En la mitosis los microtúbulos ensamblan el aparato mitótico

En la mitosis los microtúbulos ensamblan el aparato
mitótico, estructura que es esencial para distribuir el
material genético a las células de la siguiente generación.
El aparato mitótico consiste de tres tipos de microtúbulos,
astrales, del cinetocoro y polares
Los MTs astrales irradian desde el centrosoma (en amarillo). Contribuyen a la separación de los polos y al
posicionamiento del huso. Los MTs del cinetocoro (en rojo) forman ramilletes (fibras del cinetocoro) que se
unen a los cinetocoros de los cromosomas. Los MTs polares (en azul) se interdigitan en el ecuador del huso
y permiten generar fuerzas que regulan la separación entre los polos.
Lodish et al., 2004
Microtúbulos
dinámicos
+
moléculas
motoras
formación del huso
captura y alineamiento de cromosomas
transporte de cromátides hacia los polos
En las células animales el aparato mitótico se ensambla
a partir de MTs nucleados en los centrosomas
Los centrosomas se duplican antes de comenzar la mitosis, al final de la fase G1.
Se requiere de la actividad de Cdk2 y de las ciclinas A y E (activas durante G1/S y S).
Lodish et al., 2004
En interfase el centrosoma ocupa una posición perinuclear
núcleo
El centrosoma consiste en un par de centríolos
inmersos en una pericentriolar matriz fibrosa
centrosomas duplicados
La matriz fibrosa pericentriolar contiene numerosas copias del
complejo γ-TuRC (gamma-tubulin ring complex)
El complejo γ-TuRC consiste de proteínas que estabilizan un anillo
de subunidades de tubulina γ a partir del cual se ensamblan los
heterodímeros α/β. Los microtúbulos ensamblados a partir del
centrosoma poseen una polaridad uniforme, con su extremo de
rápido crecimiento (+) distal.
En profase, los microtúbulos incrementan el dinamismo e
invaden el centro de la célula
Los complejos Cdk-ciclinas mitóticas (= MPF) incrementan el dinamismo de los microtúbulos durante
profase mediante la fosforilación y activación de catastrofinas y la inactivación de MAPs estabilizadoras.
Los MTs de metafase son mas
dinámicos que los de interfase (FRAP)
Las catastrofinas son proteínas que se unen a los extremos (+) de los MTs (ej. miembros de la familia de
kinesinas 13 como MCAK=XKMC1) e incrementan los eventos de catástrofe. Las MAPs (ej. MAP2, tau) se
asocian a la pared de los MTs y disminuyen la inestabilidad dinámica. En general la fosforilación de las
MAPs por Cdks provoca su disociación del MT.
Kinesinas-C contribuyen a alinear los MTs polares y traccionan
sobre los centrosomas
Las kinesinas-C poseen las cabezas motoras en el terminal
carboxilo y se translocan hacia el extremo (-) de los microtúbulos.
La actividad de kinesinas-C
contribuye a alinear los MTs
polares y además tracciona
sobre los polos.
Lodish et al., 2004
Kinesinas bipolares (tetraméricas) y dineínas contribuyen a
la separación de los centrosomas
BimC, Eg5 son kinesinas bipolares que se unen a MTs polares
antiparalelos y se translocan hacia el extremo + de los MTs.
Junto a las las dineínas
corticales las kinesinas
bipolares separan los
polos en prometafase
y forman el huso bipolar.
dineína
cortical
Lodish et al., 2004
El rol de kinesinas en el ensamble del huso mitótico ha sido examinado
in vitro a partir de extractos de huevos de Xenopus
La inactivación de la kinesina bipolar Eg5 con la droga monastrol produce un huso
monopolar. Los microtúbulos se marcaron empleando tubulina unida a rodamina (en
rojo). El DNA se marcó con Hoechst (azul).
+ monastrol
huso normal
huso monopolar
T. Mitchison lab
La estructura y dinámica del aparato mitótico depende de la actividad
coordinada y combinatorial de diferentes motores
Dineínas corticales que actúan sobre los MTs astrales y kinesinas-C (-) que actúan sobre los MTs polares
antiparalelos de la zona media generan fuerzas opuestas que determinan la longitud del huso.
+
interfase/profase
La asociación de kinesinas bipolares (+) a los MTs antiparalelos en la zona media
contribuye a una nueva elongación del huso hasta alcanzar un estado estacionario.
prometafase/metafase
Sharp et al, Nature 2000
La ruptura del balance de fuerzas entre motores de distinta
polaridad altera la longitud del huso
En las figuras se muestran los husos mitóticos de células de
levadura marcadas con un anticuerpo anti-tubulina (en verde)
normal spindles
overexpression
of kinesin-C
overexpression
of bipolar kinesin
(B) células de levaduras normales
(C) células que sobreexpresan la kinesina-C Kar3p, de polaridad (-) exhiben el acortamiento del huso.
