RFLP

Definición
- Los marcadores genéticos son polimorfismos en
genes o en general en secuencias de ADN que
permiten diferenciar individuos, poblaciones o
especies.
- Deben ser variables
Usos
- Genética de poblaciones
- Programas de mejora
- Mapas genéticos
- Filogenias
- Estudios evolutivos
- Medicina forense
- Trazabilidad
...
Materiales y Métodos usados en el
estudio de los marcadores genéticos
1.- Electroforesis
Materiales y Métodos usados en el
estudio de los marcadores genéticos
1.- Reacción en Cadena de la Polimerasa
Tipos de marcadores genéticos
- Alozimas
- RFLP
- AFLP
- VNTR
-RAPD
-.......
ALOZIMAS
Definición: diferentes formas de una enzima
codificada por alelos de un mismo locus.
De manera resumida, los pasos consisten en
hacer una extracción de proteínas de las plantas
a analizar y posteriormente llevar a cabo una
una electroforesis en gel de almidón.
El polimorfismo se detecta añadiendo el sustrato
de la enzima al gel y mediante reacciones
químicas colorear, detectar y localizar las
enzimas específicas, que aparecerán en el gel
como bandas.
Las diferencias en la movilidad electroforética
de las bandas, pondrán de manifiesto la
variabilidad genética en los genes (sus alelos)
estudiados.
ALOZIMAS
V
A
+
-
Esquema general del proceso
ALOZIMAS
Aplicaciones :
9 Genética de poblaciones
9 Marcador de líneas y stocks comerciales
9 Controversias filogenéticas
9 Uso en Sistemática
9 Relación alozimas con caracteres cuantitativos
- Ventajas :
9 Rapidez y bajo coste
9 Importante base de datos
- Inconvenientes
No toda la variabilidad genética se ve reflejada en
variabilidad proteica a nivel de bandas alozímicas. Entre las
razones para esta subestima de la variabilidad genética,
están que los cambios en la composición aminoacídica de las
proteínas no implican cambios en la movilidad
electroforética en los geles y, por otra parte, la degeneración
del código genético implica que cambios en la tercera base
de los codones no implican variaciones en la secuencia de
aminoácidos una vez traducido el ARN mensajero.
Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restricción
(RFLP)
1.- Digestión del ADN
- Enzimas de restricción: Arber, Smith y Nathans: Nobel en 1978
- Utilizan las bacterias para cortar ADN foráneo
- Cortan en unas secuencias del ADN: dianas de restricción
- Tipo II: reconocen la diana y cortan en ese punto
G-A-A-T-T-C
C-T-T-A-A-G
G
C-T-T-A-A
A-A-T-T-C
G
Eco RI
Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restricción
(RFLP)
Los RFLPs expresan las diferencias entre individuos en sitios
concretos del ADN que reconocen diferentes enzimas de
restricción. Estas enzimas cortan en secuencias específicas del
DNA (denominadas dianas de restricción), dando lugar a
fragmentos de tamaños diferentes que pueden ser analizados
mediante electroforesis en geles de agarosa.
Los pasos necesarios para su análisis son:
1.- Extracción de DNA.
2.- Fragmetación del DNA mediante la digestión con enzimas
de restricción
3.- Separación de los fragmentos generados mediante
electroforesis en geles de agarosa.
4.- En algunos casos, se puede transferir e inmovilizar las
bandas del gel en membranas y detectar el polimorfimos
mediante hibridación del ADN en la membrana con sondas
marcadas.
El uso de la PCR ha posibilitado la generación de nuevos
marcadores de elaboración sencilla. Por ejemplo, se puede
amplificar por PCR un gen de interés o un fragmento
determinado del genoma y hacer una digestión con enzimas de
restricción para evaluar la aparición de RFLPs (PCR-RFLP).
Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restricción
(RFLP)
Tipos de polimorfismo (I)
• Polimorfismo en la secuencia
1
2
Electroforesis
1
2
Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restricción
(RFLP)
Tipos de polimorfismo (II)
• Polimorfismo en el tamaño de los fragmentos
(inserciones, deleciones, duplicaciones...)
1
1
Electroforesis
1
2
Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restricción
(RFLP)
Uso de sondas para detección de polimorfismos en secuencias
determindas
1
Sonda
2
Sonda
Electroforesis
Southern
1
2
1
2
Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restricción
(RFLP)
Enfermedad fúngica en V. vinifera:
(Oidio: Powdery mildew)
Uncinula necator
- Pérdidas en la producción
- No existen comercialmente cultivares resistentes a U. necator
- Tratamientos fungicidas: elevado coste e impacto ambiental
- Gen de resistencia a U. necator: Run1
- Es un gen dominante: los homocigotos y heterocigotos para
este gen presentan resistencia a este hongo. Los que no lo
lleven son susceptibles.
- Cruzamientos entre la especie salvaje de uva Muscadinia
rotundifolia (resistente a U. necator) y V. vinifera
-Estrategia para localizar genes similares a Run1: generar
sondas por PCR de genes (o partes de ellos) de resistencia y
usarlas en Southern-RFLP.
- Resultados:
Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restricción
(RFLP)
…continuación
Marcadores: GLP1-12
MHD145
MHD98
Estos marcadores se pueden generar por PCR fácilmente,
marcarlos y usarlos como sondas sobre ADN genómico
digerido, la presencia de banda indica resistencia al hongo.
Elevado interés
comercial
Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restricción
(RFLP)
A partir de ahí otras estrategias:
Directamente mediante el análisis del producto
de PCR de una planta que se desea conocer su
resistencia o mediante PCR-RFLP.
