Tesis

 FACULTAD DE MEDICINA
CENTRO UNIVERSITARIO DE INVESTIGACIONES BIOMÉDICAS
“Impacto funcional de las propiedades biofísicas y
farmacológicas del receptor NMDA compuesto por
subunidades NR2(A-D)”
(Revisión)
Tesis para obtener el grado de:
Maestro en Ciencias Fisiológicas
Presenta:
QFB. Pedro Daniel Salazar Fajardo
Asesor:
Dr. Sergio Humberto Elenes Zepeda
Colima, Col. Septiembre del 2010
Dedicatoria
Este trabajo está dedicado con mucho cariño, a Danny y Odette, mis sobrinos. i
Agradecimientos
A mis padres por su apoyo incondicional durante mi preparación
profesional. A mis hermanos, por su compañía.
Al Dr. Sergio Humberto Elenes Zepeda, por brindarme su atención y
asesoría durante la elaboración de este trabajo.
Al Dr. Humberto Cruzblanca y Dr. Oscar Gonzales Pérez, por el valioso
tiempo dedicado a la revisión del escrito.
Al apoyo diario del Dr. Jesús Lara Chávez, al Dr. Ricardo Navarro y su
equipo de trabajo: Dr. Eloy Moreno, M.C. Alberto Rodríguez, IBQ. Elizabeth
Guzmán y QFB. Julio Rodríguez.
También a Rosy, Adriana, Chucho, Letty, Chayito, Goyo y Miguel, personal
del CUIB.
Y al Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (CONACyT), por el
financiamiento al proyecto 49304 y su beca de manutención número CVU/becario:
231965/209124.
ii
Índice
Contenido
Página
Dedicatoria
i
Agradecimientos
ii
Índice
iiii
Índice de figuras
iivi
Índice de tablas
viii
Abreviaturas
ix
Resumen
xi
Abstract
xii
I. INTRODUCCIÓN
1
II. MARCO TEÓRICO
3
2.1 Los receptores de glutamato.
3
2.2 Receptores del tipo NMDA.
5
2.2.1 Topología del NMDAR.
5
2.2.2 Estequiometría del NMDAR.
6
2.2.2.1 La subunidad NR1.
7
2.2.2.2 La subunidad NR3.
8
2.2.2.3 La subunidad NR2.
9
2.2.2.3.1 Conductancias de la subunidad NR2.
9
12
2.2.2.3.2 Transiciones directas.
2.3 Cinética del Receptor NMDA.
15
2.3.1 Componentes glutamatérgicos postsinápticos.
15
2.3.2 Tiempo de activación
16
2.3.3 Tiempo de desactivación
18
2.3.4 Desensibilización del NMDAR.
20
2.3.5 Análisis de las aperturas y cierres de receptores
NR1|NR2A y NR1|NR2D.
23
2.3.5.1 Tiempo crítico.
23
iii
2.3.5.2 Distribución de la longitud de trenes.
24
2.3.5.3 Alineación y suma de trenes.
25
2.3.6 Cinética de la subunidad NR2C
28
2.3.6 Cinética de la subunidad NR2B
29
2.3.8. Implicaciones fisiológicas de la subunidad NR2D.
31
2.4 Patrones de expresión de los subtipos de NMDARs
33
2.4.1 Distribución de las subunidades NR1 y NR2 en el desarrollo.
33
2.4.2 Distribución de NR1 y NR2 en cerebro adulto.
36
2.4.3 Receptores NMDA triheterómeros.
37
2.5 Papel funcional del receptor NMDA en el SNC.
39
2.5.1 Proteínas postsinápticas asociadas al NMDAR.
40
2.5.2 Organización del NMDAR en las sinápsis.
40
41
2.5.2.1 Tráfico del NMDAR.
43
2.5.3. Plasticidad sináptica.
2.5.3.1 Plasticidad en sinápsis excitatorias.
44
2.5.3.2 Control bidireccional de los procesos de LTP y LTD
45
por el NMDAR.
2.5.3.3 Mantenimiento de LTP por el receptor NMDA.
46
2.5.3.4 Mantenimiento de LTP por el receptor NMDA.
48
2.6 Farmacología del receptor NMDA.
50
2.6.1 Fármacos que actúan en el sitio de unión del agonista.
50
2.6.1.1 Sitio de unión de glutamato de la subunidad NR2.
50
2.6.1.2 Sitio de unión de glicina de la subunidad NR1.
53
2.6.2 Fármacos que bloquean el poro del canal.
53
2.6.3 Fármacos que actúan en el sitio NTD.
55
2.6.4 Modulación por poliaminas.
57
2.6.5 Modulación por protones (H+).
59
2.6.7 Posibles sitios moduladores del NMDAR.
60
2.7 Usos clínicos de moduladores del NMDAR
2.7.1 Compuestos no selectivos.
63
63
2.7.1.1 Antagonistas competitivos.
63
2.7.2.1 Bloqueadores del poro
63
iv
2.7.2 Antagonistas selectivas de la subunidad NR2B
64
2.7.3 Dolor.
64
2.7.4 Huntington
65
2.7.5 Parkinson
65
2.7.6 Depresión mayor
66
2.7.7 Esquizofrenia
66
III. CONCLUSIONES
69
IV. PERSPECTIVAS
71
V. BIBLIOGRAFÍA
73
v
Índice de Figuras
Descripción
Número de Figura
Página
Figura 1
Clasificación de los receptores de glutamato.
3
Figura 2
Agonistas fisiológicos del receptor NMDA.
4
Figura 3
Topología de las subunidades del NMDAR.
5
Figura 4
Estequiometría del NMDAR.
6
Figura 5
Diversidad de las subunidades del receptor
7
NMDA.
Figura 6
Conductancia
principal
y
sub-estado
de
receptores NR1|NR2D.
10
Figura 7
Conductancia del receptor NMDAR.
10
Figura 8
Efecto del calcio en la conductancia del canal del
receptor NMDA.
11
Figura 9
Transiciones directas del receptor NMDA.
13
Figura 10
Componentes glutamatérgicos postsinápticos.
16
Figura 11
Tiempo de activación de la subunidad NR2.
17
Figura 12
Activación de las subunidades NR2A y NR2D.
17
Figura 13
Curso temporal de desactivación del NMDAR.
18
Figura 14
Tiempo de recuperación de la desensibilización
20
del NMDAR.
Figura 15
Desensibilización de los subtipos NR2 para
pulsos largos de agonista.
21
Figura 16
Modelo simplificado de la cinética del NMDAR.
22
Figura 17
Distribución
de
los
estados
cerrados
de
receptores NR1a|NR2A y NR1a|NR2D.
Figura 18
23
Distribución de las longitudes de los trenes de
receptores NR1a|NR2A y NR1a|NR2D.
24
Figura 19
Trenes de NR1a/NR2A.
26
Figura 20
Trenes de NR1a/NR2D.
27
vi
Figura 21
Análisis de
aperturas y cierres de receptores
NR1|NR2C.
29
Figura 22
Cinética del receptor NMDA.
30
Figura 23
Distribución y nivel de expresión de NR1 y NR2
en el desarrollo.
34
Figura 24
Distribución de NR2 en cerebro adulto.
36
Figura 25
Esquema del complejo del receptor NMDA.
39
Figura 26
Organización del NMDAR en la sinápsis.
41
Figura 27
Tráfico del NMDAR en sinapsis CA1- Scaffer
nacientes.
Figura 28
42
Mecanismos de mantenimiento de LTP mediado
por los NMDARs.
47
Figura 29
Sitios con potencial farmacológico del NMDAR.
51
Figura 30
Principales
fármacos
que
actúan
sobre
el
receptor NMDA.
52
Figura 31
Dependecia del voltaje del bloqueo por Mg2
54
Figura 32
Nueva generación de compuestos NR2B.
56
Figura 33
Efecto del zinc
57
vii
Índice de Tablas
Descripción
Número de Tabla
Página
Tabla 1
Porpiedades de los subtipos NR2 del NMDAR.
14
Tabla 2
Expresión de las subunidades NR2 (A-D).
35
Tabla 3
Tabla 4
IC50 de los principales compuestos moduladores
61
del NMDAR
Selectividad de compuestos moduladores del
62
Receptor NMDA.
viii
Abreviaturas
ABD
dominio de unión del agonista
ADNc
Acido desoxirribonucleico codificante
AMPA
ácido propiónico de α-amino, 3-hidroxi, 5-metil,
4-isoxazol
AMPAR (s)
Receptor (es) AMPA
A2AR
Receptor de adenosina tipo 2A
7-CKA
ácido 7-cloroquinurénico
Ca
2+
Calcio
C-terminal
Carboxilo terminal
CP 101,606
acido (R)-4-(3-fosfonopropil) piperazina-2carboxylico
5,7-DCKA
ácido 5,7-dicloroquinurénico
EPSCs
corrientes postsinápticas excitatorias
HEK-293
Células embrionarias humanas de riñón 293
iGluR (s)
Receptor (es) ionotrópico (s) de glutamato
kDa
Unidad de masa atómica (Dalton= Da) a la
tercera potencia (kilo=k)
+
K
Potasio
LTD
Depresión a largo plazo
LTP
Potenciación a largo plazo
Mg2+
Magnesio
mGluR1-8
Receptor metabotrópico de glutamato (tipo 1-8)
MK-801
Dizolcipina
mM
milimolar
Ms
milisegundos
mV
Unidad de voltaje(Volts) x10-3
Na
+
Sodio
NMDA
N-metil-D-aspartato
NMDA-EPSC
Corrientes postsinápticas excitatorias mediadas
por el receptor NMDA
NMDAR (s)
Receptor (es) NMDA
Receptores no-NMDA
Receptores AMPA y Kainato
ix
NOS
Óxido nítrico sintetasa
2NR1|2NRA
Receptor NMDA compuesto por dos
subunidades NR1 y dos subunidades NR2A
2NR1/2NR3AB
Receptores NMDA compuestos por dos
subunidades NR1 y dos NR3A (ó dos NR3B)
NR1-3
Receptor NMDA 1, NR2, NR3
NR1 ABD
Dominio ABD de la subunidad NR1
NR2A-D
Receptor NMDA 2A, NR2B, NR2C, NR2D
NR2 ABD
Dominio ABD de la subunidad NR2
NR3A-B
Receptor NMDA 3A, NR3B
NTD
Dominio amino terminal
N-terminal
Amino terminal
pA
Amperio (A) = Unidad de intensidad de corriente
= Coulumb/s
PAMPA
pico=1x10-12
ácido (RS)-4-(fosfonometil)-piperazina-2carboxylico
PCP
Fenilciclidina
pH
Potencial Hidronio
PDS-95
Proteínas de la densidad postsináptica de
95kDa
unidad de conductancia (Siemens) x10-12
pS
(pico)
PPDA
Ácido (2R,3S)-1-(fenantrenil-2-carbonil)
piperazina-2, 3-dicarboxílico
(R)-AP5
(R)-2-amino-5-fosfonoheptanoato
(R)-AP7
(R)-2-amino-7-fosfonoheptanoato
(R)-CPP
ácido (R)-4-(3-fosfonopropil) piperazina-2carboxylico
Ro 25-6981
hidrocloruro de (aR,bS)-a-(hidroxifenil)-b-metil4-(fenilmetil)-1-piperidinpropanol
SNC
Sistema nervioso central
TCP
Tionil-ciclohexil-piperidina
TM1-4
Segmentos transmembranales 1, 2, 3 y 4
2+
Zinc
τ
Constante de desactivación
Zn
x
Resumen
El neurotransmisor excitatorio que predomina en el sistema nervioso
central es el L-glutamato. Activa receptores del tipo metabotrópicos (GluR1-8) e
ionotrópicos (NMDA y no-NMDA). Los receptores NMDA (NMDARs) son
complejos tetraméricos con un canal iónico permeable a Na+, K+ y Ca2+. Están
ensamblados por la combinación de subunidades de las familias NR1 (NR1a-4b),
NR2 (A-D) y NR3 (A y B). La expresión de dos subunidades NR1 es esencial para
garantizar la funcionalidad de este
receptor. Las subunidades
NR2 (A-D)
determinan la variación de sus propiedades biofísicas: activación, desactivación y
desensibilización oscilan del orden de milisegundos hasta segundos y tienen un
efecto directo en la duración de las corrientes postsinápticas excitatorias
mediadas por estos receptores. La contribución en el aumento de calcio
intracelular y las enzimas intracelulares confieren a la activación del receptor
NMDA un papel muy importante en procesos fisiológicos y fisiopatológicos. La
familia NR3 tiene un efecto modulatorio del tipo inhibitorio. Una gran variedad de
compuestos y moduladores endógenos como el Mg2+, Zn2+, pH y poliaminas
regulan la actividad del canal según la subunidad NR2 presente. La expresión de
cada subtipo en la membrana sináptica es gobernada por diversos factores como:
el desarrollo neuronal, distribución, activación sináptica normal, bloqueo y
desregulación; todas ellas,
aumentando su diversidad fisiológica funcional. El
estudio y manipulación del NMDAR ha sido complicado por la falta de fármacos
capaces de distinguir entre las diferentes subunidades que pueden integrarlo. Por
tal motivo,
continúa abierto un campo de estudio que ayude a elucidar las
determinantes biofísicas y farmacológicas que gobiernan la función del receptor
NMDA.
Palabras clave: L-glutamato, Receptor NMDA, subtipos NR2.
xi
Abstract
The predominant excitatory neurotrasmisor in the central nervous system is
the L-glutamate. This amino acid active metabotropics (GluR1-8) and ionotrópic
(NMDA and non-NMDA) receptors. The NMDA receptors are tetramer complex
having an ion channel permeant to Na+, K+ and Ca2+. They are ensemble by the
combination of two subunits of NR1 (NR1a-4b), NR2(A-D) and NR3(A,B) families.
