Método para la determinación de bacterias coliformes

Camacho, A., M.Giles, A.Ortegón, M.Palao, B.Serrano y O.Velázquez. 2009. Técnicas para el
Análisis Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
Método para la determinación de bacterias coliformes, coliformes
fecales y Escherichia coli por la técnica de diluciones en tubo
múltiple (Número más Probable o NMP)
OBJETIVOS
Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos
coliformes fecales.
• Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos mediante la
búsqueda de microorganismos coliformes totales, coliformes fecales y
Escherichia coli.
• Organizar e interpretar los resultados.
•
GENERALIDADES
Debido a que un gran número de enfermedades son transmitidas por vía fecal-oral
utilizando como vehículo los alimentos y el agua, es necesario contar con
microorganismos que funcione como indicador de contaminación fecal. Estos
deben de ser constantes, abundantes y exclusivos de la materia fecal, deben tener
una sobrevivencia similar a la de los patógenos intestinales y debe de ser capaces
de desarrollarse extraintestinalmente.
El grupo coliforme es constante, abundante y casi exclusivo de la materia fecal, sin
embargo, las características de sobrevivencia y la capacidad para multiplicarse
fuera del intestino también se observan en aguas potables, por lo que el grupo
coliforme se utiliza como indicador de contaminación fecal en agua; conforme
mayor sea el número de coliformes en agua, mayor será la probabilidad de estar
frente a una contaminación reciente.
Cuando los coliformes llegan a los alimentos, no sólo sobreviven, sino que se
multiplican, por lo que en los alimentos el grupo coliforme adquiere un significado
distinto al que recibe en el agua. En productos alimenticios que han recibido un
tratamiento térmico (pasteurización, horneado, cocción, etc.), se utilizan como
indicadores de malas prácticas sanitarias.
Los microorganismos coliformes constituyen un grupo heterogéneo con hábitat
primordialmente intestinal para la mayoría de las especies que involucra.
El grupo de bacterias coliformes totales comprende todos los bacilos Gramnegativos aerobios o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la
lactosa con producción de gas en un lapso máximo de 48 h. a 35°C ± 1ºC. Este
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grupo esta conformado por 4 géneros principalmente: Enterobacter, Escherichia,
Citrobacter y Klebsiella.
El grupo de coliformes fecales, está constituido por bacterias Gram-negativas
capaces de fermentar la lactosa con producción de gas a las 48 h. de incubación a
44.5 ± 0.1°C. Este grupo no incluye una especie determinada, sin embargo la más
prominente es Escherichia coli.
La demostración y el recuento de organismos coliformes, puede realizarse
mediante el empleo de medios de cultivo líquidos y sólidos con características
selectivas y diferenciales.
Escherichia coli es un bacilo corto Gram negativo que se encuentra clasificado
dentro de la familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), existe como
comensal en el intestino delgado de humanos y animales. Sin embargo, hay
algunas cepas de E. coli patógenas que provocan enfermedades diarreicas. Estas
E. coli se clasifican con base en las características que presentan sus factores de
virulencia únicos, cada grupo provoca la enfermedad por un mecanismo diferente.
Las propiedades de adherencia a las células epiteliales de los intestinos grueso y
delgado son codificadas por genes situados en plásmidos. De manera similar las
toxinas son mediadas por plásmidos o fagos.
Este grupo de bacterias se encuentra constituido por las siguientes cepas: E. coli
enterotoxigénica (ETEC), E. coli enteropatógena (EPEC), E. coli
enterohemorrágica (EHEC), E. coli enteroinvasiva (EIEC), E. coli enteroagregativa
(EAEC) E. coli enteroadherente difusa (DAEC). Existen otras cepas que no han
sido perfectamente caracterizadas; de las cepas anteriores, las 4 primeras están
implicadas en intoxicaciones causadas por el consumo de agua y alimentos
contaminados.
Escherichia coli enterotoxigénica ETEC es reconocida como el agente causal
de la diarrea del viajero, la cual se caracteriza por diarreas acuosas con o sin
fiebre. Este tipo de infecciones es muy frecuente en países subdesarrollados y
afecta principalmente a los niños.