(D) células que sobreexpresan la kinesina bipolar Cin8p, de polaridad (+) revelan el alargamiento del huso.
captura de cinetocoros por microtúbulos del huso
transporte y alineamiento de cromosomas en la
placa ecuatorial
Prometafase: la inestabilidad dinámica de los microtúbulos y la actividad
de motores (+) son esenciales para la captura de los cinetocoros
dinámica de los microtúbulos
rol de motores de polaridad (+)
CENP-E
CENP-E: centromeric protein-E
Lodish et al., 2004
Prometafase: los cromosomas transportados a la placa ecuatorial
exhiben un movimiento oscilatorio
Los movimientos oscilatorios resultan de la actividad de: a) motores asociados al cinetocoro y a centrosomas,
que al actuar sobre los MTs del cinetocoro traccionan los cromosomas hacia los polos; b) motores unidos a la
cromatina que se translocan hacia el extremo (+) de los MTs polares y empujan los brazos de los cromosomas
hacia la placa de metafase; c) eventos de polimerización y depolimerización de los MTs del cinetocoro.
(c)
(b)
Lodish et al., 2004
El cinetocoro es un complejo proteico ensamblado
sobre la región centromérica de los cromosomas
MCAK es una kinesina-M asociada
a la capa externa del cinetocoro y
que depolimeriza el MT.
CENP-E es una kinesina (+) asociada
a la corona fibrosa del cinetocoro.
Proteínas de control o
checkpoint mitótico
también se localizan
en el cinetocoro.
(MCAK: Mitotic Centromere-Associated Kinesin)
Lodish et al., 2004
DNA centromérico. Levaduras
Alberts et al., 2002
En metafase el cinetocoro de cada cromátide ancla
microtúbulos del correspondiente polo
microscopía electrónica de
barrido de cromosoma de metafase
Inmunolocalización de cinetocoros (rojo)
centrómeros
MTs
cromosomas
cromátides
Metafase: los microtúbulos de los cinetocoros exhiben
un estado dinámico de "treadmilling"
Demostración experimental del treadmilling. Se muestra un huso mitótico ensamblado in vitro.
Los MTs se marcaron con tubulina-rodamina (rojo) y los cromosomas con Hoechst (azul). La
marca verde representa una fracción de tubulina-fluoresceína activable por un pulso de luz.
Note que la fluoresceína activada se desplaza hacia el polo izquierdo.
DNA
microtúbulos
fotoactivación de la
fluoresceína unida a la
tubulina mediante
un pulso de UV
suministrado dentro de
la región marcada (verde)
1.5min
En el "treadmilling" la adición de subunidades de
tubulina en el extremo (+) es balanceado por el
desensamble de subunidades en el extremo (-).
2.5min
Visualización del ¨treadmilling¨ de MTs de metafase
empleando ¨trazas¨de tubulina fluorescente
La técnica consiste en agregar a la preparación de tubulina “trazas” de tubulina
fluorescente (rojo), de modo que ésta se incorpora a los microtúbulos con baja
frecuencia, generando un patrón de trazas o “speckles” fluorescentes.
A
B
C
pendiente de la línea formada
por la posición de las trazas a
distintos tiempos.
distancia
*
En (A) se esquematiza un microtúbulo marcado con ¨trazas¨(speckles) de tubulina fluorescente (en rojo). En (B) se muestra
una fotografía del huso marcado marcado con las trazas de tubulina fluorescente. La posición de las marcas fluorescentes
individuales en función del tiempo se visualizan en franjas (slices) alineadas del huso, registradas por videomicroscopía
(asterisco) (C). La velocidad calculada de translocación de la tubulina en los microtúbulos es de 0.75 μm/min.
Mitchison & Salmon, Nature Cell Biol 2001
tracción de los cinetocoros hacia los polos
Anafase A: acortamiento de la fibra del cinetocoro en ambos extremos de los MTs
Anafase B: separación de los polos por acción de kinesinas bipolares
Transición metafase
anafase
separación de las cromátides
metafase
anafase
Distintas fuerzas gobiernan el movimiento de los cromosomas
durante la anafase
ANAFASE A: Depolimerización de los
MTs de los cinetocoros
en los cinetocoros y en los polos.
ANAFASE B: Deslizamiento entre MTs antiparalelos
polares en el plano ecuatorial mediado por kinesinas
(+). También fuerzas de tracción ejercidas por
dineínas corticales.
Evidencia experimental del acortamiento de los MTs de los
cinetocoros en el extremo (+).