The expression of two NR1 subunits is essential to ensure the function of this
receptor. The NR2(A-D) subunits play a main role on theirs biophysical properties:
activation, deactivation and desensitization could have a duration from millisecond
to several seconds and have a direct effect to postsynaptic excitatory current
through these receptors. Their contribution to increase the intracellular calcium
and the among of intracellular enzyme by the activation processes of NMDA play
an important role in physiological and pathological process. On the other hand, the
NR3 family has an inhibitory modulation. A broad among of endogenous
compounds like Mg2+, Zn2+, pH and polyamines can regulated the single channel
activity according to the NR2 subunits. The expression of each subunit in the
synapses is regulated by many factors like: neural development, distribution,
regular function of the synapse, blocked and deregulation; all of them increasing
theirs diversity physiological function. The studies and manipulation of NMDAR
receptors have been complicated because of lack of drugs to selective bond to
each subunit. On this way, there are many studies taken place to understand the
biophysical and pharmacological that regulated the NMDA function.
Clave words: L-glutamate, NMDA receptor, NR2 suptypes.
xii
I. INTRODUCCIÓN
El neurotransmisor excitatorio que predomina en el sistema nervioso de los
mamíferos es el glutamato. Sus receptores son del tipo metabotrópicos (mGluR1-8)
e ionotrópicos (AMPA, Kainato y NMDA). El receptor del tipo NMDA juega un papel
muy importante en la transmisión sináptica debido a su alta permeabilidad al Ca2+.
Participando en la excitabilidad general, en la regulación de la actividad de
segundos mensajeros y enzimas intracelulares de las neuronas (Dingledine et al,
1999) y en la patogénesis de padecimientos neurodegenerativos mediante
mecanismos de actividad excesiva (Choi, 1992), sobreexpresión (Li et al, 2003) e
hipofunción (Woo et al, 2008). Este receptor es un tetrámero, conformado por
diferentes combinaciones de siete subunidades que están clasificadas dentro de
tres familias: NR1, NR2 (A-D) y NR3 (A-B). Dos subunidades deben ser NR1 para
asegurar la funcionalidad del receptor, las demás son combinaciones homo- y
heterólogas entre las familias NR2 y NR3. Mientras que los subtipos NR3 ejercen
una modulación negativa sobre la actividad del canal, la mayor diversidad biofísicas
y farmacológicas del NMDAR varían principalmente por la subunidad NR2 presente
(Cull-Candy et al, 2001) y hasta el momento no han sido completamente
caracterizadas (Wyllie et al, 1998; Banke and Traynelis, 2003; Dravid et al, 2008).
La principal repercusión de la variabilidad biofísica del receptor NMDA inferida por
las subunidades NR2, es sobre la cinética de desactivación del canal, que oscila
entre los 54ms para el subtipo NR2A hasta 1700ms para NR2D (Vicini et al, 1998)
implicando una diferencia en la duración de las corrientes postsinápticas que
pueden alcanzar el orden de segundos (Lester et al, 1990). El estudio del impacto
funcional del receptor NMDA ha sido complejo por varios factores: i) la distribución
particular de cada subunidad NR2 (Monyer et al, 1994), ii) la regulación de los
patrones de expresión durante procesos fisiológicos y fisiopatológicos (Fox et al,
1999; Takai et al, 2003), iii) las diferentes vías de señalización ligadas a cada
subtipo (Lau and Zukin, 2007; Rebola et al, 2009), y finalmente iv) la falta de
selectividad de las moléculas que modulan la actividad del canal (Paoletti and
Neyton, 2007; Mony et al, 2009).
1
En esta revisión, pretendemos mostrar las principales características
biofísicas determinantes de la cinética del receptor NMDA en las sinápsis y el
impacto funcional que exhibe en algunos procesos fisiológicos, principalmente en la
plasticidad sináptica. Así como algunos aspectos farmacológicos que hoy en día se
han tomado en cuenta como estrategias para el estudio y manipulación de los
receptores NMDA.
2
II. MARCO TEÓRICO
2.1 Los receptores de glutamato
El Glutamato es el neurotransmisor excitatorio que predomina en el sistema
nervioso central (SNC) de los mamíferos. Dentro de la clasificación de los receptores
que responden a este aminoácido, se encuentran del tipo metabotrópicos e
ionotrópicos (Ver figura 1). Los receptores metabotrópicos están clasificados dentro
de tres grupos (Grupo 1-3) y hasta el momento se han encontrado ocho diferentes
(mGlu1-8). En los ionotrópicos encontramos tres tipos de receptores, los cuales
están caracterizados en función del agonista utilizado para su identificación; AMPA
(ácido propiónico de α-amino, 3-hidroxi, 5-metil, 4-isoxazol), Kainato y NMDA (NMetil-D-Aspartato) (Dingledine et al, 1999).
Figura 1. Clasificación de los Receptores de Glutamato. Los receptores
metabotrópicos de glutamato son ocho (mGlu1-8) y están clasificados dentro de tres
grupos (Grupo 1-3). En los receptores ionotrópicos encontramos los receptores AMPA,
Kainato y NMDA, caracterizados de acuerdo al agonista utilizado en su diferenciación.
Los receptores NMDA son complejos tetraméricos formado por combinaciones de las
subunidades NR1, NR2 y/o NR3. (Modificada de www.bris.ac.uk)
Generalmente la expresión de los receptores NMDA y no-NMDA (AMPA y
kainato) es sobre el mismo elemento postsináptico. Los receptores ionotrópicos de
3
glutamato presentan una secuencia homóloga similar que sugiere un origen evolutivo
común (Dingledine et al, 1999).
Dentro de los tres tipos de receptores ionotrópicos de glutamato, los
receptores NMDA (NMDAR) participan en la excitabilidad general y mecanismos de
señalización intracelular gracias a su permeabilidad al sodio, potasio y calcio. Este
último ión puede mantener la despolarización de la membrana y modular la actividad
de segundos mensajeros y enzimas intracelulares de neuronas. Para activarse, los
receptores NMDA necesitan dos moléculas de L-glutamato y dos moléculas de
glicina, aunque también el aspartato pude fungir como agonista y la D-serina como
coagonista (Ver figura 2). Algunos de los procesos donde está involucrada la
activación de los NMDAR son: la transmisión excitatoria, plasticidad sináptica (LTP y
LTD), desarrollo y maduración neuronal (Asztely and Gustafon, 1995) y en
patogénesis
de
desordenes
neurodegenerativos
mediante
mecanismos
de
excitotoxicidad (provocada por una excesiva entrada de calcio a la neurona) (Choi,
1992).
Figura 2. Agonistas fisiológicos del receptor NMDA. El glutamato (forma
ionizada del ácido glutámico) es el agonista principal del receptor NMDA y la
glicina es el co-agonista. El NMDAR también puede ser activado por aspartato
y D-serina (Imágenes de www.scitopics.com).
4
El receptor NMDA (NMDAR) posee propiedades farmacológicas y funcionales
únicas. Además de su alta permeabilidad al calcio (corriente fraccional de Ca2+
~13%)
(Elenes
et
al,
2009),
el
NMDAR
presenta
una
cinética
de
activación/desactivación lenta (con relación a los receptores AMPA) y en potenciales
de membrana en reposo, el poro del canal se encuentra bloqueado por iones
magnesio (Mg+2) en el lado extracelular, este bloqueo es dependiente de voltaje por
lo tanto puede ser retirado despolarizando la membrana (↑-50mV) (Cull-Candy et al,
2001).
Figura 3. Topología de las
subunidades del NMDAR.
Caracterizada por su gran Nterminal
extracelular,
los
segmentos transmembranales
TM1-4 más su asa re-entrante
en la región del poro (TM2), un
asa extracelular entre los
segmentos TM3-TM4 y el Cterminal
citoplasmático.
(Modificada
de
Johnson,
2003).
2.2 Receptores del tipo NMDA
2.2.1 Topología del NMDAR
Estructuralmente, las subunidades del receptor NMDA presentan una
topología transmembranal común (Ver Figura 3), la cual se caracteriza por un amino
terminal (N-terminal) extracelular largo, una región en la membrana compuesta por
tres segmentos (TM1-4) más un asa re-entrante en la zona del poro (TM2), un asa
extracelular entre los segmentos TM3-TM4 (región S2) y un carboxilo terminal (C5
terminal) citoplasmático que contiene sitios de interacción para proteínas
intracelulares. La región N-terminal contiene dos dominios; el dominio de unión del
agonista (ABD) dentro de la región S1 y el dominio N-terminal (NTD), ambos con
múltiples sitios blanco farmacológico (Dingledine et al, 1999).
2.2.2 Estequiometría del NMDAR
El receptor NMDA está formado por un complejo heteromultimérico de cuatro
subunidades (Béhé et al, 1995) (Ver Figura 4). Estas subunidades están clasificadas
dentro de tres familias definidas por su secuencia homóloga: NMDA Receptor 1
(NR1), NR2 y NR3. Se requieren dos subunidades NR1 expresadas en la
arquitectura del receptor para que sea funcional, las dos subunidades restantes son
combinaciones homo- y heterólogas entre las familia NR2 (A-D) y NR3 (A y B) (CullCandy et al, 2001).
Figura 4. Estequiometría del Receptor NMDA. Comprendida por cuatro
subunidades. Dos subunidades NR1 son necesarias para la funcionalidad del
receptor. Las otras dos son combinaciones entre los subtipos NR2 y NR3. El sitio
de unión para el L-glutamato está en NR2, mientras que NR1 posee el sitio para
la glicina. Ambas
tienen varios sitios blancos farmacológicos
(www.scitopics.com).
6
2.2.2.1 La subunidad NR1
La Subunidad NR1 (NMDA receptor 1) es esencial para la función del receptor
NMDA. Presenta el sitio de unión para la glicina, el co-agonista (Cull-Candy et al,
2001). Esta subunidad es codificada por un solo gen, pero existen ocho isoformas
(NR1a-4b) por “splicing” alternativo en tres sitios diferentes (exón 5, 21 y 22) (Ver
figura 5). El exón 5 codifica una secuencia de 21 aminoácidos en el amino terminal, y
los otros dos exones para secuencias adyacentes de 37 y 38 aminoácidos en el Cterminal (Das et. al, 1998). El tipo de isoforma de NR1 involucrada en la formación
del receptor le confiere al canal variación en algunas de sus propiedades. Por
ejemplo, la sensibilidad al pH de los NMDARs es determinado por la presencia del
exón 5 (en el amino terminal de NR1). A pH fisiológico los receptores que incluyen
esta variante se activan completamente, mientras que los receptores que carecen del
exón 5 están inhibidos de forma parcial (Traynelis et al, 1995). La diferente
sensibilidad
a
los
protones
de
receptores
NMDA
postsinápticos
influye
importantemente en la transmisión sináptica (Ver tema 2.4.6).
Figura 5. Diversidad de las
subunidades del receptor
NMDA. a) Dendrograma de la
secuencia
de
aminoácidos
completa de las subuidades del
NMDAR de rata (excepto NRB
humana). b) Representación de
los polipeptidos de la subunidad
NR2.
Las
líneas
negras
representan los segmentos
transmembranales y el asa
reentrante (línea gris). Los
asteriscos indican las zonas de
“splicing alternativos” (CullCandy et al, 2001).
7
2.2.2.2 La subunidad NR3
La tercera familia está compuesta por las subunidades NR3A y NR3B, cada
una codificada por su propio gen. El sub-tipo NR3A presenta dos isoformas y se
encuentran ampliamente distribuidas en el cerebro. NR3B no ha mostrado variantes
y su expresión predomina en neuronas motoras (Cull-Candy et al, 2001). Estas
subunidades solo son funcionales si están co-expresadas con NR1 y NR2 (Das et al,
1998). La co-expresión de la subunidad NR3A con NR1 y NR2A (receptores
NR1|NR2A|NR3A) forma canales que presentan una reducción en la conductancia a
nivel de canal unitario y disminuye también la permeabilidad al Ca+2 (Cull-Candy et
al, 2001). Para receptores NMDA que contienen solo las subunidades NR3A ó NR3B
(receptores NR1|2NR3A/B) han mostrado una función modulatoria negativa en el
canal y cuando están unidos solo con la subunidad NR1 forman receptores
ionotrópicos con apertura dependiente solo de glicina, que a pesar de las
propiedades inhibitorias de este neurotransmisor, en estos receptores (NR1|NR3A/B)
la glicina genera una actividad excitatoria (Chatterton et al, 2002).
Los receptores NR1|2NR3A/B son impermeables al calcio, resistentes al
bloqueo por magnesio,
MK-801 y memantina (Cull-Candy et al, 2001). Se ha
encontrado que la subunidad NR3A se asocia con NR2A y NR2B en el cerebro
adulto, sugiriéndose la presencia de receptores NMDA triheterómeros compuestos
por combinaciones NR1|NR2A/B|NR3A. La presencia de diferentes combinaciones
de subunidades en los receptores NMDA, en especial las de la familia NR2, confiere
al canal variabilidad en sus propiedades cinéticas y farmacológicas (Dingledine et al,
1999).
8
2.2.2.3 La subunidad NR2
La familia NR2 está formada por cuatro subtipos: NR2A, NR2B, NR2C y
NR2D, provenientes de genes diferentes. La subunidad NR2C presenta dos
isoformas que generan polipéptidos truncados después de la región TM1 ó TM3. El
subtipo NR2D tiene una isoforma por transcripción diferencial en el C-terminal,
produciendo una secuencia de 33 aminoácido adicionales, similar a NR3A con una
isoforma de 20 aminoácidos en su carboxilo terminal. La s subunidades NR2B, NR2C
y NR2D también presentan una variante en una región no traducida en la posición 52
(Ver figura 5b) (Cull-Candy et al, 20001).
