Multitud de estudios aportan nuevas ideas que se podrían emplear para ayu‐ dar a identificar el mejor espermatozoide. Entre ellos, el estado del ADN espermáti‐ co9, la presencia en la membrana de determinados marcadores apoptóticos10 e indi‐ cadores de madurez espermática11, así como la selección del espermatozoide en base a su morfología observada a gran magnitud (IMSI)12 son marcadores recientes que pueden ayudar en la identificación del mejor espermatozoide. En base a estos hallaz‐ gos, existen actualmente determinadas técnicas desarrolladas las cuales vamos a ana‐ lizar en cuanto a eficacia, ventajas e inconvenientes, así como su aplicación clínica. M AGNETIC ACTIVATED CELL SORTING (MACS) Esta técnica se basa en las diferencias fisiológicas de los espermatozoides a ni‐ vel molecular que determinan su viabilidad, las cuales pueden ser utilizadas para la selección del espermatozoide competente: − La presencia de fosfatidilserina (PS)13 en la membrana externa del es‐ permatozoide se ha correlacionado con un alto índice de apoptosis en el espermatozoide, determinando por tanto una relación directa entre la presencia de PS y viabilidad espermática. − La externalización de ubiquitina14 (molécula utilizada por la maquinaria celular para marcar sustratos defectuosos intracelulares con el propósi‐ to de ser eliminados) en las membranas de los espermatozoides tam‐ bién parece ser un indicador de viabilidad, al encontrarse en grandes cantidades en aquellos espermatozoides con formas anormales y re‐ ducción de la motilidad. − El Factor de activación plaquetario (PAF)15 es un fosfolípido que tam‐ bién está relacionado con la movilidad, reacción acrosómica y viabilidad espermática, especialmente la presencia de su receptor en las membra‐ nas espermáticas. [2] Reproducción − El ácido hialurónico (AH), y su unión al espermatozoide, nos indicaría buena salud espermática al presentar este en su superficie receptores para el AH, pudiéndose por tanto emplear también como marcador16. Estas moléculas, debido a su relación con la viabilidad celular, se pueden em‐ plear como marcadores de cara a seleccionar el mejor espermatozoide17. La técnica MACS consiste en el uso de MicroBeads (MB), unas partículas coloi‐ dales magnéticas pequeñas de unos 50 nanómetros de diámetro unidas a anexina V, que se conjugan con anticuerpos específicos del marcador que queramos utilizar. De este modo, los espermatozoides alterados se unirán específicamente a estas microes‐ feras, y mediante el empleo de un intenso campo magnético los espermatozoides marcados quedarán retenidos por su unión a estas microesferas en la matriz de una columna, realizándose así la separación física de los espermatozoides18. En la bibliografía se publican mejoras en la selección espermática tras la apli‐ cación de MACS en términos de movilidad, viabilidad, reducción en la incidencia de fragmentación del DNA, así como un aumento del potencial de fecundación19. Mejo‐ ras en tasas de división embrionaria, embarazo clínico, y mejoras en la supervivencia espermática tras la descongelación20. Por el contrario, en prácticamente todos los artículos se hace mención a la ne‐ cesidad de realizar estudios clínicos adicionales para obtener una valoración real de dicha tecnología, así como su seguridad en su empleo. P OLSCOPE El uso de luz polarizada también es un método de selección espermática, ba‐ sado en la birrefringencia de los espermatozoides generada a partir de la textura pro‐ toplásmica de estos, la cual tiene propiedades anisotrópicas. Los espermatozoides, células muy condensadas y DNA compacto, presentan una alta birrefringencia cuando se le incide con luz polarizada21. Aquellos con presencia de vacuolas no generan tal índice de refringencia, así como aquellos con morfología alterada ya sea en cabeza, pieza intermedia y flagelo. Además, se pueden llegar a distinguir espermatozoides con reacción acrosómica22. Se trataría pues, de un método de selección no invasivo para ICSI. La escasa bibliografía publicada arroja resultados prometedores, siendo necesarios muchos más estudios clínicos para determinar su eficacia. E LECTROFORESIS De todos es bien sabido el papel que tiene el estado fisiológico del DNA en los espermatozoides de cara a su viabilidad. El índice de fragmentación del DNA o la alte‐ [3] Actualización Obstetricia y Ginecología 2011 ración en el número de cromosomas también se puede valorar mediante el empleo de la Electroforesis, la cual permite la selección de los espermatozoides en base a su electronegatividad y al tamaño de su genoma23. Ainsworth publica su primer naci‐ miento mediante el uso de esta técnica en 2007, alabando las ventajas de dicha técnica en cuanto a capacidad de selección espermática independientemente de su origen y/o cantidad de estos, con respecto a motilidad, viabilidad, morfología e inte‐ gridad del DNA24. No obstante, se necesitan más estudios clínicos que valoren objeti‐ vamente dicha técnica, mencionando además la dificultad y complejidad que tiene poner dicha técnica a punto. IMSI La selección morfológica a gran magnitud (6600‐12000x) de los espermatozoi‐ des es una técnica relativamente reciente que últimamente ha adquirido cierta ex‐ pansión en cuanto a su aplicación. Varios estudios avalan el empleo de dicha técnica especialmente en casos de factor masculino severo en términos de tasa de embarazo y especialmente en la reducción