Patogénesis: El microorganismo es capaz de producir dos tipos de toxina. Una
toxina termolábil de aproximadamente 89 kDa cuya secuencia, antigenicidad y
función es similar a la toxina del cólera, la otra toxina que produce es termoestable
y es de bajo peso molecular (4 kDa) y es capaz de resistir temperaturas de
ebullición hasta por 30 minutos.
La infección puede ser adquirida por el consumo de alimentos como vegetales
frescos (lechuga en ensaladas) y agua. La dosis infectiva para adultos ha sido
calculada en aproximadamente 108 bacterias, por otra parte en jóvenes y ancianos
la dosis infectiva puede ser más baja.
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Escherichia coli enteropatógena ECEP. Es causa importante de diarrea en los
lactantes particularmente en los países en vías de desarrollo. La ECEP se adhiere
a las células de la mucosa del intestino delgado. Sus factores de virulencia
favorecen la adhesión y en ocasiones penetra a las células mucosas. La infección
por ECEP provoca diarrea acuosa generalmente autolimitada aunque en
ocasiones puede ser crónica.
Patogénesis. El microorganismo produce dos proteínas: la intimina que es
codificada por el gen eae y un factor de adherencia que es codificado por un
plásmido, ambas proteínas permite su unión a los enterocitos y la destrucción de
las microvellosidades intestinales.
Las epidemias causadas por este microorganismo se deben al consumo de agua
contaminada y productos cárnicos. En estudios con voluntarios se encontró que la
dosis infectiva es de 106 microorganismos. La diarrea por ECEP se ha vinculado
con múltiples serotipos específicos de E. coli los cuales pueden ser identificados
mediante la tipificación del antígeno O (somático) y en ocasiones del antígeno H
(flagelar).
Escherichia coli enteroinvasiva EIEC. Este microorganismo se encuentra
estrechamente relacionado con el género Shigella, produce una enfermedad
similar a la shigelosis. La enfermedad se presenta comúnmente en niños de
países subdesarrollados y en personas que viajan a dichos lugares. La EIEC
provoca la enfermedad (diarrea disentérica invasiva) al invadir las células
epiteliales de la mucosa intestinal.
A pesar de que la dosis infectiva para Shigella es de 10 a 100 microorganismos,
en el caso de EIEC la dosis infectiva es de aproximadamente 106 bacterias.
Algunas características importantes de este microorganismo que permiten
diferenciarlo de la cepa típica de E. coli son: No utiliza la lactosa como fuente de
carbono, no descarboxilan la lisina, es inmóvil y anaerogenicos.
La patogenicidad de este organismo se debe a su capacidad para invadir y
destruir el epitelio del colon debido a que es capaz de evadir la lisis en los
fagolisosomas.
Escherichia coli enterohemorrágica EHEC produce verotoxina, denominada así
por su efecto citotóxico sobre las células Vero, una línea de células renales de
monoverde africano. Existen al menos dos variantes antigénicas de la toxina. La
ECEH se ha asociado con colitis hemorrágica, una variedad grave de diarrea; y
con el síndrome urémico hemolítico, enfermedad capaz de producir insuficiencia
renal aguda, anemia hemolítica microangiopática y trombocitopenia. La verotoxina
tiene muchas propiedades similares a la toxina shiga producida por algunas cepas
de Shigella dysenteriae tippo 1; De los serotipos de E. coli que producen la
verotoxina el más común y el único que puede identificarse en muestras clínicas
es el O157:H7. La E. coli O157:H7 no emplea sorbitol y es negativa a la prueba
de MUG.
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La causa más común de esta infección es el consumo de carne sin cocinar o poco
cocinada, particularmente carne picada procesada en grandes cantidades. Los
casos de colitis hemorrágica y sus complicaciones asociadas pueden prevenirse
mediante la cocción completa de la carne
En la siguiente tabla se resumen algunas propiedades y síntomas causados por
las cepas de Escherichia coli antes descritas.