A diferencia de NR1, la distribución de los subtipos NR2 está restringida para
ciertos núcleos definidos dentro del SNC y sus patrones de expresión cambian
durante el desarrollo (Monyer et al, 1994) (Ver tema 2.4). La subunidad NR2 es la
principal determinante de la diversidad funcional de los receptores NMDA. Influye en
su sensibilidad farmacológica y en muchas de sus propiedades biofísicas,
principalmente en su conductancia (Stern et al, 1992; Wyllie et al, 1996), cinética de
desactivación y desensibilización del receptor (Vicini et al, 1998), afectando
directamente en la duración de las corrientes postsinápticas excitatorias (Lester et al,
1990).
2.2.2.3.1 Conductancias de la subunidad NR2
El receptor NMDA posee un canal iónico permeable a cationes: Na+, K+ y
Ca2+. Este canal ostenta un nivel principal de conductancia y un sub-estado (Ver
figura 6). La magnitud de ambos niveles depende de cada subunidad NR2. Las
subunidades NR2A y NR2B (ambas con secuencia TM2 idéntica) tienen
conductancias muy similares llamadas; conductancias largas (Ver Figura 7a, b). Las
dos conducen principalmente a 50pS y además, presentan un breve subnivel de
40pS con tiempos de apertura y frecuencia de subniveles idénticas (Stern et al,
1992). En cambio, las subunidades NR2C y NR2D presentan conductancias más
cortas (Ver Figura 7c, d), una de 35pS y un subnivel de 17pS. Sin embargo, hay
diferencias en la manera en que conducen estas dos subunidades. Las repuestas de
9
NR2C son aperturas breves en sus dos subniveles, con misma duración. Mientras
que la mayoría de las aperturas de NR2D ocurren en el subnivel de 17pS (Wyllie et
al, 1996).
Figura 6. Conductancia principal y sub-estado de receptores NR1|NR2D. Los
receptores NMDA ensamblados por subunidades NR2 exhiben dos niveles de
conductancias al activarse (Modificada de Wyllie et al, 1996).
Figura 7. Conductancia del Receptor NMDA. A y B. Las conductancias largas de
54pS y 41pS características de las subunidades NR2A y NR2B. B y C, conductancias
cortas de 30 y 16pS producidas por las subunidades NR2C y NR2D. (Modificada de
Stern et al, 1992: Wyllie et al, 1996).
10
Figura 8. Efecto del calcio en la conductancia del canal del receptor NMDA. A)
La concentración del calcio extracelular (0, 0.85 y 5mM) afecta directamente los
niveles de conductancia del canal del NMDAR, reduciéndola conforme el calcio
aumenta. B) Los dos sub-estados de conductancia se vuelven indistinguibles
cuando la el medio extracelular está libre de calcio. (Modificada de Wyllie et al,
1996).
11
La presencia del sub-estado de conducción del canal del receptor NMDA se
debe al Ca2+ (Wyllie et al, 1996). Cuya permeabilidad en este canal (estudiado en
subtipos NR2A) exhibe una corriente fraccional ~13% (Elenes et al, 2009). Aunque
en diferentes condiciones de calcio externo se ha observado que la magnitud del
subnivel puede variar (Wyllie et al, 1996; Gibb and Colquhoun, 1992; Lester et al,
1990; Vicini et al, 1998). Un incremento de calcio produce una disminución en la
conductancia del canal, afectando de diferente manera los dos niveles de
conductancias (Ver figura 8A), mientras que en condiciones libres de calcio la
diferencia entre los dos sub-estados es indistinguible (Ver figura 8B) (Gibb and
Colquhoun, 1992).
Los niveles de conductancias largas estudiadas en receptores recombinantes
por Stern y cols. (1992) son muy similares a los encontrados en neuronas CA1 de
hipocampo activados por L-glutamato en rata adulta (Gibb and Colquhoun, 1992).
También se había observado desde hace tiempo la presencia de receptores NMDA
de baja conductancia y sensibilidad a magnesio reducida en varios tipos de
neuronas, incluyendo de cerebelo en cultivo (Cull-Candy and Usowicz 1987), médula
espinal (Momiyama et al, 1996), giro dentado (Pifia-Crespo and Gibb 1996) y en
células Purkinje y granulares de cerebelo (Farrant et al, 1994).
2.2.2.3.2 Transiciones directas
Las transiciones directas son consideradas como un cambio en los niveles
de conductancias de un canal abierto, desde un nivel principal a un sub-estado (ej.
de 51pS a 40pS). Esta propiedad que sirve como criterio de exclusión entre las
subunidades de conductancias cortas (NR2C y NR2D) (Ver Figura 9). Solo para el
caso de la subunidad NR2D, la frecuencia de transiciones entre el nivel principal de
conductancia y el sub-estado presenta una asimetría temporal, es decir, los eventos
de 41pS a 18pS son más frecuentes (60%) que los eventos de 18 a 41pS (40%)
(Wyllie et al, 1996).
12
En las células de Purkinje en la primera semana de desarrollo, se había
observado previamente la presencia de mRNA de la subunidad NR2D (Akazawa et
al, 1994) y posteriormente se notó que los canales expresados elucidaban
conductancias cortas con una asimetría en sus transiciones (Momiyama et al, 1996),
consistente con la observada en la subunidad NR2D con receptores expresados en
ovocitos de Xenopus por Wyllie y cols. (1996).
Figura 9. Transiciones directas
del
receptor
NMDA.
Transiciones entre sus niveles
de conductancias cortas (4118pS) y conductancias largas
(54-41pS). Las conductancias
cortas son características de las
subunidades NR2C y NR2D,
mientras que las subunidades
NR2A y NR2B son responsables
de las conductancias largas. A y
B; la subunidad NR2D presenta
una asimetría de transición (22%
de 18 -41pS y 78% para la
transición
41-18pS).
C;
la
proporción entre los niveles
largos
(54-41pS)
de
las
subunidades NR2A y NR2B es
simétrico (47% en 41-54pS y
54% de 54-41pS) (Jones and
Gibb, 2005).
Además de la conductancia del receptor NMDA, otras propiedades del
NMDAR varían también, como la sensibilidad al bloqueo por magnesio cambia
notablemente entre los subtipos NR2 del receptor NMDA. En receptores
recombinantes compuestos por las subunidades NR1|2NR2A ó NR1|2NR2B son más
susceptibles al bloqueo por Mg+2 (2.4 y 2.1μM) que receptores compuestos por
NR1|NR2C ó NR1|NR2D (14.2 y 10.2μM). Por tal motivo, los diferentes subtipos de
13
receptores NMDA son activados a distintos rangos de potencial de membrana.
Adicionalmente, la sensibilidad por el L-glutamato,
desensibilización, cinética de
desactivación, así como una diferente sensibilidad farmacológica, son propiedades
que también se encuentran influenciadas por la subunidad NR2 presente (ver tabla 1)
y marcan una diferencia en el umbral de activación, modulación y duración de las
corrientes postsinápticas excitatorias mediadas por el receptor NMDA (NMDA-EPSC)
(Cull-Candy et al, 2001; Lester et al, 1992).
Tabla 1. Propiedades de los subtipos NR2 del receptor NMDA.
NR1|NR2A NR1|NR2B NR1|NR2C NR1|NR2D Conductancia (pS) 50/40 50/40 ~38/18 Transiciones entre conductancias simétricas simétricas simétricas 510 440 235 No exhibe Constante de desactivación (ms) 54 280 306 1700 Glutamato DE50 (μM) 2.8 1.2 0.9 0.4 Bloqueo por Mg2+ IC50 (μM) 2.4 2.1 14.2 10.2 Inhibición por Zn2+ IC50 (μM) 0.02 2.0 20 10 inhibición por ifenprodil DE50 (μM) >30 0.15 >30 >30 Bloqueo por argiotoxina‐636 IC50 (μM) 0.009 0.005 0.46 ND Constante de desensibilización (ms) ~38/18 35 asimétricas 67% de 38→18 Abreviaturas: pS, picoSiemens; ms, milisegundos; DE50, dosis efectiva 50%; IC50,
concentración inhibitoria 50%; μM, micromolar. (Wyllie et al, 1996; Vicini et al, 1998; Paoletti
and Neyton, 2007; Dravid and Traynelis, ).
14
2.3 Cinética del receptor NMDA
El glutamato se libera de las vesículas de las neuronas presinápticas en la
hendidura sináptica a manera de breves pulsos durante un pequeño instante,
alcanzándose concentraciones alrededor de 1mM que caen con una constante de
tiempo de 1ms, el cual es suficiente para desarrollar su función, activando
principalmente dos tipos de receptores postsinápticos: los
NMDA y no-NMDA
(AMPA y Kainato), aunque también se encuentran algunos mGluR post- y
presinápticos (Mayer and Westbrook, 1987).
2.3.1 Componentes glutamatérgicos postsinápticos
La señal glutamatérgica general desencadenada en la región postsináptica se
conforma principalmente por un componente rápido, seguido de uno lento. El primero
en generarse es mediado por los receptores no-NMDA, mientras que el componente
de los receptores NMDA aparece con una lenta activación (con relación a los noNMDA) y una larga fase en decaimiento (Ver figura 10) (Nestler et al, 2001).
Comparativamente, las fases de decaimiento de los dos componentes difieren al
menos en unas cien veces a razón de la diferente afinidad con que L-glutamato se
une a estos dos tipos de receptores. Una baja afinidad, implica una constante de
rapidez de disociación (k-1) alta del complejo neurotransmisor-receptor y con ello, un
efecto macroscópico con cinética rápida. Por el contrario, el L-glutamato se une a los
receptores NMDA con mayor afinidad provocando que su efecto sea más
prolongado, con un tiempo suficiente para que el receptor NMDA pueda abrirse y
cerrarse repetidas veces (Lester and Jahr, 1992).
Las propiedades biofísicas de un receptor determinan su modo de
funcionamiento. Como se ha observado, la mayoría de las propiedades biofísicas y
farmacológicas del receptor NMDA dependen de la subunidad NR2 (A-D) expresada.
La principal repercusión ésta variación biofísica de los receptores NMDA es sobre la
duración
de
sus
corrientes
postsinápticas
excitatorias
(NMDA-EPSC),
que
específicamente es afectada directamente por el tiempo de desactivación del
receptor NMDA (Lester et al, 1990).
15
Figura 10. Componentes glutamatérgicos postsinápticos. El glutamato genera
dos componentes postsinápticos que pueden ser separados farmacológicamente.
En voltajes positivos, el antagonista D-APV bloquea los receptores NMDA
(izquierda) revelando el componente rápido generado por los AMPARs. Por el
contrario, el bloqueo de los receptores AMPA con CNQX (derecha) deja visible un
componente de activación y desactivación lenta regulado por los NMDARs. Para
voltajes negativos solamente se refleja participación de los receptores AMPA
debido al bloqueo por Mg2+ de los NMDARs a este potencial de membrana
(Modificada de Nestler et al, 20001).
2.3.2 Tiempo de activación
El tiempo de activación de los receptores NMDA es más lento en comparación
con los receptores AMPA (Ver figura 10). Representa el tiempo de compuerta del
canal una vez que se ha unido el agonista (k1) y dentro de las subunidades NR2
existe una variación. Recientemente se determinó el tiempo de activación de la
subunidad NR2C (Dravid and Traynelis, 2009) con un valor de 4.6ms después de ser
activada con glutamato 1mM; glicina 0.5mM/5ms (Ver figura 11). Con respecto a los
subtipos NR2A y NR2D sabemos que difieren considerablemente por experimentos
de Wyllie y cols. (1998), el subtipo NR2A presenta una constante de 13.4+/-3.9ms,
mayor que NR2D (Ver figura 12).
16
Figura 11. Tiempo de activación de receptores NR1|NR2C. La línea arriba del trazo
(izquierda) muestra un pulso de 5ms de aplicación de gltamato 1mM y 0.5 de glicina que
desencadena la activación del receptor NMDA. El tiempo que tarda en abrirse el canal
fue de 4.6ms (derecha) (Dravid and Traynelis, 2009).
Figura 12. Activación de las subunidades NR2A y NR2D. Experimentos de Wyllie y
cols. (1998) aplicando 1mM de glutamato y 20μM de glicina (línea encima de los trazos)
revelan una diferencia en la cinética de activación y desactivación entre los subtipos
NR2A (13.4ms) y NR2D (Modificada de Wyllie et al, 1998).
17
2.3.3 Tiempo de desactivación del NMDAR
La constante de desactivación de un receptor ionotrópico, es el tiempo que
dura en caer su corriente
(hasta un 37% del pico, de acuerdo al modelo que
describe un comportamiento exponencial) una vez que el agonista es removido de su
sitio de unión. Para caso del NMDAR, su tiempo de desactivación juega un papel
muy importante para producir respuestas de diferente duración en la comunicación
interneuronal a nivel sináptico (Lester and Jahr, 1992). Las cuales pueden ser muy
rápidas como las generadas en receptores di-homólogos NR1|NR2A, ó corrientes
más prolongadas inferidas por la subunidad NR2D (Vicini et al, 1998) que difieren
~30 veces implicando más de 1.5 segundos de diferencia.
Figura 13. Curso temporal de desactivación. Corrientes del receptor NMDA en
células HEK-293 trasnfectadas con los diferentes ADNc de las cuatro subunidades
de la familia NR2 (NR2A-D). Las corrientes fueron activadas por la aplicación de Lglutamato (1mM) durante 1 ms (línea debajo de cada trazo). Los cuatro subtipos NR2
presentaron similar activación rápida (<0.5ms), mientras que los tiempos de
desactivación variaron de 54, 280, 306 y 1700ms para las subunidades NR2A,
NR2B, NR2C y NR2D, respectivamente. (Vicini et al, 1998).