de la incidencia de abortos, pues permite la selec‐ ción del mejor espermatozoide en tiempo real y por tanto su empleo directo en la ICSI (IMSI‐Intracitoplasmic morphologically selected sperm injection)25. Bartoov26 en 2002 definió unos criterios de selección espermática a alta magni‐ ficación que denominó MSOME (Motile Sperm Organelle Morphology Examination), basado en el análisis de 6 orgánulos subcelulares del espermatozoide. Así, la normali‐ dad morfológica de un espermatozoide se define por la presencia de un núcleo y acrosoma normal, región post‐acrosómica, mitocondrias, pieza intermedia y cola también normales, sin gotas citoplásmicas alrededor de la cabeza. Con ello, estable‐ ció una normalidad morfológica de 3,3 ± 0,5%. Los autores concluyeron que solo la normalidad de la cabeza constituía un parámetro clave y decisivo, pues encontraron diferencias significativas en cuanto a tasa de fecundación y la tasa de embarazo clíni‐ co. Wittemer27 en 2006 estableció que si la normalidad estricta de la cabeza del es‐ permatozoide a muchos aumentos estaba por debajo del 8% en el eyaculado, se de‐ bería realizar ICSI para evitar fallos de fecundación en una FIV convencional. La selección de dichos espermatozoides provoca una mejor tasa de formación de blastocistos28, lo que sugiere un claro efecto paterno sobre la viabilidad del em‐ brión. Además, se ha relacionado la morfología del espermatozoide a alta magnifica‐ ción con su estado fisiológico en términos de función mitocondrial, estructura de la cromatina (integridad y fragmentación del DNA) así como incidencia de aneuploidías, estableciéndose una relación directa entre la normalidad morfológica y buena salud espermática29, lo que explicaría no solo la sutil mejora en términos de embarazo clínico, sino también la mejora sustancial en cuanto a tasas de aborto clínico30, 31 [4] Reproducción Recientemente se ha investigado bastante la presencia y tamaño de vacuolas en la cabeza del espermatozoide mediante alta magnificación32, 33, 28, aparentemente debido a sus implicaciones clínicas en término de embarazo y aborto. Dichas vacuolas parecen estar relacionadas con daños en la cromatina, fragmentación del DNA es‐ permático y alteraciones cromosómicas. Debido a esto, incluso el estudio de los es‐ permatozoides mediante MSOME ha sido propuesto como herramienta diagnóstica a incluir en los laboratorios de andrología como método rutinario de análisis de se‐ men34, debido a su objetividad, eficacia y sensibilidad35 Como inconveniente, el tiempo empleado en la búsqueda y selección de los espermatozoides adecuados que puede variar entre 1‐4 horas, y el elevado coste del equipo necesario, hacen que dicha técnica no llegue a implementarse en las clínicas de fertilidad de manera generalizada. Por tanto, la necesidad de conocer con estudios bien controlados y aleatorizados la repercusión de la selección del espermatozoide a este nivel sobre los resultados globales en los tratamientos de FIV es obvia. Recientemente se ha publicado un meta‐análisis comparando el uso de ICSI frente IMSI, concluyéndose que la IMSI no solo mejora de manera significativa el por‐ centaje de embriones de buena calidad, las tasas de implantación y de embarazo, sino que además reduce la tasa de aborto comparado con la ICSI31. Aún así, se necesi‐ tan más estudios que avalen dicha técnica, pues tan solo 2 artículos reunieron los criterios de inclusión. En nuestro laboratorio incorporamos recientemente un equipo de IMSI, con‐ cretamente un Leica AM6000. Este equipo tiene la enorme ventaja de poder realizar en la misma placa de Petri tanto la selección del espermatozoide como posteriormen‐ te la IMSI, al disponer de objetivos de inmersión de 20x y de 40x. Mediante el empleo de un zoom variable de lentes incorporado en el microscopio, es posible conseguir un rango de aumentos de 6600x‐12000x. CONCLUSIONES Los métodos de selección de espermatozoides son de vital importancia de cara a ofrecer buenos resultados reproductivos y ciertas garantías de conseguir un bebé sano en casa. Los métodos tradicionales de selección no son objetivos, además de no ser suficientemente eficientes en la identificación de espermatozoides viables. Multi‐ tud de técnicas de selección pretenden este objetivo, pero son necesarios la realiza‐ ción de amplios estudios bien controlados que demuestren la eficacia de cada una de ellas. La técnica IMSI, gracias a la selección morfológica de los espermatozoides a alta magnificación en tiempo real, a pesar de ser una técnica costosa y requerir tiempo para su realización, parece demostrar ser una técnica efectiva cuando las causas de [5] Actualización Obstetricia y Ginecología 2011 esterilidad son por factor masculino severo o abortos de repetición tras ciclos de FIV, por lo que su uso en Reproducción Asistida podría llegar a ser frecuente y estar pre‐ sente en todos los centros de FIV. Al tratarse de una técnica no invasiva, la seguridad en su aplicación está garantizada. Además, su uso como herramienta diagnóstica ayudaría en gran modo a diagnosticar determinados problemas de fertilidad masculi‐ na, pues la presencia de vacuolas en la cabeza del espermatozoide parece tener una estrecha relación con el potencial de viabilidad de este. BIBLIOGRAFIA 1 Tesarik J 2005 Paternal effects on cell división in the human preimplantation embryo. 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