En la mitosis los microtúbulos ensamblan el aparato mitótico

En la mitosis los microtúbulos ensamblan el aparato
mitótico, estructura que es esencial para distribuir el
material genético en las células de la nueva generación.
El aparato mitótico se ensambla a partir de centrosomas, que en células
en interfase ocupa una posición perinuclear
núcleo
En las células animales el centrosoma se duplica
antes de comenzar la mitosis
Al final de la fase G1, la actividad de las kinasas Cdk2 y de las ciclinas A y E (activas durante
G1/S y la fase S) promueven la duplicación de los centrosomas. De modo que la coordinación de
la duplicación del DNA y del centrosoma están aseguradas por el mismo mecanismo de control.
Lodish et al., 2004
El centrosoma consiste en un par de centríolos
inmersos en una matriz fibrosa
centrosomas duplicados
La matriz fibrosa pericentriolar contiene numerosas copias del
complejo γ-TuRC (gamma-tubulin ring complex)
El complejo γ-TuRC consiste de proteínas que estabilizan un anillo
de subunidades de tubulina γ a partir del cual se ensamblan los
heterodímeros α/β. Los microtúbulos ensamblados a partir del
centrosoma poseen una polaridad uniforme, con su extremo de
rápido crecimiento (+) distal.
El aparato mitótico consiste de tres tipos de microtúbulos
funcionalmente distintos: astrales, del cinetocoro y polares
Los MTs astrales irradian desde el centrosoma (en amarillo) y contribuyen a la separación de los polos y
al posicionamiento del huso. Los MTs del cinetocoro (en rojo) forman ramilletes (fibras del cinetocoro)
que anclan los polos a los cinetocoros de los cromosomas. Los MTs polares (en azul) se interdigitan en el
ecuador del huso y permiten generar fuerzas que regulan la separación de los polos.
Lodish et al., 2004
 formación del huso
 captura y alineamiento de cromosomas
 transporte de cromátides hacia los polos
no solo depende de microtúbulos sino
también de moléculas motoras
Kinesinas-C contribuyen en la alineación de los MTs polares
Las kinesinas-C son homodiméricas y poseen las cabezas motoras en el terminal
carboxilo. Se translocan hacia el extremo (-) de los microtúbulos; participan en la
alineación de los MTs polares y en el acercamiento de los polos.
Lodish et al., 2004
Kinesinas bipolares tetraméricas y dineínas contribuyen a
la separación de los centrosomas
BimC, Eg5 son kinesinas bipolares que se unen a MTs polares
antiparalelos y se translocan hacia el extremo (+) de los MTs.
Junto a las las dineínas
corticales las kinesinas
bipolares separan los
polos en prometafase
y forman el huso bipolar.
dineína
cortical
Lodish et al., 2004
El rol esencial de kinesinas en el ensamble del huso mitótico ha sido
examinado in vitro a partir de extractos de huevos de Xenopus
La inactivación de la kinesina bipolar Eg5 con la droga monastrol produce un huso
monopolar. Los microtúbulos se marcaron empleando tubulina unida a rodamina (en
rojo). El DNA se marcó con Hoechst (azul).
+ monastrol
huso normal
huso monopolar
T. Mitchison lab
La estructura y dinámica del aparato mitótico depende de la actividad
coordinada y combinatorial de diferentes motores
Dineínas corticales que actúan sobre los MTs astrales y kinesinas-C (-) que actúan sobre los MTs polares
antiparalelos de la zona media generan fuerzas opuestas que determinan la longitud del huso.
+
profase
La asociación de kinesinas bipolares (+) a los MTs antiparalelos en la zona media
contribuye a una posterior elongación del huso hasta alcanzar un estado estacionario.
prometafase/metafase
Sharp et al, Nature 2000
La ruptura del balance de fuerzas entre motores de distinta
polaridad altera la longitud del huso
En las figuras se muestran los husos mitóticos de células de
levadura marcadas con un anticuerpo anti-tubulina (en verde)
husos normales
sobre-expresión
de kinesina-C
sobre-expresión de
kinesinas bipolares
(B) células de levaduras normales
(C) células que sobreexpresan la kinesina-C Kar3p, de polaridad (-) exhiben el acortamiento del huso.
(D) células que sobreexpresan la kinesina bipolar Cin8p, de polaridad (+) revelan el alargamiento del huso.
En profase, los microtúbulos de los centrosomas duplicados incrementan
el dinamismo e invaden el centro de la célula
Los complejos Cdk-ciclinas mitóticas (= MPF) incrementan el dinamismo de los microtúbulos durante
profase mediante la fosforilación y activación de catastrofinas y la inactivación de MAPs estabilizadoras.
Los MTs de metafase son más
dinámicos que los de interfase (FRAP)
Las catastrofinas son proteínas que se unen a los extremos (+) de los MTs
y promueven la depolimerización del extremo (+). En contraste, las MAPs
se asocian a la pared de los MTs y disminuyen la inestabilidad dinámica.