18
La diferencia entre los tiempos de desactivación de receptores NMDA
compuestos por diferentes subtipos NR2 es muy notable (Ver Figura 13). La NR2A
es la subunidad que tiene la cinética de desactivación más rápida (τ=54ms), mientras
que NR2D es la más lenta (≈1700ms). Para el caso de las subunidades NR2B y
NR2C, sus tiempos de desactivación son relativamente similares, 280 y 306ms,
respectivamente. La subunidad NR1 no está involucrada en la desactivación del
receptor NMDA (Vicini et al, 1998).
Después de un pulso breve de agonista (Glutamato 1mM; 20μM glicina), la
cinética del receptor NMDA presenta una activación aparentemente similar para
todos los subtipos NR2, después le sigue una lenta desactivación que se ajusta bien
a dos componentes exponenciales. Esta cinética está comprendida por dos fases;
primero se encuentra una fase rápida, seguida de una más lenta. La contribución de
ambas fases; rápida y lenta, determinan la constante τ. La proporción del
componente rápido se va reduciendo conforme el orden NR2A>NR2B>NR2C>NR2D
y viceversa para la proporción del componente lento (Vicini et al, 1998). Los factores
que participan en la generación de ambos componentes, rápido y lento, pueden
ayudar a explicar el comportamiento en la cinética de los receptores NMDA
ensamblados por cada subunidad NR2 y aún son sujeto de estudio. La afinidad con
que se une al glutamato a cada una de ellas es un factor que influye en el
componente rápido. Por ejemplo, la subunidad NR2 ostenta el componente más
rápido, proporcional a la poca afinidad del glutamato por esta subunidad, ya que se
requieren 2.8μM, dosis 7 veces mayor a NR2D (0.4 μM), subtipo cuyo componente
rápido contribuye poco en la desactivación. Conducta similar para NR2A (0.9 μM) y
NR2B (1.2 μM) (Leste and Jahr, 1992). La desensibilización es un factor que influye
en el componente lento de la desactivación del NMDAR.
19
2.3.4 Desensibilización del NMDAR
La desensibilización es un proceso reversible de adaptación, en donde la
respuesta celular es reducida ante la presencia de un estímulo prolongado. Para
receptores que tienen acoplado un canal iónico (como el receptor NMDA), ellos
traducen señales químicas en impulsos eléctricos abriendo su poro transmembranal
en respuesta a la unión de su molécula neurotransmisora. Después de la activación,
varios receptores entran a un estado desensibilizado, donde el canal iónico ya no
conduce pero el neurotransmisor permanece unido (Alberts et al, 2002).
Figura 14. Tiempo de
Recuperación
de
la
desensibilización
del
Receptor
NMDA.
Receptores constituidos
por
las
subunidades
NR2A
y
NR2B.
La
subunidad
NR2A
es
afectada muy poco por el
fenómeno
de
desensibilización (~10%)
(A), mientras que el
subtipo NR2B presenta
una desensibilización más
prominente (~60%) (B) y
su
salida
de
la
desensibilización es hasta
los 1200 ms (C). (Vicini et
al, 1998).
Vicini y cols. (1998) determinaron el tiempo de salida de la desensibilización
de receptores NR1|NR2A y NR1|NR2B. Este periodo se refiere al tiempo que tarda
en recuperarse el total de los receptores que fueron desensibilizados después de
haber recibido un pre-pulso de agonista (12ms), y es determinado aplicando un
segundo pulso de prueba diferentes intervalos de tiempo (40, 80, 200-1200ms) con
respecto al pre-pulso. A la subunidad NR2A, quien presenta la cinética de
20
desactivación más rápida, parece no afectarle el fenómeno de la desensibilización
para pulsos breves de agonista (Ver Figura 14A), ya que exhibe una tenue entrada al
estado desensibilizado (10-15%), mientras que la subunidad NR2B (Ver Figura 14B),
quien sufre una desensibilización alrededor del 60% y requiere de 1200ms para
recuperarse de la desensibilización (Ver Figura 14C) muestra un componente lento
más prolongado en su cinética de desactivación (Vicini et al, 1998).
Figura 15. Desensibilización de los subtipos NR2 para pulsos largos de
agonista. A. Corriente de NR2A generada por 4s de aplicación de agonista
(glutamato 1mM; glicina 20μM) que muestra una constante de decaimiento de
510ms. B. 1mM; glicina 20μM durante 3s genera una entrada a la desensibilización
de 440ms en NR2B. C. La subunidad NR2C presenta una constante de 325ms
mientras que NR2D (D) no exhibe desensibilización aparente (Modificadas de: Dravid
and Traynelis, 2009; Banke and Traynelis, 2003; Wyllie et al, 1998).
Protocolos con pulsos largo de agonista ayudan a observar de una mejor
manera la aportación de la desensibilización al componente lento de desactivación,
El componente lento más pronunciado de las subunidades NR2 es el de la subunidad
NR2D (Wyllie et al, 1998), esta subunidad no muestra desensibilización aparente
21
(Figura 15D), lo cual es congruente con su cinética. Entre los subtipos NR2B y NR2A
(Figura 15A, B), el tipo NR2B presenta un componente lento más prolongado (Vicini
et al, 1998) porque su entrada a la desensibilización es más lenta 440ms (Banke and
Traynelis, 2003) contra 510ms en NR2A (Wyllie et al, 1998). De manera similar
NR2C (Figura 15C) que por su desensibilización de 235ms genera un componente
lento mayor que NR2B (Dravid and Traynelis, 2009) (Ver figura13).
Figura 16. Modelo simplificado de la cinética del NMDAR. Receptor NMDA (R)
con sitios de unión para dos moléculas de agonista (A). Una vez unidas las dos
moléculas de agonista al receptor (A2R), éste puede abrirse (A2R*) ó entrar a un
estado desensibilizado (A2D) (Lester et al., 1992).
Inicialmente, una vez unidos los agonistas, el NMDAR desencadena ráfagas
de aperturas, después hay una alta probabilidad que el poro del canal vuelva a
abrirse ó que entre a un estado desensibilizado. Saliendo de la desensibilización, el
receptor puede abrirse otra vez antes de que el neurotransmisor se disocie (Ver
Figura 16) (Lester and Jahr, 1992). De esta manera, la entrada y salida de la
desensibilización del NMDAR participa en la generación del componente lento de su
cinética de desactivación. Pero aunque la lenta recuperación de la desensibilización
es parcialmente responsable de la cinética de desactivación del NMDAR, las
diferencias entre las constantes de desactivación encontradas por Lester y Jahr
(1992) usando un agonista de baja afinidad (desensibilizador pobre; L-Cisteato),
indica la presencia de más factores involucrados en la cinética de desactivación de
los NMDAR.
22
2.3.5 Análisis de aperturas y cierres de receptores NR1|NR2A y NR1|NR2D
La cinética de las aperturas y cierres (trenes) del canal acoplado al receptor
NMDA es otro factor que ayuda explicar la cinética de desactivación de cada subtipo
NR2. Como las subunidades NR2A y NR2D son los subtipos que han mostrado
mayor diferencia en su cinética de desactivación (54 y 1700ms, respectivamente)
Wyllie y cols., (1998) estudiaron el comportamiento de la activación de las
subunidades NR2A y NR2D del receptor NMDA a nivel de canal unitario, ambas
subunidades mostraron tres tiempos de aperturas: NR2A: 0.062+/-4ms; 31%, 1.01+/0.13; 16% y 3.64+/-0.51; 54% y NR2D: 0.098+/-19; 20%, 0.872+/-0.091; 34% y
2.58+/-0.14; 46%.
2.3.5.1 Tiempo crítico
El análisis de los estados cerrados de Wyllie y cols. (1998) en experimentos
de parche de membrana, con una aplicación continua de agonista a bajas
concentraciones (glutamato 100nM) mostró cinco componentes exponenciales para
la subunidad NR2A y seis para NR2D (Ver figura 17A y B).
Figura 17. Distribución de los estados cerrados de receptores NR1a|NR2A (A)
y NR1a|NR2D (B). Cada registro de canal unitario con bajas concentraciones de
glutamato (100nM) generan una distribución de sus estados cerrados los cuales se
ajustan a cinco (NR2A) y seis (NR2D) componentes exponenciales. Los tiempos
críticos para cada subtipo son 88 y 1019ms, respectivamente (Wyllie et al, 1998).
23
Mediante este análisis se pudo determinar el tiempo crítico (tcrit) para cada
subtipo: NR2A 88 ms y NR2D 1019 ms. Este tiempo es necesario separar el grupo de
aperturas y cierres (trenes) de dos canales unitarios activados a diferentes tiempos,
en otras palabras, es el tiempo del estado cerrado, a nivel de canal unitario, que
separa la activación de un canal con respecto a otro. Para el caso de la subunidad
NR2A, la distribución de los estados cerrados no mayor a 88ms son considerados
como la activación de un solo canal. Mientras que para el subtipo NR2D el tiempo de
cierre que separa la actividad de dos canales fue 1019ms. El tiempo critico es
determinado ubicando el valle que se encuentra entre el último y penúltimo
componente de cada gráfica de la distribución de los estados cerrados.
Figura 18. Distribución de las longitudes de los trenes de receptores
NR1a|NR2A (A) y NR1a|NR2D (B). La distribución de la longitud de los trenes de
ambas subunidades se ajusta a seis componentes exponenciales con diferentes
áreas (Wyllie et al, 1998).
2.3.5.2 Distribución de la longitud de trenes
Considerando el tiempo crítico, Wyllie y cols. (1998) pudieron determinar que la
distribución de la longitud de los diferentes trenes durante cada activación del canal
de ambas subunidades (NR2A y NR2D)
se ajustaban a seis componentes
24
exponenciales a diferentes proporciones: NR1a|NR2A: 42μs (39%), 380μs (8%),
1.88ms (8%), 4.08ms (14%) y 201ms (14%); NR1a/NR2D: 71μs (8%), 1.03ms (18%),
4.71ms (14%), 65.6ms (6%), 1405ms (31%) y 5175ms (23%) (Ver figura 18). Esto
quiere decir que la activación de cada una de estas subunidades se puede dar en
promedio con seis diferentes tipos trenes con diferente probabilidad de apertura
dentro de ellos (0.35+/-0.05 y 0.04+/-0.02 para NR2A y NR2D, respectivamente). La
subunidad NR2D posee los trenes de mayor duración (1405ms y 5175ms) con una
mayor proporción (31% y 23%, respectivamente), mientras que el subtipo NR2A
presenta trenes de menor longitud de tiempo (menor a 201ms).
2.3.5.3 Alineación y suma de trenes
La alineación de los trenes de cada subtipo muestra que la duración de los
trenes más largo de la subunidad NR2D fue de 45 segundos, mientras que los de la
subunidad NR2A nunca sobrepasaron los 1500 ms. Wyllie y colaboradores (1998)
alinearon los trenes de cada subtipo (1403 de NR2A y 647 de NR2D) en el inicio de
cada activación (Ver figura19A y 20A)
y los sumaron para cada uno de ellos,
observando que en los trazos generados, las constantes de tiempo del ajuste
exponencial para el decaimiento de la corriente de cada subtipo (Ver figura 19B y
20B) es similar al descrito por las constantes de tiempo identificadas por la
distribución de la longitud de los trenes (Ver figura 18) y es congruente con las
constantes de desactivación descritas para cada subunidad (Ver figura 13).
El trabajo de Wyllie y cols. (1998) nos muestra claramente que la constante de
desactivación de cada subunidad NR2 (A-D), es un reflejo de la variación en el
comportamiento de las aperturas y cierres (trenes) del canal al activarse cada subtipo
de receptor NMDA. Y a razón de que los cuatro subtipos NR2 contribuyen de diferente
manera en la duración de las corrientes postsinápticas excitatorias (Lester et al, 1992)
es importante comprender el comportamiento cinético de cada una de ellas, su
probabilidad de apertura, duración de las mismas, longitud de sus trenes y la
influencia del tiempo de desensibilización, para poder entender la variación en sus
constantes de desactivación.
25
Figura 19. Trenes de NR1a/NR2A. A, alineación de los diferentes trenes generados
por el subtipo NR2A en el inicio de cada apertura. B, trazo de la suma de 1403 trenes
alineados, la línea punteada superpuesta
es el ajuste exponencial con seis
componentes: 201ms, 40.6ms, 4.08ms, 1.88ms, 0.380ms y 0.042ms. C, ilustración
expandida del tiempo base del ajuste del pico en B. (Wyllie et al, 1998)
26
Figura 20. Trenes de NR1a/NR2D. A, alineación de los diferentes trenes generados
por
la subunidad NR2D al inicio de cada activación, se muestra la expansión de un
fragmento. B, trazo de la suma de los 647 trenes alineados, la línea punteada
superpuesta
es el ajuste exponencial a cuatro componentes: 5174ms, 1405ms, 65.6ms,
4.71ms, 0.380ms y 0.042ms (Wyllie et al, 1998).
27
2.3.6 Cinética de la subunidad NR2C
La subunidad NR2C ostenta algunas propiedades similares al subtipo NR2D.
Receptores NR1|NR2C y NR1|NR2D expresados en ovocitos de Xenopus, ambos
han mostrado dos niveles de conductancias en condiciones fisiológicas de pH y
presentan menor dependencia de voltaje para el desbloqueo por Mg2+ que las
subunidades NR2A y NR2D (Stern et al, 1992; Clarke and Johnson, 2006). Un
análisis de aperturas y cierres de receptores NR1|NR2C en registro de parche de
membrana, en presencia de concentraciones efectivas máximas de agonista
(glutamato 1mM; glicina 0.5mM) (Ver figura 21A), en este mismo sistema, revelaron
que su probabilidad de apertura es baja (0.011+/-0.02) y el tiempo de apertura es
muy corto (0.52+/-0.04ms) (Ver figura 21B) (Dravid and Traynelis, 2009), la
probabilidad de apertura difiere en un orden de 44 y 10 veces en comparación con
las subunidades NR2A (0.35) y NR2B (0.11), respectivamente. (Banke and Traynelis,
2003; Erreger et al, 2005) pero es muy similar a la probabilidad de apertura dentro de
los trenes de la subunidad NR2D (0.04) (Wyllie et al, 1998), pero su bajo tiempo de
apertura nos señala que es la subunidad NR2 el subtipo de menor estabilidad por el
estado abierto. Los estados cerrados de NR2C muestra periodos largos que exceden
los 100ms (Ver figura 21C), reflejando el grado de desensibilización de esta
subunidad (Dravid and Traynelis, 2009).