Propiedades y síntomas causados por algunas cepas de Escherichia coli
patógenas
ETEC
EPEC
EHEC
EIEC
Toxina
Lábil/estable Shiga o vero
Invasiva
-
-
-
+
-
+
+
-
Enterohemolisina -
-
+
-
Aspecto de las
heces
Presencia de
leucocitos en
heces
Fiebre
Aguadas
Aguadas
Aguadas muy Mucoides y
sanguinolentas sanguinolentas sanguinolentas
-
-
-
+
baja
+
-
+
Intiminas
Intestino
involucrado
Dosis infectiva
Serotipos
Colon y parte
baja del
delgado
Alta
Delgado
Delgado
Colon
Alta
Alta
O26, O111 y
otros
baja
O157:H7, O26,
Varios
O111 y otros
varios
FUNDAMENTO
La determinación de microorganismos coliformes totales por el método del
Número más Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con producción de ácido y gas al incubarlos a
35°C ± 1°C durante 48 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales
biliares. Esta determinación consta de dos fases, la fase presuntiva y la fase
confirmativa.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de
sodio el cual permite la recuperación de los microorganismos dañados que se
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encuentren presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa
como fuente de carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de
cultivo caldo lactosado bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el
desarrollo de aquellos microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares
como el verde brillante.
La determinación del número más probable de microorganismos coliformes
fecales se realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se
fundamenta en la capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir
gas cuando son incubados a una temperatura de 44.5 ± 0.1°C por un periodo de
24 a 48 h.
La búsqueda de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo
EC, los cuales se siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales
(Agar Mac Conkey, Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las
pruebas bioquímicas básicas (IMViC) a las colonias típicas.
MEDIOS DE CULTIVO Y DILUYENTES
1. Para análisis de agua
Para la preparación del medio de cultivo utilizado en la prueba presuntiva de
muestras de agua o hielo, consultar el cuadro 1.
•
•
•
•
•
•
•
•
5 ó 10 tubos de 22 x 175 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio o
caldo lactosado concentración doble o triple con campana de Durhama.
5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con
campana de Durhamb.
5 ó 10 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC y campana de Durham
o caldo EC MUG con campana de Durham b.
2 cajas Petri con agar para métodos estándar d
2 cajas Petri con agar Eosina azul de metileno c
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIM (opcional)e
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de caldo citrato de Koser o citrato de
Simmons (opcional)e
2. Para análisis de alimentos
1 matraz de 250 mL con 90.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución
amortiguadora de fosfatosa
• 2 tubos de 16 x 150 mm con 9.0 mL de agua peptonada 0.1 % o solución
amortiguadora de fosfatosa
•
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•
•
•
•
•
•
•
•
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo lauril sulfato de sodio
concentración sencilla o caldo lactosado concentración sencilla con campana
de Durhama
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo bilis verde brillante con
campana de Durhamb.
15 tubos de 16 x 150 mm con 10.0 mL de caldo EC o EC-MUG con campana
de Durhamb.
2 cajas Petri con agar para métodos estándard
2 cajas Petri con agar Mac Conkeyc
6 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo RM-VPe
3 tubos de 13 x 100 con 3.0 mL c/u de caldo triptona o agar SIMe
3 tubos de 13 x 100 con 3.5 mL c/u de citrato de Simmons, o caldo citrato de
Kosere
SOLUCIONES, REACTIVOS E INDICADORES
•
•
•
•
•
Frascos gotero con reactivo de Erlich o Kovace
Frascos gotero con indicador rojo de metiloe
Frascos gotero con reactivo alfa naftol VP1e
Frascos gotero con solución de hidróxido de potasio al 40 % VP2e
COLORANTES PARA TINCIÓN DE GRAMd
MATERIAL Y EQUIPO
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Mechero, a,b,c,d,e.
Propipetaa.
Gradillaa,b,c,e.
Balanza granatariaa.
Stomachera
Bolsas para stomacher .
