Estudio de la actividad mitótica entre las fases in vitro e in vivo en el

ISSN 1515-1786
Rev. Asoc. Arg. Ortop. y Traumatol. Vol. 65, № 4, págs. 306-310
INVESTIGACIÓN
Estudio de la actividad mitótica entre las fases in vitro
e in vivo en el trasplante de condrocitos
G. PERETTI,*,** F. RAZZA,† G. MACIAS,† E. CARUSO* y W. ALBISETTI‡
*Orthopaedics Research Laboratories, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, EE.UU.; **Clinica Ortopédica IV,
Universita di Milano, Ospedale San Raffaele, Milán, Italia; † Hospital Cosme Argerich, Buenos Aires, Argentina; ‡Istituto di Clínica Ortopédica, Università
degli Studi di Milano, Milán, Italia.
RESUMEN: El trasplante de matrices alogénicas
desvitalizadas portadoras de condrocitos autólogos,
previamente aislados y sembrados sobre ellas, podría
ser una solución al problema de la reparación de las
lesiones del cartílago articular. El presente estudio
analiza la actividad mitótica de los condrocitos sembrados en cartílago alogénico desvitalizado e implantados en animales vivos. Se aislaron enzimáticamente
condrocitos de cartílago articular de cordero, y se
sembraron in vitro sobre matriz cartilaginosa alogénica desvitalizada durante tres semanas. Al final del
período de cocultivo, se trasplantaron los compuestos
de matriz y condrocitos en bolsillos subcutáneos de
ratones atímicos. Las muestras experimentales y las
de control fueron evaluadas luego de extraídas mediante el estudio histológico y tras la incorporación
de timidina tritiada. Los resultados obtenidos mostraron una disminución importante de los valores de
incorporación de timidina a partir del tiempo experimental cero (evaluación preimplante) hasta el día
28 del implante, seguido por un leve aumento hacia el
día 42 del estudio. La experiencia ha demostrado la
tendencia de los condrocitos articulares (cultivados in
vitro y sucesivamente trasplantados in vivo sobre un
soporte de matriz cartilaginosa alogénica desvitalizada) de modificar su propia actividad mitótica desde
valores muy altos, correspondiendo a los primeros
días experimentales (típico de las fases in vitro de
expansión celular) hasta valores muy bajos, similares
a la conducta de los condrocitos articulares in vivo.
PALABRAS CLAVE: Trasplante
MITOTIC ACTIVITY IN IN VITRO AND IN Vivo
CHONDROCYTE TRANSPLANTATION
ABSTRACT: Transplantation of allogenic devitalized matrices carrying autologous chondrocytes previously isolated and seeded on them might solve the
problem of repairing joint cartilage lesions. This study
analyzes the mitotic activity of chondrocytes seeded in
allogenic devitalized cartilage and implanted in living
animals. Chondrocytes of joint cartilage of lambs
were enzimatically isolated and seeded in vivo in allogenic devitalized matrix during three weeks. At the
end of the co-culture period, the matrix compounds
and chondrocytes were transplanted into subcutaneous pouches of atymic mice. Histological evaluation
of the experimental and control samples was performed following incorporation of tritiated thymidine.
The results showed a significant reduction in thymidine incorporation values, as of experimental moment
zero (pre-implant evaluation) up to implant day 28,
following by a slight increase by day 42 of the study.
This experience has shown that joint chondrocytes
(seeded in vitro and then transplanted in vivo on an
allogenic devitalized matrix), tend to change their own
mitotic activity from very high levels, corresponding
to the initial experimental days (typical of the in vitro
phase of cell proliferation), to very low levels, resembling the performance of in vivo joint chondrocytes.
KEY WORDS: Chondrocyte
transplantation.
de condrocitos.
Recibido el 15-12-99. Aceptado luego de la evaluación el 12-4-00.
Correspondencia:
Dr. F. RAZZA
Av. Independencia 933 5° N
(1099) Capital Federal
Argentina
Tel.:(011)4331-8837
E-mail: [email protected]
El cartílago articular tiene escasa tendencia a la reparación espontánea. En las lesiones traumáticas o degenerativas típicas del joven (como la osteocondritis disecante), el tejido de reparación generalmente consiste en fíbrocartílago, cuyas propiedades biomecánicas son inferiores a las del tejido original, sin capacidad de garantizar
una buena función articular ni de prevenir la osteoartrosis.3
A través de los años se han propuesto diferentes técnicas quirúrgicas para solucionar este problema, que lleva a la formación de un tejido de reparación de naturaleza fibrocartilaginosa o cartilaginosa con resultados clínicos inciertos.