28
Figura 21. Análisis de
aperturas y cierres de receptores NR1|NR2C. Obtenidos
de corrientes unitarias de registros de parches de membrana utilizando
concentraciones efectivas
máximas de agonistas (gllutamato 1mM; glicina 0.5mM).
A. histograma de frecuencia de 2647 estados abiertos, mostrando una corta duración
principal de 0.54ms. B. histograma de 2646 estados cerrados ajustados a cinco
componentes. Los estados cerrados de NR2C muestra periodos largos que exceden
(Dravid and Traynelis, 2009).
los 100ms
2.3.7 Receptores NR1|NR2B
Las subunidades NR2B y NR2C poseen una constante de desactivación y
similar (Vicini et al, 1998), Pero difieren en algunos parámetros dentro de los trenes,
el más notable es la duración en el estado abierto del canal. La activación de
receptores NR1|NR2B activados por glutamato 1mM; glicina 20μM durante 3ms
evoca trenes con una duración de apertura de 3.2ms, (Ver figura 22a) con 0.46+/0.06 de probabilidad de apertura dentro de ellos (Ver figura 22b), similar a NR2A. Los
29
trenes de NR2B revelados estaban separados por cinco estados cerrados: 0.1 (29%),
0.89 (43%), 15.2 (22%), 69.6 (7%) y 1060ms (6%) (Ver figura 22c) (Banke and
Traynelis, 2003). Sería interesante ver la contribución de la longitud de los trenes de
ambas subunidades sobre el comportamiento de sus corrientes macroscópicas de
desactivación (Ver figura 13).
Figura 22. Cinética del receptor NMDA. a. trenes de receptores NR2B evocadas por
glutamato 1mM; glicina 20μM/ 3ms. b. Distribución del estado abierto (3.2ms) y c, una
distribución de estados cerrados que se ajustan a 5 componentes (Banke and
Traynelis, 2005).
30
2.3.8 Implicaciones fisiológicas de la subunidad NR2
La diferente cinética que le confieren las subunidades NR2 al receptor NMDA
tiene varias implicaciones fisiológicas, debido a que estos subtipos muestran
diferentes patrones de expresión en el sistema nervioso central (Monyer et al, 1994)
que cambian con el desarrollo (Takai et al, 2003) y con la experiencia (Ver tema 2.4).
Por ejemplo, la subunidad NR2A se encuentra ampliamente distribuida a través del
SNC y los subtipos de receptores NMDA que contienen esta subunidad regulan
corrientes postsinápticas excitatorias en muchas sinápsis centrales (Ej. hipocampo,
células de Purkinje, mesencéfalo y diencéfalo) (Takai et al 2003), mientras que de la
subunidad NR2D no hay evidencias claras de su participación en la regulación de las
zona sináptica (Momiyama et al, 1996), además, la cinética lenta de receptores
NR1a/NR2D implicaría que las corrientes mediadas por esta combinación duraría
varios segundos (τ=1700ms) en comparación con las otras subunidades NR2
(τ<481ms) (Vicini et al, 1998).
La subunidad NR2D se ha observado en etapas embrionarias en mesencéfalo
y medula espinal con un pico máximo de expresión en el día postnatal siete (Monyer
et al, 1994). En cerebelo la presencia de receptores NR1a/NR2D somáticos pero solo
en la primera semana de nacimiento (Akazawa et al, 1994). También las neuronas
del asta dorsal de la médula espinal expresan receptores NMDA que contienen la
subunidad NR2D pero no se sabe si estos receptores regulan las EPSCs ó si son
receptores extrasinápticos (Momiyama et al, 1996).
Es factible que los receptores NMDA que expresan la subunidad NR2D
podrían ser activados de modo basal por el glutamato libre, ya que presentan una
alta afinidad este neurotransmisor, son poco sensibles al bloqueo por magnesio y la
respuesta que genera este subtipo es sostenida. Esta actividad podría resultar en
una lenta pero prolongada entrada de calcio a las células que se encuentran
expresando esta subunidad en particular, coordinando la actividad pre- y
postsináptica permitiendo cierto grado de flexibilidad temporal para la formación de
ciertas sinápsis en el desarrollo (Wyllie et al, 1998), que es la etapa de mayor
expresión de la subunidad NR2D (Monyer et al, 1994). 31
Por otra parte, la subunidad NR2C abunda en el cerebro adulto de rata,
apareciendo después de los primeros 10 días postnatales (Karavanova et al, 2007),
está presente también en bulbo olfatorio, tálamo y en interneuronas de la corteza
cerebral e hipotálamo (Monyer et al, 1994). Estudios sobre neuronas granulares del
cerebelo de ratones NR2C knockout muestran un aumento en sus corrientes
postsinápticas excitatorias, sustentando la baja probabilidad de apertura de los
receptores NR1|NR2C (Lu et al, 2006), pero a pesar de su baja probabilidad de
apertura
esta
subunidad
contribuye
significativamente
en
las
corrientes
características de las sinápsis de células granulares de cerebelo (Dravid and
Traynelis, 2009). Primero, porque se ha observado en estas células una cinética
lenta de desactivación congruente con NR2C, la amplitud de las corrientes evocadas
en ratones NR2C knockout es aproximadamente 2 veces mayor en comparación con
ratones nativos y el decaimiento de las corrientes es más rápido, congruente con la
alta probabilidad de apertura y la caída de las corrientes de los receptores NR2A y
NR2B que podrían estar remplazando al subtipo NR2C (Cathala et al, 2000).
Adicionalmente, las propiedades biofísicas del receptor NMDA compuestos
por subunidades NR2 solo han sido estudiadas en receptor di-homólogos (Dingledine
et al, 1999; Vicini et al, 1998, Wyllie and Traynelis) y aun no están caracterizadas
completamente (Banke and Traynelis, 2003; Dravid and Traynelis, 2009), Pero la
estequiometría del receptor NMDA no solo puede estar formada por di-homólogos de
las subunidades de la familia NR2 (NR1|NR2A ó NR|NR2B, etc.), hay evidencia de
receptores que tienen incorporada dos subtipos diferentes (Green and Gibb, 2001;
Jones and Gibb, 2005) (además de los complejos ternarios que la subunidad NR3
puede generar en combinación con NR1 y NR2), turnado más complejas las
propiedades biofísicas y farmacológicas del receptor NMDA (Vicini et al, 1998;
Paoletti and Hatton, 2005).
32
2.4 Patrones de expresión de los subtipos de NMDARs
2.4.1 Distribución de NR1 y NR2 en el desarrollo
El nivel de expresión de las subunidades NR2 varía con la etapa de desarrollo
pero la distribución de cada subunidad casi no ha mostrado cambios respectivos con
la edad (ver tabla 2). Para el caso de la subunidad NR1 que es esencial para la
formación de NMDAR funcionales, no se ha mostrado evidencia de su expresión en
la región temporal de la corteza cerebral e hipocampo en etapas embrionarias, pero
en neonatos su expresión está ampliamente distribuida en todo el sistema nervioso
central, tal como en la corteza cerebral, células de Purkinje, mesencéfalo y
diencéfalo (Ver Figura 23), siendo las neuronas de la corteza cerebral y las células
piramidales del hipocampo donde se muestra mayor intensidad de expresión. La
subunidad NR2A y NR2C tienen patrones de expresión similar a NR1 en esta etapa.
Pero la expresión de la subunidad NR2B tiene diferencias en su intensidad y en su
distribución. NR2B se ha observado desde etapas embrionarias a varios días
postnatales en el hipocampo y en la región temporal de la corteza cerebral (Takai et
al, 2003).
Las subunidades NR2A y NR2B abundan más en neuronas centrales,
encontrándose principalmente receptores NMDA formados por heteromultímeros de
NR1, NR2A y NR2B. Las combinaciones NR1|NR2A y NR1|NR2B son las más
predominantes, aunque también se han encontrado receptores triheterómeros de
NR1|NR2A|NR2B (Wenzel et al, 1995).
La subunidad NR2B predomina principalmente en el nacimiento. La expresión
de la subunidad NR2A comienza a manifestarse a las pocas semanas postnatales,
remplazando a la subunidad NR2B. Esto explica porque con la maduración los
cambios en la composición de los NMDARs resultan en EPSCs que presentan una
cinética más rápida y que son notablemente menos sensibles a fármacos
antagonistas de la subunidad NR2B. Se cree que este cambio es una regulación de
los NMDARs que está directamente relacionado con la adquisición de experiencia
durante el desarrollo (López de Armentia and Sah, 2003). Similar a NR2B, la
subunidad NR2D abunda en los primeros días del nacimiento, las zonas donde se ha
33
visto su presencia es principalmente en diencéfalo y tallo cerebral, pero su expresión
se ve reducida conforme el desarrollo, encontrándose a esta subunidad
principalmente en algunas zonas del tálamo, tallo cerebral y bulbo olfatorio. (Wenzel
et al, 1997).
.
Figura 23. Distribución y nivel de expresión de NR1 y NR2 en el desarrollo.
Para NR1 en los días E20 (A) y P7 (B). Y para NR2B en los días E20 (C) y P7 (D).
La intensidad de inmunorreactividad es graduada según: (-) negativo, (::) mínimo,
(//) ligero, (::) moderado, (•) fuerte. pCx, región parietal de la corteza cerebral. tCx,
temporal de la corteza cerebral. Hipocampo. Dc, Diencéfalo. (Takai et al, 2003).
34
Tabla 2. Expresión de las subunidades NR2 (A‐D) Región del cerebro Corteza cerebral Subunidad Día Parietal Temporal Tallo Cerebral (Md, Dc) Hipocampo Cerebelo P14 +++ ++ +++ + ++ P7 +++ + ++ + + P4 ++ + ++ + + P1 ++ ‐/+ ++ ‐/+ NE E20 + ‐/+ ++ ‐/+ NE E18 ‐/+ ‐ + ‐ NE P14 ++ ‐ ‐/+ ‐ ‐ P7 + ‐ + ‐ ‐ P4 + ‐/+ + ‐ ‐ P1 + ‐ + ‐ NE E20 + ‐ + ‐ NE E18 ‐ ‐ ‐/+ ‐ NE P14 +++ ++ ++ + ++ P7 ++ + ++ + +++ P4 ++ + ++ + ++ P1 ++ ‐/+ ++ ‐/+ NE E20 + ‐ ++ ‐/+ NE E18 ‐/+ ‐ + ‐ NE P NE NE +++ +++ ‐/+ E NE ‐ ‐ +++ ‐/+ NR2A NR2B NR2C NR2D Nota. La intensidad de expresión fue graduada como: -, negativo; -/+ mínimo; +
ligeramente; ++, moderado; +++, fuerte; NE, no examinado. Md, mesencéfalo; Dc,
diencéfalo (López de Armentia and Sah, 2003; Wenzel et al, 1995).
35
2.4.2 Distribución de NR1 y NR2 en cerebro adulto
En cerebros que han alcanzado gran parte del desarrollo, después del día
P21, hay una expresión característica para cada subunidad NR2. Mientras que en el
estado embrionario predominan las subunidades NR2B y NR2D. En cerebro adulto
abunda NR2A en gran parte, pero la presencia de NR2B y NRC quedan restringidas
para ciertas áreas específicas: prosencéfalo (NR2B) y cerebelo (NR2C) (Akazawa et
al, 1994; Monyer et al, 1994). Específicamente la subunidad NR2B está presente en
corteza (especialmente en lamina II y III), amígdala, hipocampo, tálamo bulbo
olfatorio (Ver figura 24). La expresión de NR2D es reducida en cerebro adulto y su
presencia puede estar restringida a zonas extrasinápticas (Mony et al, 2009).
Figura 24. Distribución de NR2 en cerebro adulto. Al día postnatal 21cada
subunidad NR2 presenta una distribución característica. A, NR2A: principalmente en
bulbo olfatorio, corteza, cerebelo, hipocampo. B, NR2B en corteza, hipocampo, bulbo
olfatorio, tálamo y septum. C, NR2C en cerebelo. D, NR2D débilmente en
mesencéfalo. E, NR1 ampliamente en todo el sistema nervioso central. F, esquemas
de las regiones del cerebro. Cx, corteza; OB, bulbo olfatorio; AC, corteza cingulada
anterior; S, septum; Th, tálamo; MB mesencéfalo, Hi, hipocampo y Cb, cerebelo
(Mony et al, 2009).
36
2.4.2 Receptores NMDA triheterómeros
La presencia de ensambles tri-heteroméricos en varias regiones del sistema
nervioso central. En cerebelo se ha encontrado receptores NR1|NR2A|NR2C y
NR1|NR2A|NR2B en prosencéfalo. En sustancia nigra, hipocampo (P0) y muy
probablemente en lamina I y II de la medula espinal se expresan receptores
NR1|NR2B|NR2D (Green and Gibb, 2001; Jones and Gibb, 2005). El resultado con
los receptores tri-heterómeros es una variación en las propiedades biofísicas y
farmacológicas para las distintas combinaciones. Muy poco se ha trabajado con
estos complejos. En 1998 Vicini y colaboradores transfectaron diferentes
combinaciones de cDNAs de las subunidades NR1, NR2A y NR2B y encontraron un
curso temporal de desactivación intermedio a receptores NR1|NR2A y NR1|NR2B.