Lámpara de luz ultravioleta de longitud amplia 4 watts. (366 nm)c
Lentes de seguridadc
Pipetas de 10.0 mL estériles con tapón de algodóna.
Pipetas de 1.0 mL estériles con tapón de algodóna.
Pipetas Pasteur estériles a, b, c, d
Asa bacteriológicab,c,d,e
Portaobjetosd
Microscopio ópticod
Termómetro calibradob
Baño de agua a 44.5° ± 0,1°C.b
Incubadora a 35° ± 2,0ºCa.
Horno para esterilizar material de vidrio a 160-180°Ca
Autoclavea
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NOTAS
a
Material necesario al inicio de la práctica.
b
Material necesario a las 48 h. de iniciada la práctica.
c
Material necesario a las 96 h. de iniciada la práctica.
d
Material necesario a las 120 h. de iniciada la práctica.
e
Material necesario a las 144 h. de iniciada la práctica.
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DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN AGUA Y HIELO POTABLES
37°C
24 - 48 h
Tubos con 10.0 mL de caldo lauril sulfato
de sodio (CLSS) triple concentración (3X)
CLSS + 20.0 mL de muestra
2 a 3 asadas/tubo
Siembra con asa bacteriológica de los tubos
positivos (producción de gas) en caldo lactosa
verde brillante bilis 2% y caldo EC
2 a 3 asadas/tubo
44.5°C
37°C
24 – 48 h
Tubos con 10.0 mL de
Caldo Lactosa verde
brillante bilis 2%
Lectura de tubos positivos en
tablas. NMP de coliformes
totales /100 ml de muestra
24 – 48 h
Tubos con 10.0 mL de
Caldo EC o EC-MUG
Lectura de tubos positivos en
tablas. NMP de coliformes
fecales /100 ml de muestra.
Siembra de tubos positivos en
placas de Agar EMB para la
búsqueda de Escherichia
coli
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DETERMINACIÓN DEL NMP DE COLIFORMES EN MUESTRAS SÓLIDAS O ALIMENTOS
Pesar 10.0 g de muestra
en condiciones de asepsia
Homogenizar la muestra
con 90.0 mL de solución diluyente
Realizar 2 diluciones decimales más en
tubos con 9.0 mL de solución diluyente
1.0 mL
1.0 mL
Sembrar por triplicado
cada dilución en tubos
de caldo lauril sulfato de
sodio (1X)
10-1
10-2
10-3
35°C
24 - 48 h
10-1
10-2
10-3
10-1
10-2
Siembra con asa bacteriológica de los tubos
positivos (producción de gas) en caldo lactosa
verde brillante bilis 2% y caldo EC
Tubos con 10.0 mL de CLSS concentración
sencilla (1X) + 1.0 mL de muestra
35°C
44.5°C
24 - 48 h
10-1
10-2
Tubos con 10.0 mL de
Caldo Lactosa verde
brillante bilis 2%
10-3
24 - 48 h
10-1
10-2
10-1
10-2
10-1
10-2
Lectura de tubos positivos en
Lectura de tubos positivos en
Tubos con 10.0 mL de
tablas. NMP de coliformes
tablas. NMP de coliformes
Caldo EC o EC-MUG
fecales /g de muestra.
totales
de muestra
Versión
para/g
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Siembra de tubos positivos en
agar Mac Conkey para
búsqueda de Escherichia coli
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PROCEDIMIENTO
1. Agua y hielo
1.1 Prueba presuntiva
•
Agitar la muestra y transferir volúmenes de acuerdo con el cuadro 1, a cada uno de
los tubos con caldo lauril sulfato de sodio que se hayan seleccionado. Agitar los
tubos para homogeneizar la muestra.