Polimorfismos de Longitud en
Fragmentos de Restricción
(RFLP)
MAPA DE LIGAMIENTO
Polimorfismos de Longitud
en Fragmentos Amplificados
(AFLP)
El polimorfismo de fragmentos amplificados aleatoriamente
(AFLP) se fundamenta en la amplificación selectiva de los
fragmentos obtenidos en la digestion del ADN genómico con
enzimas de restriccion. El proceso consta de los siguientes pasos:
- Digestión del ADN con dos enzimas de restricción que generan
dos extremos cohesivos con diferentes secuencias.
- Ligamiento a estos extremos de unos adaptadores (25-30 pb) que
encajan en los extremos cohesivos.
- Amplificación selectiva con dos cebadores de secuencias
idénticas a cada uno de los adaptadores más tres nucleótidos
adicionales en el extremo 3’, con lo que se obtiene una reducción
drástica del número de fragmentos amplificados.
De esta forma se generan múltiples bandas que responden a
fragmentos de origen aleatorio en el genoma y que se resuelven en
geles desnaturalizantes de acrilamida o en analizadores de
fragmentos. Al igual que en los RAPD, para la generación de
estos marcadores no es necesaria información previa, son
generalmente dominantes y no son transferibles, pero permite la
generación de gran número de marcadores con pocas reacciones.
Requiere extracciones de DNA de gran calidad e infraestructura
especializada.
Polimorfismos de Longitud
en Fragmentos Amplificados
(AFLP)
Esquema general del proceso
ADN genómico
Digestión con enzimas
de restricción
Unión a adaptadores
Amplificación selectiva
Geles de poliacrilamida o
analizadores de fragmentos
Polimorfismos de Longitud
en Fragmentos Amplificados
(AFLP)
Ejemplo
Gen Run1
Repeticiones en Tándem de
Número Variable
(VNTR)
DNA eucariótico
Genes funcionales
DNA repetido
DNA espaciador
Secuencias sin función
conocida
Secuencias funcionales
Repeticiones de la
heterocromatina
centromérica
Repeticiones en Tándem
de Número Variable
Minisatélite
Secuencias
transponibles
Microsatélite
Repeticiones en Tándem de
Número Variable
(VNTR)
- Los microsatélites o SSR (Simple Sequence Repeats) se
basan en la amplificación por PCR usando cebadores de una
región microsatélite. El microsatélite consiste en repeticiones
de di- tri- o tetranucleótidos (aunque puede ser más
complejo) en tándem, por ejemplo, (CG)n.
- El polimorfismo en el número de repeticiones (n) da lugar a
fragmentos amplificados de diferente longitud. Estas
diferencias en longitud pueden ser analizadas en geles de
poliacrilamida o analizadores de fragmentos. Los primers o
cebadores están muy conservados dentro de la especie e
incluso parcialmente entre especies afines. Se analizan por
PCR y posterior electroforesis. Muy usados en identificación
de individuos y genética de poblaciones.
Repeticiones en Tándem
de Número Variable
(VNTR)
Esquema general del proceso
MICROSATÉLITES
Amplificación
por PCR
1
2
1
Electroforesis de
los productos
amplificados
2
Repeticiones en Tándem
de Número Variable
(VNTR)
MICROSATÉLITES
Electroforesis mostrando polimorfismo
para 3 microsatélites cuyos alelos migran
a diferentes distancias en el gel.
ADN polimórficos amplificados al azar
(RAPD)
EL polimorfismo de productos amplificados al azar
(RAPDs) es el más sencillo de analizar. Se generan por la
amplificación del DNA con un cebador de secuencia corta
(10-12 bases) y aleatoria, no es necesario conocimiento
previo de secuenciacion y utiliza como sustrato poco DNA.
Su sencillez y bajo coste está contrapesada por sus
limitaciones; herencia dominante, baja reproducibilidad
entre laboratorios… Además, la detección en geles de
agarosa puede producir resultados erróneos, ya que
bandas que procedan de diferentes puntos de
amplificación de parecida longitud sean indistinguibles y
den una sola banda en el gel. Sin embargo, la ventaja de
usar estos geles, es la sencillez con la que las bandas
pueden ser extraidas, clonadas y secuenciadas, por lo que
se obtiene la secuencia del fragmento amplificado. A partir
de ésta, se puede rediseñar los primers para la
reproducción de este marcador.
ADN polimórficos amplificados al azar
(RAPD)
Esquema general del proceso
1
3
2
4
5
ADN polimórficos amplificados al azar
(RAPD)
1
3
2
4
5
Electroforesis mostrando RAPD.
ANEXOS
Mapa genético V. rupestris y V. arizonica
Doucleff et al., 2004
475 marcadores:
410 AFLP
32 RAPD
9 microsatelites (SSR)
...otros
Determinación Sexual in Vitis spp.
Localizado en grupo de ligamiento 14 (junto a otros marcadores)
Dalbó et al., 2000
277 RAPDs
25 microsatelites
12 AFLPs
...otros
PROYECTO GENOMA
¾ Etapas
1ª ) Mapas de ligamiento usando marcadores
2ª) Mapeo de genes relacionados
con caracteres cuantitativos
3ª) Desarrollo de mapas físicos
MAPAS FÍSICOS
FISH: Hibridación In Situ de Fluorescencia
MAPAS FÍSICOS
FISH: Hibridación In Situ de Fluorescencia
Retrotransposón
Gret1 en V. vinifera
(Sofia Pereira et al., 2005)