También, un estudio farmacológico por Paoletti y Hatton (2005) mostró que la
combinación
NR1|NR2A|NR2B
retiene
sensibilidad
a
concentraciones
sub-
micromolar de zinc e ifenprodil, pero solo se alcanza una inhibición del 20%
aproximadamente. De manera similar, canales NR1|NR2A|NR2C (que contienen solo
un sitio de unión para el zinc) son inhibidos por este metal con una alta potencia pero
con baja eficacia. Por lo tanto, debido a la diferente distribución de los subtipos NR2,
aunado a la presencia de ensambles triheteroméricos y la poca selectividad de los
compuestos que actúan sobre el receptor NMDA, se han complicado las estrategias
farmacológicas que tienen a este receptor como blanco terapéutico (Ver tema 2.7).
37
38
2.5 Papel funcional del receptor NMDA en el SNC
Existen varios parámetros que influyen en la funcionalidad del receptor NMDA.
Primero, la composición del receptor en cada de célula, variante que determina el
nivel de actividad y cinética del canal. Segundo, la localización sub-celular, que pude
ser sináptica o extrasináptica. Y por último, la cascada de señalización a la que están
ligadas cada subunidad del receptor, ya que está presente como un complejo
macromolecular de señalización.
Figura 25. Esquema del complejo del receptor NMDA. Las proteínas mostradas
en azul son proteínas citoesqueléticas y de ensamble, amarillas (receptores y
enzimas de señalización), en verde las encontradas recientemente. Las moléculas
que pertenecen a la misma vía están representadas como el mismo elemento
(Sheng and Hyoung, 2000).
39
2.5.1 Proteínas postsinápticas asociadas al NMDAR
La apertura de los receptores NMDA inicia cascadas de señalización
citoplasmáticas, ocasionando cambios a largo plazo en las neuronas
mediante
mecanismos transducidos por estructuras sub-celulares acopladas al receptor. Al
complejo lo conforman proteínas citoesqueléticas, de ensamble y enzimas de
señalización (Ver figura 25), que interactúan con el NMDAR física y funcionalmente
mediante unión directa con el dominio C-terminal del receptor ó indirectamente
mediante otras proteínas ligadas a él (Sheng and Pak, 2000). Las proteínas más
prominentes en las membranas postsinápticas son las proteínas de la densidad
postsináptica de 95kDa (PSD-95) y SAP-102 (Proteína asociada a la sinápsis de
102kDa). Ambas contienen dominios PDZ, SH3 y GK (Ver figura 26C) que son
estructuras encargadas de la interacción entre proteínas. Sus múltiples dominios
permiten unirse simultáneamente al NMDAR y a otras enzimas como la oxido nítrico
sintetasa (NOS) dependiente de calcio (Sheng abd Hyuong, 2000).
2.5.2 Organización del NMDAR en la sinápsis
El receptor NMDA y los receptores AMPA se encuentran organizados en la
densidad postsináptica (PSD) (Ver figura 26A, área gris), ligada con mGluRs tipo I de
la periferia de la zona sináptica. La sinápsis mejor caracterizada son las de la región
CA1 de hipocampo en ratas. Se ha observado que durante el desarrollo abunda la
presencia de la subunidad NR2B, pero en cerebro maduro aumenta la inserción del
subtipo NR2A, predominando los receptores NR1|NR2A y NR1|NR2A|NR2B. La
subunidad NR2 forma su complejo con la proteína PSD-95 mientras que NR2B con
SAP-102. En las espinas dendríticas se ha identificado una zona de endocitsis
extrasináptica,
con
componentes
como
clatrinas
y
dinaminas,
proteínas
especializadas en la endocitosis. De tal manera que los receptores NMDA a
internalizar experimentan una difusión lateral regulada por señales de tráfico (Racz et
al, 2004).
40
2.5.2.1 Tráfico del NMDAR
La regulación del tráfico del receptor NMDA depende de señales internas
particulares de cada subunidad (Ver figura 26B). La subunidad NR1 presenta dos
dominios para degradación (YKRH y VWRK) y en condiciones basales expresa el
cassette C1 (lugar de una señal de retención en retículo endoplásmico RRR) y C2.
Pero bajo ciertas condiciones aumenta la expresión de una isoforma de “splicing” que
contiene el cassette C2’, que carece de la señal RRR, aumentando la inserción del
receptor NMDA en la membrana (Yang et al, 2007).
Figura 26. Organización del NMDAR en la sinápsis. A. En sinápsis CA1-Scaffer
de hipocampo en rata, NR2A y NR2B se encuentran en la densidad postsinápticas
ligadas a mGluR I mediante su complejo macromolecular de señalización: PSD-95
y SAP-102, respectivamente. B. Señales particulares que regulan el tráfico del
NMDAR. C. Dominios de comunes de SAP-102 y PSD-95. (Modificada de Lau and
Zukin, 2007).
NR2A y NR2B difieren en sus dominios para el tráfico. Ambas poseen una
señal de exportación del retículo endoplásmico HLFY y un sitio que reconoce
dominios PDZ para la interacción con las proteínas del complejo macromolecular.
41
Pero difieren en sus señales de internalización (LL en NR2A y YEKL en NR2B) y
degradación (YWKL NR2A y YWQF NR2B). La influencia de estas se ve reflejada en
la diferente velocidad de movilización lateral de cada una. 500x10-4μM2/s para la
subunidad NR2B y NR2A 2x10-4μM2/s, relativamente más estable (Groc et al, 2006).
Figura 27. Tráfico del NMDAR en sinapsis CA1- Scaffer nacientes. El
receptor NMDA pasa al aparato de Golgi ya ensamblado y unido a su complejo
macromolecular. La subunidad NR2B se transporta mediante microtúbulos con
ayuda de KIN17 y LIN. Su inserción en la membrana depende de SEC8 (Lau
and Zukin, 2007).
En sinápsis nacientes (sinaptogénesis), el receptor NMDA sale del retículo
endoplásmico al aparato de Golgi ya ensamblado y ligado a su complejo
macromolecular, y se transporta a través de microtúbulos. NR2B es transportada por
una proteína quinasa de la familia de las quinesinas (KIF17) a través de unas
proteínas adaptadoras (LIN2, 7 y 10). Una vez en la dendrita, la inserción de
receptores NR2B en la membrana es mediante SEC8, un componente del complejo
de exocitosis (Ver figura 27). En este sitio también se une PINS al dominio GK de
SAP-102, para ayudarle con la interacción con otras proteínas. El tráfico basal en las
42
sinápsis naciente tiene un periodo de trasporte de 1-2 una vez formado el contacto.
Pero la fosforilación por PKC y PKA en varias etapas del tráfico del NMDAR
modifican su velocidad. La fosforilación en Aparato de Golgi retarda la liberación,
mientras que en la dendrita promueve la inserción. Y una vez en membrana, la
desfosforilación de NR2B permite la unión de AP2 favoreciéndose la unión de las
clatrinas para la internalización mediada por dinaminas (Lau and Zukin, 2007).
En algunas regiones, la síntesis e inserción de nuevos receptores NMDA es
en gran parte mediante mecanismos locales, es decir, los nuevos receptores no son
sintetizados en el núcleo, ensamblados y transportados a la sinápsis a través de los
axones. En la corteza visual, la síntesis de nuevas subunidades NR2A se llevan a
cabo mediante un complejo de poliribosomas asociados en compartimientos
membranosos (SPRCs) que actúan como un mini aparato de Golgi y retículo
endoplásmico,
localizados
cerca
de
las
dendritas.
Las
modificaciones
de
glicosilación, fosforilación, ensamble y empaquetamiento en vesículas se lleva cabo
en mismas dendritas, de esta forma las neuronas disponen de un mecanismo eficaz
para responder rápidamente (~1 hora) en procesos de plasticidad (Fox et al, 1999).
Varios factores influyen en el tráfico del NMDAR. Un bloqueo crónico
promueve la internalización y degradación de la subunidad NR2B, haciendo de la
presencia de NRA más prominente. Pero una excesiva activación promueve la
inserción de NR2B. Estos cambios compensan la contribución de cada subunidad
para los procesos de plasticidad sináptica mediados por los receptores NMDA (Lau
and Zukin, 2007).
2.5.3 Plasticidad sináptica
Se le llama a plasticidad sináptica a los mecanismos que modifican la eficacia
de la sinápsis. Manifestándose de varias maneras: mediante una alteración de la
cantidad de neurotransmisor liberado ó cambios en el número, composición y
funcionamiento de los receptores que responderán al neurotransmisor, entre otros.
La plasticidad sináptica se caracteriza porque permanece aun después de haberse
terminado la señal sináptica y se clasifican de acuerdo a su tipo (si aumenta o
43
decrece la eficacia de la sinapsis) y
su duración. Algunos de ellos: facilitación
(cientos de milisegundos), aumentación (segundos), depresión (segundos),
potenciación post-tetánica (minutos), potenciación (LTP) y depresión a largo plazo
(LTD) (horas ó días). La inducción de cada uno depende del tipo de estimulación
sináptica y su frecuencia (Nicholls et al, 2001).
Cada subtipo de receptor NMDA contribuye de diferente manera en la
inducción de los procesos de plasticidad en sinápsis excitatorias, debido a diferentes
propiedades del receptor, como el umbral de activación, tiempo de desactivación y la
vía de señalización que activan en particular.
2.5.3.1 Plasticidad en sinápsis excitatorias
Dentro de los mecanismos de plasticidad sináptica, los procesos de LTP y
LTD han recibido mayor importancia porque están implicados en el aprendizaje,
memoria y desarrollo neuronal (Malenka and Bear, 2004). En las sinápsis excitatorias
los principales receptores involucrados son los de glutamato, principalmente del tipo
ionotrópico (AMPA, Kainato y NMDA) (Hollmann and Heinemann, 1994), aunque
también hay participación de mGluRs. El papel del NMDAR funciona como un sensor
de estímulos pre- y postsinápticos para la inducción de los procesos LTP y LTD,
(Malenka and Bear, 2004), también favorecen su desarrollo gracias a su alta
contribución en el aumento del calcio intracelular, ya que este ión puede activar una
gran variedad de enzimas. La LTP y LTD es mediada por los receptores NMDA en
muchas regiones del cerebro (amígdala, neuronas DA, mf-CA3, corteza), pero ha
sido más estudiada en el hipocampo porque esta zona es la más importante en los
procesos de aprendizaje y memoria a corto plazo
(Kerchner and Nicoll, 2008;
Newpher and Ehlers, 2009).
44
2.5.3.2 Control bidireccional de los procesos de LTP y LTD por el NMDAR
Inicialmente, la potenciación a largo plazo (LTP) se presenta con una fase
predominante mediada por los receptores AMPA, seguidos de un componente
relativamente más lento generado por las corrientes postsinápticas excitatorias
mediadas por los receptores NMDA (NMDARs-EPSCs). En comparación con los
receptores AMPA, la inducción de LTP mediada por los receptores NMDA requiere
un umbral de excitación más alto (Aniksztejn and Ben-Ari, 1995).
El glutamato liberado de la terminal presináptica despolariza la membrana
postsináptica por la activación de los receptores AMPA, el voltaje desbloquea al
NMDA por el Mg2+ y generando un flujo de calcio al interior de la célula y activación
de muchas cascadas de señalización intracelulares (Nichols et al, 2001).Se piensa
que la regulación de los procesos
de LTP y LTD por los receptores NMDA es
bidireccioal, tomando estos mecanismos como procesos independientes. Esta idea
salió a relucir porque se ha observado que estimulaciones de altas frecuencias
(~100Hz/1s) causa una fuerte activación del NMDAR, permitiendo un gran flujo de
Ca+2 al interior de la célula desencadenando la potenciación. Por el contrario,
estimulaciones a baja frecuencia (5Hz/5-15min) resulta en una moderada activación
de estos canales resultando en una depresión. La respuesta bidireccional radica en
que las estimulaciones de alta y baja frecuencia activan diferentes sub-poblaciones
de receptores NMDA (Hrabetova and Sacktor, 1997). Los receptores NMDA que
contienen las subunidades NR2A y NR2B requieren una despolarización más
pronunciada (-50mV) para lograr desbloquear el poro del canal, mientras que los
NMDAR compuestos por NR2C y NR2D poseen un umbral más bajo (-70mV)
(Monyer et al, 1992). Los mecanismos moleculares de la potenciación y la depresión
están directamente relacionados con estas dos sub-poblaciones de receptores. Las
diferencias en duración y conductancias de aperturas de ambas sub-poblaciones
contribuyen de diferente manera en la regulación del flujo del Ca+2 y por la tanto en la
inducción de LTP y/o LTD (Artola and Singer, 1993; Hansel et al, 1997). La relativa
baja conductancia de NR2D, sumado a su largo tiempo de apertura, puede permitir
45
un modesto pero prolongado flujo de calcio el cual es requerido para la inducción de
LTD (Yang et al, 1999).
Los mecanismos por el cual diferentes sub-poblaciones de NMDARs producen
alguna vía de señalización en particular no se han caracterizado completamente.
Pero se ha observado que la señal tiene propiedades espaciotemporales únicas y un
acceso preferente a componentes particulares de cascadas de señalización. Por
ejemplo, NR2C y NR2D poseen un dominio rico en prolina en su C-terminal, y que
en el caso de NR2D, permite la asociación selectiva con dominios homólogos Src de
la quinasa c-ABL. Dividir la función del NMDAR en dos sub-poblaciones diferentes,
para regular la inducción de LTP y LTD independientemente, aumenta la flexibilidad
sináptica (Ishii et al, 1993; Hravetoba et al, 2000).
Las enzimas que pueden ser activadas por el funcionamiento de los
receptores NMDA incluyen: CaMKII (quinasa dependiente de Ca2+/calmodulina),
calcineurina (proteína fosfatasa 2B), PLA2 (fosfolipasa A2), PLC (fosfolipasa C), PKA
(proteína quinasa A), PKC (proteína quinasa C), NOS (sintetasa de oxido nítrico),
MAPK (proteínas quinasas activadoras del mitógeno) y algunas proteasas,
resultando en un aumento o disminución en la densidad o conductancia de los
receptores NMDA y no-NMDA, entre otros efectos (Kerchner and Nicoll, 2008;
Newpher and Ehlers, 2009).