Experimentos de fotodestrucción (photobleaching) de la fluorescencia revelan la depolimerización
de los MTs en el cinetocoro, evento que no requiere de ATP y actividad motora.
región
fotodestruída
Gorbsky et al JCB 1988
El acortamiento de los MTs del cinetocoro también es demostrado
empleando proteínas fluorescentes fotoactivables
Tubulina conjugada a fluoresceína fotoactivable es microinyectada en células e incorporada al huso.
Al comienzo de la anafase, la fluoresceína es activada (zona verde). Note el avance de los cromosomas
sobre la marca y también el movimiento hacia el polo (indicado con una flecha).
MCAK es una kinesina asociada al cinetocoro que
promueve la depolimerización del extremo (+) de los
MTS. CENP-E es una kinesina que mantiene unidos
los cromosomas a los MTs durante su acortamiento.
Zhai et al JCB 1995
Identificación de kinesinas que
inducen el desensamble de los
MTs en el cinetocoro y los polos
En este experimento, se demuestra que la kinesina KLP10A
es requerida para el flujo de tubulina hacia los polos.
La inhibición de KLP10A con un anticuerpo, inhibe el flujo.
Kinesinas-M, como por ejemplo MCAK,
XKCM1, KLP10A y KLP59C, se unen a
los extremos de los MTs e inducen su
desensamble.
pole
En estas kimografías de MTs con trazas de tubulina-rodamina
se demuestra que la kinesina KLP59C es requerida para el
movimiento de los cinetocoros (en verde). La inhibición de
KLP59C con un anticuerpo, inhibe el efecto de “pac-man”.
pole
disassembly
disassembly
Rogers et al, Nature 2004
En la anafase B el huso es elongado por la acción
coordinada de kinesinas y dineínas
La inactivación de las kinesinas-C (-), y la acción de las kinesinas bipolares (+) en conjunto
con dineínas corticales contribuyen a la separación de los polos en la anafase B.
anafase B
Sharp et al, Nature 2000
Deslizamiento entre microtúbulos antiparalelos
en la zona media del huso
Síntesis de las distintas funciones de las proteínas motoras en la mitosis
Motores (+) unidos a los brazos de los cromosomas
(cromokinesinas) transportan a los cromosomas
hacia la placa ecuatorial.
Motores (-) anclados a la
corteza celular (dineínas)
contribuyen a elongar
el huso.
La movilidad del cinetocoro
involucra dos tipos de motores:
1) motores (-) asociados a
la corona fibrosa traccionan
los cromosomas hacia los polos;
2) motores en el interior del
cinetocoro promueven el
desensamble de los MTs y el
anclaje de los cromosomas
al extremo (+).
(1)
(2)
(2)
(División del citoplasma)
Dos mecanismos aseguran que la citoquinesis ocurra al finalizar la mitosis:
1. La inactivación de Cdk-ciclinas M mediada por APC-Cadh1.
2. La asociación de MTs antiparalelos en la región central del huso que es
requerida para el ensamble del anillo contráctil.
La citoquinesis comienza durante la anafase
El primer cambio morfológico visible de la citoquinesis en una célula
animal es la aparición de un surco en la superficie
Microscopía electrónica de barrido mostrando el surco de clivado en
la superficie de una célula huevo de anfibio
La estructura molecular que subyace el surco superficial
de clivado es un anillo contráctil de actina y miosina
actina
miosina II
Dos modelos proponen roles opuestos de los microtúbulos
en la formación del anillo contráctil
El modelo de relajación astral propone que los microtúbulos astrales inhiben la contractilidad en la
región adyacente a la corteza de los polos. Esto, sin embargo, permitiría la contracción en la corteza
ecuatorial de la célula. El modelo alternativo de la estimulación astral propone que los microtúbulos
astrales suministran una señal positiva que induce la contracción en la corteza ecuatorial.
La asociación de microtúbulos polares antiparalelos en la zona media
es esencial para la citoquinesis
La asociación de MTs antiparalelos en la zona media del huso (en verde) es mediada por la kinesina ZEN-4.
La unión de ZEN-4 a los MTs es inhibida por fosforilación mediada por Cdk-ciclinas M. Posterior a la anafase,
las Cdks-ciclinas M son degradadas y ZEN-4 es defosforilada por la fosfatasa Cdc14.
APC
Cdk-M
Cdh1
ZEN-4  Cdc14
MLC
microscopía electrónica de barrido mostrando
dos células a punto de finalizar la citocinesis
microscopía electrónica de transmisión mostrando
el cuerpo medio
matriz
densa
MTs de la
zona media
Experimento que demuestra el rol de la miosina II en la citocinesis
La miosina II es inhibida por fosforilación mediada por CDK-ciclinas M. Durante telofase, la activación
de la fosfatasa Cdc14 y del complejo APC-Cdh1 y promueven la defosforilación de la miosina y su
asociación con el anillo de actina. La contracción del anillo forma el surco de clivado.