CUADRO 1. Preparación de inóculo con caldo lauril sulfato de sodio
INOCULO
(mL)
•
CANTIDAD DE
MEDIO POR
TUBO (mL)
VOLUMEN DE CALDO LAURIL
MEDIO MAS
TRIPTOSA
INOCULO
REQUERIDO g/L
(mL)
CONCENTRACIÓN
1
10 o más
11 o más
35,6
1X
10
10
20
71,2
2X
10
20
30
53,4
1.5 X
20
10
30
106,8
3X
100
50
150
106,8
3X
100
35
135
137,1
3.5 X
100
20
120
213,6
4X
Incubar los tubos a 35 ± 0,5°C. Examinar los tubos a las 24 h. y observar si hay
formación de gas (desplazamiento del medio en la campana de Durham); si no se
observa producción de gas, incubar 24 h. más.
1.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
•
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva, a otro tubo de 16 x150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante
(brila), con campana de Durham.
•
Agitar los tubos para su homogeneización.
•
Incubar a 35 ± 2°C durante 24 a 48 h..
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Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
•
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez (crecimiento)
y producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h..
•
Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de
organismos coliformes totales/100 mL.
1.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.
•
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC
conteniendo campana de Durham.
•
Agitar los tubos para su homogeneización.
•
Incubar a 44.5 ± 0.1°C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h.
•
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe crecimiento y
producción de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
•
Consultar la tabla 1 ó 2 de NMP para conocer el número más probable de
organismos coliformes fecales/ 100 mL.
Control de calidad
1. Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y una de
Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las muestras.
1.4 Prueba confirmativa para Escherichia coli
•
Tomar una asada de cada uno de los tubos positivos en caldo EC y sembrar por
estría cruzada en agar eosina azul de metileno para su aislamiento.
•
Incubar las placas invertidas a 35°C por 18-24 h.
•
Seleccionar dos colonias de cada placa con la siguiente morfología colonial:
Colonias con centro negro, planas con o sin brillo metálico. Si no hay colonias con
morfología típica, probar una o más colonias lo más parecido E. coli de cada placa y
sembrarlas en agar cuenta estándar para realizar las pruebas de morfología
microscópica y pruebas bioquímicas.
•
Incubar las placas a 35°C por 18-24 h.
•
Hacer un frotis y teñirlo por Gram. Observar al microscopio la presencia de bacilos
cortos o cocobacilos Gram-negativos.
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1.4.1 Identificación bioquímica de Escherichia coli mediante pruebas (IMViC).
a. Producción de indol (I)
•
Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35°C por 24 ± 2 h.
•
Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs.
•
La presencia de una coloración roja en la superficie del tubo se considera una
prueba positiva.
b. Producción de ácidos mixtos (Rojo de metilo, RM)
•
Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h.
•
Adicionar 5 gotas de solución de rojo de metilo.
•
Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color
amarillo es una prueba negativa.
c. Producción de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
•
Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35°C por 48 ± 2 h.
•
Adicionar 0.6 mL de solución VP1 y 0.2 mL de solución VP2 y agitar.
•
Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba
positiva cuando se desarrolla un color rosa en la superficie.
d. Utilización del citrato (C)
•
Inocular un tubo con caldo citrato de Koser o Simmons un inóculo ligero para evitar
turbiedad en el tubo (opcional: puede utilizarse citrato de Simmons)
•
Incubar a 35°C por 96 h.
•
El desarrollo del cultivo que se observa con la turbiedad del medio, se considera una
prueba positiva.
NOTAS
Para determinar la producción de indol, en lugar del caldo triptona puede utilizarse al
agar SIM. Este medio se inocula por picadura con el asa bacterioogíca de forma recta.
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Se incuba a 35°C por 24± 2 h. Finalizado el periodo de incubación se adiciona el
reactivo de Kovac o Erlich cuyo fundamento es el mismo.