2.5.3.3 Mantenimiento de LTP por los receptores NMDA
En la potenciación a largo plazo mediada por los receptores NMDA, hay un
flujo de calcio en la neurona postsináptica consecutivo a la activación de los
receptores metabotrópicos de glutamato mGluR tipo 1 y los NMDARs (Kwon and
Castillo, 2008). La magnitud de la señal de calcio puede ser regulada para
mantenimiento de LTP, ya sea por medio de la proteína quinasa C (neuronas DA)
(Harnett et al, 2009)
ó mediante la activación de receptores de adenosina A2A
(neuronas mf-CA3) (Ver Figura 28) (Rebola et al, 2008).
46
Figura 28. Mecanismos de mantenimiento de LTP mediado por los NMDARs. En
sinápsis de neuronas mf-CA3. Estimulaciones de alta frecuencia activa a los receptores
NMDA, mGluRs y receptores de adenosina A2A para inducir la LTP. Los receptores mGluR
están unidos a la proteína Gq que activa a la fosfolipasa C (PLC) para promover la
formación de IP3 (inositol 1, 4,5 trifosfato) y DAG (diacilglicerol). El IP3 provoca liberación
de calcio del retículo endoplásmico y en conjunto: el calcio y el DAG activan la proteína
quinasa C (PKC). PKC pude activar quinasas de Src, ambas quinasas pueden aumentar
la probabilidad de apertura de NMDARs postsinápticos, aumentando la amplitud de la
señal de calcio y favorecer la inducción de LTP, además de que modulan la inserción de
receptores NMDA en la membrana postsináptica mediante mecanismos dependientes de
SNARE. La función de los receptores A2A podría estar participando aumentando el calcio
intracelular por la via PLC o potenciando la función de mGluRs (Rebola et al, 2009).
47
Las modificaciones a largo plazo de los receptores NMDA durante LTP son a
través de mecanismos que gobiernan su expresión mediante inserción en la
membrana, mediado por proteínas quinasa como PKC, Src y PKA (Grosshans et al,
2002), también por cambios en la composición de las subunidades del receptor
(Peng et al, 2009), por ejemplo, la maduración de los circuitos corticales son
experiencia-dependientes y una privación de sensorial previene muchos de los
cambios que ocurren normalmente en el desarrollo (Crair and Malenka, 1995) como
el incremento de receptores AMPA en la membrana bajo el control de los receptores
NMDA y el aumento en la cinética de desactivación de los receptores NMDA
mediante un aumento de la expresión de la subunidad NR2A en lugar del subtipo
NR2B (Carmignoto and Vicini, 1992). Este último fenómeno ocurre en corteza visual
después de una exposición previa a la luz. La sustitución de NR2B por NR2A reduce
la contribución de las corriente del receptor NMDA en la sinápsis. También se ha
observado la inserción de receptores que presentan la subunidad NR2D después de
LTPs mediadas por NMDARs en giro dentado (Harney et al, 2008), mientras que
otras neuronas (DA) no están asociadas a cambios en las subunidades del NMDAR
(Harnett et al, 2009). En algunos casos (CA1) solo se han observado cambios
rápidos dependientes de actividad en neuronas neonatas más no en adultas (Bellone
and Nicoll, 2007).
48
2.5.3.4 Mantenimiento de LTD por el receptor NMDA
En la depresión a largo plazo hay un cambio actividad-dependiente de la
función del receptor NMDA, ocasionando inactivación de los receptores, modulada
por la despolimerización Ca2+-dependiente del citoesqueleto de actina.. En algunas
neuronas
(CA3)
se
ha
observado
una
dependencia
de
mecanismos
de
internalización de NMDARs mediado por dinaminas similar a lo que sucede en los
procesos de LTD de los AMPARs (Montgomery and Madison, 2002) mientras que en
otras células como las del giro dentado no se presenta este tipo de endocitosis
(Morishita et al, 2005). Los receptores metabotrópicos de glutamato del grupo I
(mGluRI) pueden estar asociados en los eventos de internalización en neuronas CA1
aumentando los periodos de depresión (Montgomery et al, 2005). En sinápsis CA1Scaffer en el hipocampo la depresión a largo plazo depende de la activación de los
receptores NMDA y también de los mGluR tipo I y 5, resultando en una
internalización mediado por dinaminas de los NMDARs por procesos que incluyen
despolimerización y difusión lateral (Lau and Zukin 2007).
49
2.6 Farmacología del Receptor NMDA
Existen varios sitios de acción en donde ciertos fármacos pueden actuar sobre
el receptor NMDA y modular su actividad. Estos son; el sitio de unión al agonista
(ABD), el dominio N-terminal (NTD) y el poro, además de otros sitios aún no
explorados (Ver Figura 29).
2.6.1 Fármacos que actúan en el sitio de unión del agonista (ABD)
El receptor NMDA posee cuatro sitios de unión de agonistas, una en cada
subunidad. Las subunidades NR1 y NR3 poseen el sito para la glicina, mientras que
las subunidades NR2 para el L-glutamato.
2.6.1.1 Sitio de unión de glutamato de la subunidad NR2
Los primeros antagonistas de los NMDARs que actúan en el sitio de unión del
agonista (ABD), fueron derivados de aminoácidos con un grupo ω-fosfórico que
actúan sobre el sitio ABD de las subunidades NR2 (NR2 ABD). Son antagonistas
competitivos. El más usado hasta el momento por su fuerte preferencia por los
receptores NMDA más que por otros tipos de iGluRs (receptores ionotrópicos de
glutamato) es el (R)-2-amino-5-fosfonopentanoato, mejor conocido como AP5 (Kew
and Kemp, 2005). Estos compuestos muestran una pobre selectividad entre los
subtipos NR2 (NR2A>NR2B>NR2>NR2D). La falta de selectividad de estos
compuestos probablemente se debe al alto grado de conservación de la cavidad
donde se une el glutamato en las subunidades NR2 (los 10 residuos de aminoácidos
en NR2A que interactúan directamente con el glutamato, son conservados entre
todas las subunidades NR2 (Furukawa et al, 2005). Los antagonistas (R)-CPP y (R)AP7 poseen mayor selectividad (NR2A>>NR2D) que sus homólogos de cadena más
corta PMPA y (R)-AP5 (Ver figura 30), en un orden de selectividad un poco mayor a
10 veces (Ver tabla 3 y 4), respectivamente (Feng et al, 2004). La selectividad de las
moléculas de cadena larga es atribuida a efectos estéricos sobre la cavidad donde se
une el agonista (Feng et al, 2005). Compuestos con anillos aromáticos múltiples
muestran un orden de selectividad diferente: EAB515 y PBPD tienen más afinidad
por las subunidades NR2B y NR2D, LY233536 por NR2B y NR2C, pero sus bajos
50
niveles de selectividad limitan su uso. El compuesto PPDA, derivado de PBPD, es
más afín a las subunidades NR2C y NR2D (Feng et al, 2004). La variación de
afinidad de todos estos compuestos que actúan en el sitio NR2 ABD es menor a diez
veces, aunque la selectividad de PBPD fue mejorada un poco por otro compuesto de
estructura similar, el UBP141 que presenta mayor preferencia por la subunidad
NR2B que la NR2D (Buller and Monaghan, 1997).
Figura 29. Sitios con potencial farmacológico del NMDAR. En la región
extracelular encontramos a los dominios NTD y ABD. El NR2 ABD une glutamato y el
NR1 ABD glicina (ó D-serina). Las flechas blancas indican sitios de unión para
agonistas y antagonistas competitivos. Las anaranjadas gruesas sitios de unión de
moduladores alostéricos como el zinc endógeno (NTD´s de NR2A y NR2B) o el
fármaco ifenprodil (NR2B NTD) ambos actúan como antagonistas no competitivos. El
dominio del poro es el sitio de acción para bloqueadores como el Mg2+, MK-801,
memantina ó ketamina. Las flechas delgadas anaranjadas muestran sitios de unión
para posibles compuestos modulatorios. (Paoletti and Neyton, 2007).
51
Figura 30. Principales fármacos que actúan sobre el receptor NMDA. Antagonistas
competitivos por el sitio de unión del glutamato (NR2 AB): derivados de aminoácidos con
un grupo ω-fosfórico D-(AP5 y D-AP7), PAMPA, CPP (compuestos con un anillo
piperazina), SCZ-EAB-515, PBPD, PPDA (compuestos con múltiples anillos aromáticos).
Antagonistas competitivos por el sitio de unión de glicina (NR1 ABD): CNQX, DNQX, el
acido kinurénico y sus derviados (7-CDK, 5,7-DCKA y [3H] CGP 61594). Bloqueadores
del poro: ketamina, dizolcipina (MK-801), PCP (fenilciclidina) y memantina. Moduladores
alostéricos negativos que actúan en el sitio N-terminal: ifenprodil y dos de sus derivados
(Ro-25-6981 y CP-101,606). (Modificada de Monaghan and Jane, 2009).
52
2.6.1.2 Sitio de unión de glicina de la subunidad NR1
Existen antagonistas competitivos por el sitio de unión a glicina (NR1 ABD),
pero de igual manera han mostrado tener poca selectividad, como habría de
esperarse en compuestos con la subunidad NR1 como sitio blanco ya que está
presente en todos los sub-tipos de receptores NMDA. El primero de ellos fue el ácido
Kinurénico (Watson et al, 1988), a partir del cual se han sintetizado nuevo
compuestos (ej. 7-CDK, 5,7-DCKA y CGP 61594) mediante modificaciones
estructurales (Leeson et al, 2003). Los compuestos CNQX y DNQX, antagonistas de
los receptores AMPA, Kainato, que se unen débilmente a los NMDAR, también se
han utilizado como modelos para el diseño de nuevos antagonistas NR1 ABD más
potentes (Honore et al, 1988). Los antagonistas del sitio NR1 ABD han mostrado
tener un mejor radio terapéutico (anticonvulsivantes, neuroprotección, propiedades
analgésicas) y exhiben efectos adversos reducidos en comparación con los
compuestos en comparación con los antagonistas ortostéricos (Leeson and Iversen,
1994).
2.6.2 Fármacos que bloquean el poro del canal
Fisiológicamente, el Mg2+ se encuentra bloqueando el poro del canal cuando el
potencial de membrana está en reposo, este bloqueo es dependiente de voltaje y se
elimina cuando se despolariza la membrana (Ver figura 30) (Mayer et al, 1996). El
bloqueo por magnesio se da porque un residuo de asparagina (N598) en el segmento
M2 produce una constricción en el poro del canal del receptor NMDA, permitiendo el
flujo de calcio pero no de magnesio (Wollmuth and Sobolevsky, 2004), este sitio de
unión del Mg2+ se encuentra en la profundidad del canal y las subunidades más
sensibles a este ión son la NR2A y NR2B en comparación de los subtipos NR2C y
NR2D (Mayer et al, 1996).
Un gran número de compuestos orgánicos inhiben al NMDAR obstruyendo el
poro del canal. Estos compuestos, estructuralmente diversos, son bloqueadores que
requieren una activación previa del receptor. Todos ellos conservan una carga
positiva y actúan de una manera dependiente de voltaje. Normalmente estos
53
bloqueadores del poro discriminan muy poco entre los subtipos de receptores NMDA.
Este es el caso para anestésicos disociativos clínicamente utilizados: fenilciclidina
(PCP), tionil-ciclohexil-piperidina (TCP) y ketamina, y para los fármacos memantina
y amantadina. El bloqueador dizolcipina (MK-801) es más potente para bloquear las
subunidades NR2A y NR2B que NR2C y NR2D, pero su diferencia de afinidad es
relativamente pequeña (<10 veces) (Kew and Kemp, 2005). Un patrón de
selectividad similar se ha observado con derivados de poliaminas, como la toxina de
la araña argiotoxina-636 y la N1-dansil-espermina. Interesantemente, estos
bloqueadores muestran una preferencia 50 veces mayor por el par de subunidades
NR2A y NR2B comparado con los subtipos NR2C y NR2D. No se han entendido
completamente las determinantes estructurales que expliquen esta selectividad, pero
se cree que se debe a interacciones hidrofóbicas entre anillos aromáticos del
bloqueador y residuos hidrofóbicos ubicados en el vestíbulo del poro. Por lo tanto,
moléculas con un largo grupo polar podrían ser muy útiles, por lo menos para
diferenciar entre receptores que contengan los subtipos NR2A y NR2B de aquellos
que contengan las subunidades NR2C y NR2D (Raditsch et al, 1993; Chao et al,
1997).
Figura 31. Dependencia de voltaje
del bloqueo por Magnesio. La
curva corriente-voltaje muestra que
concentraciones de magnesio de
1.2mM es suficiente para bloquear el
canal del receptor NMDA a
potenciales de membrana cercanos
al de reposo (-70mM). Conforme el
potencial
de
membrana
se
despolariza disminuye la afinidad del
Mg2+ por su sitio de unión,
permitiendo el flujo de los iones. Si
se remueve el calcio extracelular
(0.0012) el canal permite la corriente
a voltajes más negativos. (Nestler et
al, 2001).
54
Los bloqueadores de alta afinidad como el PCP y MK-801 producen efectos
indeseables como, ataxia y disturbios en el aprendizaje y memoria, por tal motivo se
han restringido su uso en la clínica. La tendencia de estos compuestos para producir
tales efectos adversos se relaciona a su cinética lenta para disociarse del sitio de
unión, permaneciendo por más tiempo dentro del canal (Parson et al, 1999).