 Ruptura de la envoltura nuclear
 Captura de cinetocoros por microtúbulos del huso
 Alineamiento de cromosomas en la placa ecuatorial
La inestabilidad dinámica de los microtúbulos y la actividad de
motores (+) son esenciales para la captura de los cinetocoros
Inestabilidad dinámica de los microtúbulos
Rol de motores de polaridad (+): CENP-E
CENP-E: centromeric protein-E, es una
kinesina asociada al cinetocoro que
contribuye al posicionamiento de los
cromosomas en la placa ecuatorial.
Lodish et al., 2004
Capturados los cinetocoros los cromosomas se transportan
a la placa ecuatorial en movimientos oscilatorios
Los movimientos oscilatorios resultan de la actividad de: a) motores asociados al cinetocoro y a los polos y
que poseen distinta polaridad; b) motores unidos a la cromatina que se translocan hacia el extremo (+)
de los MTs polares y empujan los brazos de los cromosomas hacia la placa de metafase; c) eventos
de polimerización y depolimerización del extremo (+) de los MTs del cinetocoro.
(c)
(b)
chromokinesinas son kinesinas-N asociadas
a los brazos de los cromosomas.
Lodish et al., 2004
El cinetocoro es un complejo multiproteico ensamblado sobre
la región de heterocromatina centromérica de los cromosomas
MCAK es una kinesina-M asociada a
la capa externa del cinetocoro y que
depolimeriza el extremo (+) de MTs.
Proteínas de control o
checkpoint mitótico
también se localizan
en el cinetocoro.
CENP-E es una kinesina (+) asociada
a la corona fibrosa del cinetocoro que
contribuye a anclar el MT al
cinetocoro.
(MCAK: Mitotic Centromere-Associated Kinesin)
Lodish et al., 2004
Excepto en levaduras el centrómero usualmente
consiste en secuencias de DNA repetidas
DNA centromérico de S. cerevisiae
Alberts et al., 2002
En metafase los cinetocoros de las cromátides hermanas
anclan microtúbulos de polos opuestos
microscopía electrónica de
barrido de cromosoma de metafase
Inmunolocalización de cinetocoros (rojo)
centrómeros
MTs
cromosomas
cromátides
En Metafase los microtúbulos de los cinetocoros exhiben
un estado dinámico de "treadmilling"
Demostración experimental del treadmilling. Se muestra un huso mitótico ensamblado in vitro.
Los MTs se marcaron con tubulina-rodamina (rojo) y los cromosomas con Hoechst (azul). La
marca verde representa una fracción de tubulina-fluoresceína activable por un pulso de luz.
Note que la fluoresceína activada se desplaza hacia el polo izquierdo.
DNA
microtúbulos
fotoactivación de la
fluoresceína unida a la
tubulina mediante
un pulso de UV
suministrado dentro de
la región marcada (verde)
1.5min
En el "treadmilling" la adición de subunidades de
tubulina en el extremo (+) es balanceada por el
desensamble de subunidades en el extremo (-).
2.5min
El “treadmilling” de MTs de metafase también puede visualizarse en
kimografías empleando “trazas” de tubulina fluorescente
La técnica consiste en agregar a la preparación de tubulina que va a formar el huso “trazas”
de tubulina fluorescente (rojo), de modo que cuando ésta se incorpora a los microtúbulos
con baja frecuencia, genera un patrón de marcas o “speckles” fluorescentes.
kimografía
A
B
C
pendiente de la línea formada
por la posición de las trazas a
distintos tiempos.
tubulina
fluorescente
distancia
*
En (A) se esquematiza un microtúbulo marcado con trazas de tubulina fluorescente (en rojo). En (B) se muestra una fotografía
del huso donde se visualizan las marcas o “speckles” fluorescentes. El cambio de posición de las marcas fluorescentes
individuales en función del tiempo puede visualizarse si se analiza una franja o “slice” correspondiente a distintos tiempos y que
seon alineadas después de la videomicroscopía (asterisco) (C). La distancia recorrida por las marcas fluorescentes se emplea
para calcular la velocidad de translocación de la tubulina en los microtúbulos (~ 0.75 μm/min).
Mitchison & Salmon, Nature Cell Biol 2001
 tracción de los cinetocoros hacia los polos
Anafase A: acortamiento de la fibra del cinetocoro en ambos extremos de los MTs
Anafase B: separación de los polos por acción de kinesinas bipolares
Transición metafase  anafase
separación de las cromátides
metafase
anafase
Distintas fuerzas gobiernan el movimiento de los cromosomas
durante la anafase
ANAFASE A: Depolimerización de los
MTs de los cinetocoros en los cinetocoros
y en los polos.
ANAFASE B: Deslizamiento entre MTs
antiparalelos polares en el plano ecuatorial mediado
por kinesinas (+). También fuerzas de tracción
ejercidas por dineínas corticales.
Evidencia experimental del acortamiento de los MTs de los
cinetocoros en el extremo (+).
