Fraccionamiento de tejido_carbo, proteinas y Acidos nucleicos

Fraccionamiento de tejidos en sus principales constituyentes: carbohidratos, lípidos, proteínas y
ácidos nucleicos.
Ricardo Benítez Benítez
1.1. OBJETIVOS:
a) Empleo de las solubilidades diferenciales y de la centrifugación como método para el
fraccionamiento de un tejido animal en sus principales constituyentes.
b) Comparación de los diferentes tejidos desde el punto de vista de sus componentes
principales.
1.2. FUNDAMENTO TEORICO:
Debido a las diferencias químicas que existen entre las moléculas de carbohidratos, lípidos
proteínas y ácidos nucleótidos, estas presentan diferente solubilidad en solvente orgánicos y
además en ácidos del tipo del tricloroacético según la temperatura.
Es posible entonces utilizar tales solubilidades diferenciables para separarlos, una vez que los
tejidos han sido triturados y se han roto sus membranas.
1.2.1. Acción del ácido tricloroacético a baja temperatura:
Sobre carbohidratos. A baja temperatura los monosacáridos son estables en medio ácido,
mientras que si se tratan en caliente, sufren deshidratación produciéndose los furfurales.
Los polisacáridos en medio ácido sufren hidrólisis del enlace glucosidico, reacción que se
aumenta a su velocidad a media que se eleva la temperatura. A temperaturas inferiores a 4 ºC,
su velocidad es tan lenta que para fines prácticos se considera que no ocurre reacción.
En general se puede decir que los carbohidratos son solubles en solución de ácido
tricloroacético al 10% a temperaturas inferiores a 4ºC y que no sufren cambios químicos en
estas condiciones.
Sobre lípidos. Por definición estos compuestos son poco solubles en soluciones acuosas y no
son extraídos si se trata el tejido con soluciones acuosas de ácido tricloroacético.
Sobre proteínas. Estas forman sales insolubles en ácidos como tricloroacético o perclórico, por
lo tanto no son solubles en soluciones de ácido tricloroacético al 10% en frió.
Sobre ácidos nucleicos. Lo mismo que las proteínas, estos ácidos son insolubles en soluciones
frías de ácido tricloroacético. Por otra parte el ácido deoxiribonucleico (DNA) esta unido a
histonas, lo cual lo hace más insoluble en estas condiciones.
En resumen, al tratar un tejido previamente triturado, con ácido tricloroacético al 10% y a 4ºC y
someter a centrifugación la suspensión resultante, en el sobrenádate se obtiene los azucares,
mientras que los lípidos, proteínas y ácidos nucleicos quedan en residuo.
1.2.2. Acción del etanol-éter-cloroformo (2-2-1, v/v):
Si el residuo anterior se suspende en una solución de NaCl al 10% y se calienta en baño de
María (92ºC) durante 40 minutos, se desnaturalizan las proteínas, en tanto que los ácidos
nucleicos principalmente el ribonucleico (RNA)- quedan en solución. Por este procedimiento es
posible entonces separar las proteínas de los ácidos nucleicos. Si el sobre nadante se le agrega
ahora etanol absoluto en un volumen igual al doble de la solución original y se enfría en baño de
hielo durante 10 minutos, se obtiene un precipitado que puede ser separado por centrifugación y
que contiene los ácidos nucleicos.
1.3. REACTIVOS:
ATA al 10%
Etanol del 95%
NaCl al 10%
arena lavada
etanol- éter-cloroformo (2:2:1)
1.4. PROCEDIMIENTO:
Cada grupo hará el fraccionamiento químico sobre un tejido determinado. Para comparar los
diferentes tejidos desde el punto de vista del contenido de carbohidratos, lípidos y proteínas y
ácidos nucleicos, deberá cotejar sus resultados con los obtenidos por los otros grupos.
NOTA: las diferentes fracciones obtenidas en esta práctica, deben guardarse para la siguiente
sesión de laboratorio.
1.4.1. Diagrama esquemático del método para fraccionar un tejido en sus constituyentes (Pág. 4)
A cada grupo se le entregara una muestra de tejido en ATA al 10% con los siguientes datos:
- peso del tejido
- origen del tejido
- ATA al 10% adicionando (1.5 ml/ de tejido)
1.5. CALCULOS Y RESULTADOS:
Compare sus resultados con los obtenidos los demás grupos y con los datos bibliográficos. De
acuerdo a la función fisiológica y a los resultados, diga cuales son los tejidos que
cuantitativamente contienen más proteínas, lípidos, ácidos nucleicos y carbohidratos.
1.6. PREGUNTAS:
- ¿Por que se recomienda mantener los tejidos que se fraccionan a baja temperatura?
- ¿Qué sucede al contenido celular si la temperatura a que se mantiene es de 37 ºC?
- ¿Cuál es el fundamento de la centrifugación? Haga una explicación breve de los principios.
1.7. BILBIOGRAFIA:
Clark J.M. (editores) Experimental Biochemistry; W. H. Freeman and Company, San Francisco,
Pág.. 125 (1964).
Rendina G. Tecnicas de Bioquímica Aplicada, editorial Interamericana, Pág... 94 (1974).
De Duve Ch y Berthet J. Iternational Review of Cytology III, Academic Press, pag, pag. 225
(1954).
W B. Sanders Co., Handbook of biological Data, pag. 71-72 (1956).