Para determinar la utilización del citrato de sodio como única fuente de carbono,
también se puede utilizar el agar citrato de Simmons en forma inclinada, el cual se
inocula en la superficie (pico de flauta). Se incuba a 35°C de 24 a 48 h. La presencia
de una coloración azul debida al vire del indicador que contiene el medio, indica prueba
positiva
1.4.2 Prueba confirmativa opcional para Escherichia coli utilizando caldo EC-MUG
(4 metil-umbeliferil-β
β -D-glucuronido)
FUNDAMENTO
Alrededor del 94% de las cepas de Escherichia coli incluso las cepas no productoras de
gas producen la enzima beta-glucuronidasa (GUD), la cual rompe el sustrato específico
4-metilumbeliferil-beta-D-glucurónido (MUG) en 4-metilumbeliferona (MU); el cual al ser
expuesto a una fuente de luz ultravioleta (UV) de onda larga (365 nm) produce una
fluorescencia azul fácil de observar. Cuando el MUG es incorporado al caldo EC se
puede identificar Escherichia coli.
a. Prueba confirmativa
•
A partir de la fase presuntiva (inciso 1.1.) y de cada tubo que muestre formación de
gas , tomar una asada y sembrar en un número igual de tubos con medio de
confirmación EC-MUG.
•
Incubar a 44,5 ± 0,2°C en baño de agua durante 24 h., observar si hay formación de
gas; si no se observa la formación de gas continuar la incubación 24 h. más.
•
Irradiar los tubos con una fuente de luz UV, observar fluorescencia y hacer la
lectura.
•
Utilizar estos resultados para calcular el número más probable (NMP) de E. coli.
Control de calidad
Inocular en dos tubos con caldo EC-MUG una cepa de E. coli como control positivo y K.
pneumoniae como control negativo.
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2. Alimentos
2.1 Preparación de la muestra.
•
Moler 10.0 gramos de la muestra en un picador 2 veces o con cubiertos estériles y
mezclar.
•
Adicionar el alimento a 90.0 mL de agua peptonada al 0.1 %, licuar y dejar en
reposo de 2-3 minutos.
•
Realizar diluciones hasta 10- 3 g/mL con agua peptonada al 0.1 %. En caso de
trabajar con muestras congeladas, descongelarlas previamente entre 2° y 5 ° C.
2.1.1 Prueba presuntiva.
•
Añadir 1.0 mL de la dilución 10- 1 g/mL a cada uno de 3 tubos con 10.0 mL de caldo
lauril sulfato de sodio.
•
Añadir 1.0 mL de las diluciones 10- 2 g/mL y 10- 3 g/mL a dos series de 3 tubos cada
una con caldo lauril sulfato de sodio.
•
Incubar a 35-37°C durante 24-48 h.
•
Los tubos después de la incubación, se registrarán como positivos si presentan
crecimiento y producción de gas.
2.2 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes totales
•
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva a otro tubo de 16 x 150 mm que contiene caldo de bilis verde brillante
(brila), con campana de Durham.
•
Agitar los tubos para su homogeneización.
•
Incubar a 35 ± 2°C durante 24 a 48 h.
•
Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe crecimiento y
producción de gas, después de un período de incubación de 24 a 48 h.
•
Consultar las tablas de NMP que se encuentran en el anexo para conocer el
número más probable de organismos coliformes totales por mL.
2.3 Prueba confirmativa de microorganismos coliformes fecales.
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Microbiológico de Alimentos. 2ª ed. Facultad de Química, UNAM. México.
•
Transferir de 2 a 3 asadas de cada tubo positivo obtenido durante la prueba
presuntiva (caldo lauril sulfato de sodio) a un tubo de 16 x 150 mm, con caldo EC
conteniendo campana de Durham.
•
Agitar los tubos para su homogeneización.
•
Incubar a 44.5 ± 0.1°C en incubadora o un baño de agua durante 24 a 48 h.
•
Registrar como positivos todos los tubos en donde se observe turbidez y producción
de gas después de un período de incubación de 24 a 48 h.
•
Consultar la tabla de NMP (ANEXO) para conocer el número más probable de
organismos coliformes fecales por mL.
Control de calidad
•
Inocular a dos tubos con caldo EC una cepa de E. coli como control positivo y
una de Enterobacter aerogenes como control negativo e incubar con las
muestras.
2.4 Prueba confirmatoria de Escherichia coli.
•
Confirmar la presencia de Escherichia coli en por lo menos el 10% de las pruebas
con resultados positivos de coliformes fecales; sembrar en placas de agar
McConkey a partir de los tubos que demostraron la presencia de gas en la prueba
confirmativa.