Experimentos de fotodestrucción (photobleaching) de la fluorescencia revelan la depolimerización
de los MTs en el cinetocoro, evento que no requiere de ATP y actividad motora.
región
fotodestruída
Gorbsky et al JCB 1988
El acortamiento de los MTs del cinetocoro también es demostrado
empleando proteínas fluorescentes fotoactivables
Tubulina conjugada a fluoresceína fotoactivable es microinyectada en células e incorporada al huso
en metafase. Al comienzo de la anafase, la fluoresceína es activada (zona verde). Note que la
tubulina activada se pierde al mismo tiempo que los cromosomas migran hacia los polos.
MCAK es una kinesina asociada al cinetocoro que
promueve la depolimerización del extremo (+) de los
MTS. CENP-E es una kinesina que mantiene unidos
los cromosomas a los MTs durante su acortamiento.
Zhai et al JCB 1995
Kinesinas inducen el desensamble
de los MTs en el cinetocoro
y en los polos
Las kimografías demuestran que la kinesina KLP10A es
requerida para el flujo de tubulina fluorescente hacia los polos.
La inhibición de KLP10A con un anticuerpo, inhibe el flujo.
Kinesinas-M, como por ejemplo MCAK,
XKCM1, KLP10A y KLP59C, se unen a
los extremos de los MTs e inducen el
desensamble.
pole
En estas kimografías de MTs con trazas de tubulina-rodamina
se demuestra que la kinesina KLP59C es requerida para el
movimiento de los cinetocoros (en verde). La inhibición de
KLP59C con un anticuerpo, inhibe el efecto de “pac-man”.
pole
disassembly
disassembly
Rogers et al, Nature 2004
En la anafase B el huso es elongado por la acción
coordinada de kinesinas y dineínas
La inactivación de las kinesinas-C (-), y la acción de las kinesinas bipolares (+) en conjunto
con dineínas corticales contribuyen a la separación de los polos en la anafase B.
anafase B
Sharp et al, Nature 2000
Deslizamiento entre microtúbulos antiparalelos
en la zona media del huso
Resúmen de las distintas funciones de las proteínas motoras en la mitosis
Motores (+) unidos a los brazos de los cromosomas
(cromokinesinas) transportan a los cromosomas
hacia la placa ecuatorial.
Motores (-) anclados a la
corteza celular (dineínas)
contribuyen a elongar
el huso.
La movilidad del cinetocoro
involucra dos tipos de motores:
1) motores (-) asociados a
la corona fibrosa traccionan
los cromosomas hacia los polos;
2) motores en el interior del
cinetocoro promueven el
desensamble de los MTs y el
anclaje de los cromosomas
al extremo (+).
(1)
(2)
(2)
(División del citoplasma)
Dos mecanismos aseguran que la citoquinesis ocurra al finalizar la mitosis:
1. La inactivación de Cdk-ciclinas M mediada por APC-Cadh1.
2. La asociación de MTs antiparalelos en la región central del huso que es
requerida para el ensamble del anillo contráctil.
La citoquinesis comienza durante la anafase
El primer cambio morfológico visible de la citoquinesis en una célula
animal es la aparición de un surco en la superficie
Microscopía electrónica de barrido mostrando el surco de clivado en
la superficie de una célula huevo de anfibio
La estructura molecular responsible del surco superficial
de clivado es un anillo contráctil de actina y miosina
actina
doble
inmunofluorescencia
miosina II
La miosina II es esencial para que ocurra la citocinesis
En etapas anteriores a la citocinesis la miosina II es inhibida por fosforilación mediada por CDK-ciclinas M.
Durante telofase, la activación de la fosfatasa Cdc14 y del complejo APC-Cdh1 promueven la defosforilación
de la miosina y su asociación con el anillo de actina. La contracción del anillo forma el surco de clivado.
Dos modelos proponen roles opuestos de los microtúbulos
en la formación del anillo contráctil
El modelo de relajación astral propone que los microtúbulos astrales inhiben la contractilidad en la
región adyacente a la corteza de los polos. Esto permitiría que la contracción ocurra en la corteza
ecuatorial de la célula. El modelo alternativo de la estimulación astral propone que los microtúbulos
astrales suministran una señal positiva que induce la contracción en la corteza ecuatorial. Un
probable mediador de la contractilidad es la GTPasa Rho.
↑Rho-GTP
La asociación de microtúbulos polares antiparalelos en la zona media
es esencial para la citoquinesis
La asociación de MTs antiparalelos en la zona media del huso (en verde) y el ensamble del anillo
contráctil es mediada por la kinesina ZEN-4. La unión de ZEN-4 a los MTs es inhibida por
fosforilación mediada por Cdk-ciclinas M. En telofase, la fosfatasa Cdc14 dispara la degradación de
las Cdks-ciclinas M y defosforila a ZEN-4.
APC
Cdk-M
Cdh1
ZEN-4  Cdc14
MLC
microscopía electrónica de barrido mostrando
dos células a punto de finalizar la citocinesis
microscopía electrónica de transmisión mostrando
el cuerpo medio
matriz
densa
MTs de la
zona media