Recientemente, se ha presentado una técnica que
prevé el injerto de condrocitos autólogos en el interior de
la lesión condral, asegurados en su lugar por un colgajo
de periostio suturado a los bordes.1
A pesar de los resultados alentadores obtenidos en
los primeros estudios clínicos, el método presenta algunos problemas.
En primer lugar, en las primeras fases, las propiedades biomecánicas del neotejido de reparación son insuficientes, y este tejido sólo podrá resultar útil cuando los
condrocitos comiencen a producir matriz extracelular.
Este hecho demora la rehabilitación en el primer periodo,
sobre todo en lo que respecta a la concesión de la carga.
Otro problema, a menudo remarcado por los cirujanos, es
la difícil manipulación de una solución celular líquida,
poco densa, que tiende a escurrirse, si no es asegurada
por una sutura perfecta del colgajo perióstico, lo que
aumenta los problemas técnicos del método.
El trasplante de condrocitos autólogos, previamente
aislados y cultivados sobre matrices alogénicas desvitalizadas, podría representar una solución para ambos problemas.
Estudios precedentes han demostrado que el cultivo
de condrocitos en matrices desvitalizadas permite la adherencia y, posteriormente, la duplicación de los condrocitos sobre la superficie de las matrices.2
Para que resulte factible que los compuestos de matriz y condrocitos puedan ser transportados e inoculados
dentro de las lesiones condrales, es necesario que las células permanezcan viables, produzcan matriz condroide y
también que conserven la capacidad de duplicarse después del trasplante in vivo.
En este estudio, se ha propuesto analizar la actividad
mitotica de los condrocitos sembrados en un soporte de
matriz cartilaginosa alogénica desvitalizada, y luego trasplantada al animal vivo.
Material y métodos
Bajo condiciones de asepsia, se tomaron secciones de 3 mm de
ancho, 5 mm de longitud y 1 mm de espesor de cartílago articular
de rodilla, cadera y hombro de 3 corderos. Las secciones fueron colocadas en probetas de 50 mi (Corning, NY, EE.UU.), con fosfato
salino tamponado (phosphate buffered saline [PBS], Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.) y solución antibiótica/antimicótica al 2% (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.). Las secciones de cartílago fueron desvitalizadas mediante ciclos de congelación y descongelación.4 Luego, fueron congeladas a una temperatura de -20°C, durante cinco días. Después del descongelamiento, el
PBS fue extraído, y las secciones de cartílago fueron sometidas a un
ciclo de 5 pasajes de congelación-descongelación sin PBS. Al finalizar este proceso, la vitalidad de los condrocitos fue evaluada mediante la coloración con Trypan Blue (Trypan Blue 0,2%, Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.) y fluorescencia,2 para documentar la ausencia total de condrocitos vivos dentro de las secciones
cartilaginosas.
Al mismo tiempo, se obtuvo tejido cartilaginoso articular de
otros dos corderos bajo iguales condiciones de asepsia y del mismo
tipo de articulaciones. Las secciones cartilaginosas fueron digeridas
en medio de HAM con Glutamax-1 (GibcoBRL, Life Technologies
Inc., Grand Island, NY, EE.UU.) que contenía 0,075% de colagenasa
tipo II (Worthington Biochemical Co., Freehold, NJ, EE.UU.). El
medio fue complementado con 10% de suero bovino fetal (Sigma
Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.), con 50 µg/ml de ácido
ascórbico (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, EE.UU.), con la
solución de antibiótico/antimicótico al 1% (10.000 Ul de penicilina,
10 mg/ml de estreptomicina y 25 µg/ml de anfotericina B en solución
de cloruro de sodio al 0,9%; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO,
EE.UU.) y glutamina 292 mg/1 (L-Glutamine, Fisher Biotech Fair
Lawn, NJ, EE.UU.). El período de incubación de tales secciones fue
de 8 horas a 37°C. Los fragmentos de tejido digerido fueron removidos, filtrando la suspensión celular con una gasa estéril.
La suspensión celular conseguida fue centrifugada a 1500 rpm
durante diez minutos y lavada con una solución de PBS y antibiótico/antimicótico al 2%. La vitalidad de los condrocitos fue evaluada
mediante la coloración con Trypan Blue, y registrada como el porcentaje de condrocitos vitales por campo. Fueron consideradas las
muestras que presentaron un porcentaje de vitalidad igual o superior al 90%. El recuento celular exacto se efectuó a través de un
hemocitómetro. La solución condrocitaria fue ajustada a una concentración de 106 células/ml.