•
Incubar las placas a 35 ± 0.5°C durante 24 ± 2 h., observar las colonias típicas
fermentadoras de color rojo rodeadas de un halo opaco de precipitación de sales
biliares.
•
Hacer tinción de Gram para observación de la morfología de las bacterias.
•
Seleccionar 1 o más colonias aisladas para realizar pruebas IMViC.
Todos los cultivos que:
•
Fermenten la lactosa con producción de gas dentro de las 48 h. a 35°C.
•
Sean bacilos o cocobacilos Gram-negativos no esporulados
Se obtenga las siguientes combinaciones para el IMVIC: Biotipo 1(++--) o Biotipo 2 (+--) son consideradas como Escherichia coli.
• Calcular el NMP de E. coli basándose en la proporción de los tubos positivos de
caldo EC.
•
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CÁLCULOS Y EXPRESIÓN DE RESULTADOS
Calcular la densidad microbiana con base en el número más probable conforme al
procedimiento señalado en la tabla 1, (que se muestra a continuación y es utilizado para
el análisis de agua), para estimar la población de bacterias coliformes totales, bacterias
coliformes fecales y Escherichia coli de acuerdo con las diluciones empleadas.
Expresar en NMP/g o mL para alimentos y NMP/100 mL para agua. En el caso de usar
volúmenes de 20 mL de muestras de agua en 5 tubos o 10 mL de muestras de agua en
10 tubos, utilizar las siguientes tablas:
TABLA 1. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 5 tubos con
20 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
positivos
0
1
2
3
4
5
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,6
4,6
8,0
>8,0
95% de Límite de Confianza (aproximado)
Inferior
Superior
0
3,0
0,05
6,3
0,3
9,6
0,8
14,7
1,7
26,4
4,0
Infinito
TABLA 2. Índice del NMP con 95% de límite de confianza para varias
combinaciones de resultados positivos y negativos cuando se usan 10 tubos con
10 mL de muestra de agua o hielo.
No. de Tubos
Positivos
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
NMP/100 mL
<1,1
1,1
2,2
3,6
5,1
6,9
9,2
12,0
16,1
23,0
>23,0
95% de Límite de Confianza (aproximado)
Inferior
Superior
0,0
3,0
0,03
5,9
0,26
8,1
0,69
10,6
1,3
13,4
2,1
16,8
3,1
21,1
4,3
27,1
5,9
36,8
8,1
59,5
13,5
Infinito
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BIBLIOGRAFÍA
NORMA OFICIAL MEXICANA. NOM-145-SSA1-1995. Productos cárnicos
troceados y curados. Productos cárnicos curados y madurados. Disposiciones
y especificaciones sanitarias. Apéndice normativo B. De la estimación de la
densidad microbiana por la técnica de número más probable.
CCAYAC-M-004 (2006) “Estimación de la densidad microbiana por la técnica
del número mas probable, detección de coliformes totales, cliformes fecales y
Escherichia coli por el número mas probable”
Food and Drug Administration (2003) “Bacteriological Analytical Manual”. 9th
ed. Arlington, VA: AOAC.
Madigan, M T y Martinko, J M., Brock, Biology of Microorganisms, 11a ed.
2006, pp 935-936
Brooks, Geo F., Batel, Janet S. y Morse, Stephen A., Microbiología Médica de
Jawetz. Manual Moderno 17a Edición 2002, pp 274-275
Kornacki J.L. & Johnson J.L. (2001) “Enterobacteriaceae, Coliforms, and
Escherichia coli as Quality and Safety Indicators”. In: Compendium of
Methods for the Microbiological Examination of Foods. 4th ed. Downs F.P. & Ito
K. (Eds.) APHA. Washington. 69-82.
International Commission on Microbiological. Specifications of Foods (2005)
“Microorganisms in Foods 6” Chapman & Hall. 2nd ed.
http://www.cfsan.fda.gov/~ebam/bam-1.htmL
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