Los condrocitos así obtenidos se cultivaron en matriz alogénica
desvitalizada, según el protocolo previamente descrito. Se colocaron
3 secciones de matriz cartilaginosa en probetas de 12 mi (Corning,
NY, EE.UU.), que contenían 4 mi de medio y 1 ml de la solución
condrocitaria. Se mantuvo el cocultivo durante 21 días, para permitir
que los condrocitos se adhirieran a las paredes de la matriz cartilaginosa y se multiplicaran usando la matriz como soporte. Muestras
idénticas de control, sin condrocitos dentro de las probetas, fueron
mantenidas bajo las mismas condiciones de cultivo. En todas las
muestras, el medio de cultivo fue cambiado dos veces por semana.
Como se resume en la Tabla, se utilizaron 48 probetas con cultivos experimentales y 48 recipientes con muestras control.
Al finalizar el período de cocultivo, las tres secciones cartilaginosas de las muestras experimentales (que contenían condrocitos)
fueron extraídas del medio y colocadas en una placa de Petri, para
el ensamblado del compuesto. Tres secciones cartilaginosas separadas fueron colocadas una encima de la otra, y fueron sostenidas por
una envoltura de gel adhesivo de fibrina constituido por la combinación de un crioprecipitado humano con trombina bovina (Thrombin, USP-Thrombostat, Parke Davis, Lambert Co., Morris Plains,
NJ, EE.UU.).
De la misma manera fueron constituidos los compuestos control, utilizando tres secciones cartilaginosas desvitalizadas colocadas
bajo las mismas condiciones de cultivo y sin condrocitos vitales.
Se utilizaron 18 ratones atímicos, o ratones "desnudos". En cada
animal se implantaron 2 compuestos experimentales y otros 2 de
control, en cuatro bolsillos subcutáneos dorsales. El implante de los
compuestos se efectuó en condiciones de asepsia dentro de una campana con flujo laminar. Los ratones se sacrificaron en grupos de 6 a
los 14, 28 y 42 días del implante; 8 muestras experimentales y 8 de
control fueron extraídas para el estudio de la actividad mitotica, y 4
muestras experimentales y 4 de control, para el análisis histológico.
No se implantaron en los ratones 12 muestras experimentales
y otras 12 de control, que fueron analizadas inmediatamente después de la fase in vitro (tiempo O de la experimentación). Para cada
grupo experimental y de control, 8 muestras fueron reservadas para
el estudio de la actividad mitótica y 4 para la evaluación histológica. Para el estudio de la actividad mitótica, las muestras retiradas de
la probeta de cultivo (tiempo experimental 0) y las extraídas de los
ratones (tiempos experimentales 14, 28 y 42) fueron colocadas en
incubación con 16 µCi (592 kBq/ml) de timidina tritiada a una atmósfera de 92% de aire y 8% de CO, durante 24 horas. Cada muestra fue hidrolizada y combinada con 3 mi de CytoScint (ICN Research Products División, Costa Mesa, CA, EE.UU.) y el resultante
fue medido con un contador de /3-centelleo (Beckman LS5000TD,
Fullerton, CA, EE.UU.).
Se utilizó la prueba t de Student para datos no pareados para
comparar los valores de incorporación de timidina (media ± DE) en
los distintos tiempos experimentales. Fue adoptada la modificación
de Bonferroni, para mantener un error del tipo 1 con un valor igual a
0,05 en todas las comparaciones realizadas. Además, los valores de
las muestras experimentales de cada tiempo de estudio fueron confrontados con los correspondientes a los de las muestras de control
por medio de la prueba t de Student para datos no pareados (p <0,05).
Para el estudio histológico, los compuestos fueron fijados en
formalina, procesados y coloreados con safranina O.
Resultados
Como se observa en la Figura 1, el estudio de incorporación de timidina tritiada mostró, en las muestras
experimentales, una reducción estadísticamente significativa de los valores a partir del tiempo experimental O
hasta el tiempo experimental 28 (p <0,01). En cambio, en
el último tiempo experimental de 42 días se registró un
ligero aumento de tales valores. En las muestras control,
los valores se mantuvieron en niveles muy bajos (siempre
bajo las 3000 cpm) excepto en el último tiempo experimental, cuando se registró un aumento de la incorporación, aunque no estadísticamente significativo, respecto
de los tiempos precedentes (media de cpm >7000).
El análisis estadístico de estos resultados ha mostrado
una diferencia significativa entre las muestras experimentales y las de control, en todos los tiempos experimentales (p <0,05).
El estudio de los preparados histológicos de las
Tabla. Grupos de estudio y protocolo experimental
Grupos de estudio
Tiempo (días)
0 (no implantado)
Exp. control
Valoración
histológica
Exp. control
Incorporación de
timidina tritiada
Exp. control
14
28
42
Total
4
4(2)
4(2)
4(2)
16(6)
4
4
4
4
16
8
8(4)
8(4)
8(4)
32(12)
8
8
8
8
32
12
12(6)
12(6)
12(6)
48(18)
12
12
12
12
48
Total
Entre paréntesis, cantidad de ratones empleados.
Figura 1. Gráfico que muestra la
incorporación de timidina tritiada de
muestras experimentales y control en los
diversos tiempos del estudio. Mientras las
muestras control se mantienen en valores
básales durante todo el estudio, las experimentales registran valores muy altos al
tiempo O, para después decrecer
significativamente hasta el día 28; luego, se
evidencia un leve incremento de los valores
correspondiente al tiempo experimental a
los 42 días del implante (cpm = conteos por
minuto).
muestras procesadas al final de la fase in vitro documentó la presencia de células adheridas a la superficie de la
matriz desvitalizada, con producción de matriz extracelular (Fig. 2).
El análisis histológico de los preparados experimentales posimplante mostró, por el contrario, la presencia de
neocartílago interpuesto entre las matrices desvitalizadas,
y fuertemente adherido a éstas (Fig. 3). Se observaron
varias figuras mitóticas en los condrocitos, casi siempre
localizados en el interior de lagunas de la neomatriz, fuertemente coloreada con safranina O. En las muestras control, en cambio, los espacios entre las matrices desvitalizadas fueron ocupados por tejido fibroso y células de
Figura 2. Sección histológica (safranina O, 100x) del
compuesto experimental de matriz y condrocitos después
de la fase in vitro y antes del implante en el ratón atímico. Son reconocibles algunos estratos celulares sobre la
superficie del cartílago desvitalizado circundado por una
escasa cantidad de sustancia extracelular. En el interior
de la matriz desvitalizada, son visibles lagunas celulares
vacías o que contenían sólo detritos nucleares.
naturaleza fibroblástica, pero no se observaron condrocitos.
Discusión
El estudio de la reparación de las lesiones del cartílago articular ha sido, desde hace unos años, el centro de
atención de la investigación en los campos ortopédico y
reumatológico.
Uno de los principales problemas referidos a la reparación de estas lesiones es la restauración de la integridad de la superficie articular con un tejido que posea
las mismas características biomecánicas que el tejido
original. Al tal fin, un modelo que presenta simultáneamente, la actividad mitótica de los condrocitos aislados y
las propiedades biomecánicas del cartílago, puede proponerse para la resolución de esta situación patológica.
Para considerar válida esta propuesta, es necesario
demostrar la capacidad de tales condrocitos para multiplicarse y producir matriz después del implante in vivo.
Hemos estudiado la actividad mitótica de condrocitos
aislados y cultivados sobre matriz alogénica desvitalizada, después del implante del compuesto en el tejido subcutáneo de ratones atímicos. Los valores expresados por
la incorporación de timidina tritiada reflejaron directamente la actividad multiplicativa de tales células.
El estudio in vivo se efectuó en ratones atímicos, que
no presentan ningún tipo de respuesta inumnológica, y
donde el neocartílago puede desarrollarse libremente
simulando un modelo de trasplante autólogo, sin los
problemas por rechazo.
El descenso rápido de los valores desde el tiempo
experimental 0, en relación con los sucesivos tiempos, se
puede interpretar como la modificación de la actividad
mitótica de los condrocitos, desde valores muy altos (en
los primeros tiempos experimentales, típico de las fases
de expansión celular in vitro), hasta valores muy bajos y
más uniformes, parecidos a la conducta silenciosa (desde
el punto de vista mitótico) del condrocito articular in
vivo. El aumento registrado en el día 42 señalaría, en
cambio, una continua proliferación celular, confirmada,
además, por histología.
Conclusiones
Figura 3. Sección histológica (safranina O, 200x) de un
compuesto experimental después de 42 días in vivo. A la
derecha, se observa neocartílago, morfológicamente bien
representado, que se adhiere a la superficie de la matriz
desvitalizada (izquierda). En las lagunas, no se reconocen células vivas.
El presente estudio demostró que los condrocitos aislados, sembrados sobre un soporte de matriz alogénica
desvitalizada, son transportables in vivo gracias a este
soporte y, por lo tanto, inoculables en el interior de
lesiones condrales; las células sobreviven, producen
matriz cartilaginosa (hecho documentado por el estudio
histológico) y conservan la capacidad de duplicarse
después del trasplante in vivo.
A nuestro entender, este modelo se propone como un
instrumento científico válido, simple y fácilmente reproducible para el estudio de la matriz alogénica utilizada
como soporte para los condrocitos en la reparación de las
lesiones del cartílago articular. Esto representa la premisa
esencial para su posible empleo en la clínica, con el
propósito de reparar las lesiones cartilaginosas con un
tejido que presente las mismas características histológicas y biomecánicas del cartílago hialino normal.
Referencias bibliográficas
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