2.6.3 Fármacos que actúan en el sitio NTD
Los únicos compuestos orgánicos que han mostrado tener una alta
selectividad entre los subtipos de los NMDARs son el ifenprodil y sus derivados (ej.
Ro 25-6981 y CP-101,606), estas sustancias actúan como antagonistas no
competitivos selectivos de la subunidad NR2B que actúan independientemente del
voltaje. Estos compuestos han mostrado tener un uso terapéutico prometedor en
modelos de dolor neuropático y neuroprotección, por lo que se ha estado trabajado
por identificar nuevos derivados con mayor selectividad y seguridad que el ifenprodil,
porque éste posee un efecto cardiotóxico. El ifenprodil se une al sitio NTD de la
subunidad NR2 (NR2B NTD) ejerciendo una modulación alostérica que aumenta la
inhibición por protones (Pahk and Williams K, 1997; Chenard and Menniti, 1999).
Recientemente se han descrito una diversidad de estructuras antagonistas
selectivas a NR2B con nuevos arreglos estructurales diferentes al ifenprodil
diseñados por varias empresas: que incluye moléculas con anillos indol,
benzimidazol, piridinas, entre otros: como MK-0657 (Ver figura 32, compuesto 1),
Indol- y benzimidazol-2-carboxamidas (compuesto 2), 2-(3,4-dihidro-1H-isoquinolina2yl)-piridinas (compuesto 3), benzamidinas (compueto 4), N-(fenilalquil)cinnamidas)
(compuesto 5), N1.(bencil) cinnamamidinas (compuesto 6), 1-benziloxy-4,5-dihidro1H-imidazol-2-yl-aminas (compuesto 7), Taisho´s HON0001 (compuesto 8) y diimidazoles (compuesto 9). La mayoría de estos compuestos actúan en el orden
nanomolar y aún no se determina si su modo de acción es similar al ifenprodil (Borza
et al, 2007; Suetake-Koga et al, 2006).
55
Figura 32. Nueva generación de compuestos NR2B selectivos. Varias
empresas, como Merck y Roche, entre otras, han patentado una nueva serie de
moléculas estructuralmente diferentes al ifenprodil (Mony et al, 2009).
También el Zn2+ modula la función del receptor NMDA uniéndose al sitio NTD,
es un modulador alostérico endógeno, ya que es liberado de las terminales
presinápticas junto con el glutamato, por tal motivo su efecto tiene relevancia
fisiológica (Assaf and Chung, 1984; Smart et al, 2004). Este ión se une solamente a
las subunidades NR2A y NR2B pero con una afinidad mayor a 100 veces por el
subtipo NR2A (Paoletti et al, 1997).
Experimentos recientes en registros de canales unitarios en parches de
membrana de células HEK-293, mostraron que el zinc inhibe a la subunidad NR2A
con IC50 en el rango nanomolar (300nM), reduciendo reversiblemente la duración de
apertura del canal pero no su amplitud de corriente. La asociación del Zn2+ a su sitio
de acción produce efectos similares a cambios de pH (aumento de protones), ya que
56
los canales protonados (Ver tema 2.5.6) se abren con una menor probabilidad de
apertura, sugiriendo que el efecto del zinc es producido aumentando la inhibición por
protones (Ver figura 33), esta interacción fue ajusta a un modelo cinético que predice
la probabilidad de apertura mediante la constante K1, a diferentes concentración de
protones [H+], considerando la ecuación de Hill (1) y la concentración de Zn2+
(Erreger and Traynelis, 2008):
Figura 33. Efecto del zinc. El zinc reduce el estado abierto del canal del
receptor NMDA, este efecto depende de las condiciones de pH porque el
Zn2+ aumenta la inhibición por protones (Erreger and Traynelis, 2008).
2.6.4 Modulación por poliaminas
Las poliaminas son aminas alifáticas polibásicas que se encuentran cargadas
positivamente a pH fisiológico. En el cerebro existe una gran variedad de poliaminas,
entre ellas: espermina (N,N'-bis(3-aminopropil)-1,4-butanodiamina), espermidina
(N-(3-aminopropil)-1,4-butanodiamina)
y
putrescina
(butano-1,4-diamina).
La
mayoría (putrescina, espermina) son sintetizados a partir de la ornitina durante el
ciclo de la urea. Estos compuestos son constituyentes naturales del SNC y existen
en el medio intra- y extracelular a concentraciones considerables para tener
influencia en la neurotransmisión y en el desarrollo neuronal (Shaw and Pateman,
57
1973). En neuronas de hipocampo se han observado múltiples efectos por como
potenciación e inhibición poliaminas dependiendo el tipo celular (Benveniste and
Mayer, 1993) por las diferencias en los niveles de expresión de las subunidades NR2
del receptor NMDA.
La liberación de poliaminas de las terminales presinápticas puede modular de
diferente manera la actividad de los receptores NMDA. La espermina aumenta la
afinidad entre la glicina y su sitio de unión (potenciación dependiente de glicina),
mientras que en condiciones saturadas de glicina aumentan la amplitud máxima de la
respuesta de los NMDARs (potenciación independiente de glicina) (McGurk et al,
1990), resultado de la unión de las poliaminas entre lóbulos del dominio amino
terminal favoreciendo el abierto, este efecto estabiliza la interface del dímero ABD
disminuyendo la sensibilidad a protones (Gielen et al, 2008). A potenciales negativos
la espermina también puede producir un bloqueo voltaje-dependiente sobre el
NMDAR. El bloqueo de espermina es similar al producido por iones Mg2+ pero se
puede revertir mediante permeabilidad a potenciales hiperpolarizantes (Benveniste
and Mayer, 1993). Los efectos de las poliaminas dependen de la composición del
receptor NMDA. Los receptores que presentan las isoformas NR1 con el exón 5
carecen de interacción con poliaminas debido a que la secuencia de aminoácidos
que codifica este exón forma un asa superficial con estructura similar a las
poliaminas (Traynelis et al, 1995). Los receptores di-homólogos que presentan la
subunidad NR2A presentan el tipo de potenciación dependiente de glicina y el
bloqueo voltaje dependiente, los receptores con el subtipo NR2C y NR2D no exhiben
ninguno de los efectos de las poliaminas, pero los receptores NR1a|NR2B
(subunidad que abunda durante el desarrollo) si presenta todos los mecanismos de
potenciación e inhibición por poliaminas mencionados (Zhang et al, 1994).
Adicionalmente, hay una interacción alostérica entre la espermina con el ifenprodil, la
unión de uno promueve la disociación del otro (Han et al, 2008).
La espermina que se encuentra en el medio intracelular también modula la
actividad de los receptores NMDA, inhibiendo reversiblemente la actividad del canal
por un mecanismo diferente a la inactivación inducida por calcio y a diferencia del
58
efecto inhibitorio de las poliaminas extracelulares, la inhibición intracelular por
espermina no depende de la composición del NMDAR (Turecek et al, 2004).
2.6.5 Modulación por protones (H+).
Los cambios en el pH fisiológico puede modular la actividad de una gran
variedad de canales iónicos incluyendo canales de Ca2+, Na+ y K+ sensibles a voltaje,
canales de K+ rectificadores entrantes, uniones comunicantes, canales de K+
activados por calcio, receptores tipo nicotínicos, GABAA y NMDA, entre otros. Se han
propuesto varios mecanismos de protonación por el cual el pH produce su efecto:
como cambios en la carga de la superficie de la membrana (Hille, 1968), protonación
de carbohidratos (Freeman et al, 2000) y de aminoácidos involucrados en: la unión
del agonista, conducción (Woodhull, 1973) y mecanismos de compuerta mediante
reacomodos estructurales (Schulte and Fakler, 2000).
A pH fisiológico, el receptor NMDA se encuentra inhibido un 50%, el aumento
extracelular del pH incrementa la respuesta del NMDAR mientras que una
disminución disminuye la probabilidad de apertura (Johnson, 2003). La sensibilidad a
protones es influenciada por la presencia de las subunidades NR1 y NR2, incluso
algunos moduladores del NMDAR como el Zn2+ (Erreger and Traynelis, 2008),
ifenprodil y poliaminas actúan, en cierto grado, afectando la modulación por protones
(H+) (Johnson, 2003).
El dominio amino terminal de la subunidad NR1 fue el primer sitio acción del
pH considerado (Ver figura 3), también el dominio NTD de las subunidades NR2A y
NR2B influye en la sensibilidad a protones. Los aminoácidos del dominio NTD NR1
que más afectan la sensibilidad al pH están acomodados en una estructura primaria,
separados entre ellos por decenas de aminoácidos y son parte de la sección que une
los dos lóbulos de este dominio encargados de la apertura y cierre del canal (Low et
al, 2003).
Además del dominio NTD existen dos series de aminoácidos que contribuyen
más en la sensibilidad al pH del receptor NMDA, son las dos secciones que unen el
dominio S2 con los segmentos transmembranales M3 y M4 (dominios M3-S2 y M4S2) (Ver figura 3). El dominio S2 constituye el asa extracelular más larga que separa
59
los dos dominios transmembranales M3 y M4, y junto con el dominio S1 forman el
sitio de unión del agonista de cada subunidad del NMDAR, mientras que los
aminoácidos del dominio M3-S2 y M4-S2 traducen la señal de compuerta del canal
cuando se une el agonista (Qian and Johnson, 2002). El dominio S2 contiene un
residuo δ2 D-serina en el sitio δ2 (Naur et al, 2007). La mutación de este residuo en
δ2, mGluR1, mGluR6 ó NR1 resulta en una activación constitutiva (sin presencia de
agonista) ó en un aumento en la afinidad por el agonista, dando evidencia de la
participación del dominio S2 en el mecanismo de compuerta del canal (Vogel et al.
2006). Pero no se sabe exactamente la manera en que el grupo de aminoácidos en
M3-S2 y M4-S2 cooperan entre sí ó con S2 para modular la presencia de protones
como una sola entidad.
2.6.6 Posibles sitios moduladores del NMDAR
Hipotéticamente,
existen
más
sitios
donde
pueden
actuar
ligandos
extracelulares para modular la actividad del receptor NMDA: a un lado del sitio NR1
NTD (Figura 29, sitio 2) y la interfase del dímero ABD provee otro sitio para nuevos
moduladores alostéricos (Figura 29, sitio 3). En los receptores AMPA, este último
sitio une a moduladores alostéricos positivos que actúan por mecanismos diferentes
como la ciclotiazida, que reduce la desensibilización de los AMPAR y el aniracetam
que enlentece la desactivación del canal estabilizando la interfase ABD favoreciendo
la conformación del estado abierto. De tal manera, dada la fuerte conservación en la
arquitectura del dímero ABD entre los NMDARs y AMPARs, es tentado a especular
que también es un blanco para estos fármacos moduladores. Pero debido a que los
NMDAR presentan poca desensibilización, para identificar moduladores de la
interface del dímero ABD es requerido un protocolo de escaneo buscando posibles
cambios en la cinética de desactivación. Otro sitio candidato es la región que une los
dominios ABD en el segmento transmembranal (Figura 28, sitio 4). En receptores
AMPA, esta zona forma el sitio de interacción de antagonistas no competitivos de la
familia GYKI. Aun no se ha explorado si esta región homóloga en NMDAR pueda unir
también antagonistas (Paoletti and Neyton, 2007).
60
Tabla 3. IC50 de los principales compuestos moduladores del NMDAR
Subtipo NMDAR
Compuesto
NR1a|NR2A
NR1a|NR2B
NR1a|NR2C
NR1a|NR2D
(R)-AP5
0.3
0.5
1.6
3.7
(R)-AP7
0.5
4.0
6.0
17
0.8
2.7
3.5
4.2
0.04
0.3
0.6
2.0
0.6
0.3
0.1
0.1
0.6
0.2
0.1
0.6
0.03
0.05
0.2
0.09
Mg2+
20
20
80
80
PCP
0.1
0.1
0.2
0.2
0.7
0.5
0.5
0.7
0.9
0.8
ND
0.5
0.01
0.01
0.1
0.1
0.009
0.005
0.46
ND
0.3
0.3
16
13
Zn2+
0.02
2.0
20
10
Ifenprodil
>30
0.15
>30
>30
>30
0.009
ND
ND
>30
0.04
>30
>30
PMPA
(R)-CPP
PPDA
IC50 (μM)
7-CKA
5, 7-DCKA
Ketamina
Memantina
MK-801
IC50 (μM)
a -60 ó
-70mV
Argiotoxina-636
N-dansil-spermina
Ro 25-6981
CP 101,606
IC50 (μM)
IC50 = inhibición del 50% de la corriente en receptores expresados en ovocitos de
Xenopus ó en células HEK-293.ND = No determinado. (Modificada de Paoletti and
Neyton, 2007)
61
Tabla 4. Selectividad de los compuestos moduladores de los NMDARs
Orden de
Agente
Sitio de Unión
Selectividad NR2
(R)-AP5
NR2 ABD
2A≈2B>2C≈2D
(R)-AP7
NR2 ABD
2A>2B≈2C>2D
PMPA
NR2 ABD
2A>2B≈2C≈2D
(R)-CPP
NR2 ABD
2A>2B≈2C>2D
PPDA
NR2 ABD
2C≈2D>2A≈2B
7-CKA
NR1 ABD
2C≈2B>2A≈2D
5, 7-DCKA
NR1 ABD
2C≈2B≈2A>2D
Mg2+
Poro
2A≈2B>2C≈2D
PCP
Poro
2A≈2B≈2C≈2D
Ketamina
Poro
2A≈2B≈2C≈2D
Memantina
Poro
2A≈2B≈2D
MK-801
Poro
2A≈2B>2C≈2D
Argiotoxina-636
Poro
2A≈2B>>2C≈2D
N-dansil-spermina
Poro
2A≈2B>>2C≈2D
Zn2+
NR2A NTD
2A>>2B>2C≈2D
Ifenprodil
NR2B NTD
2B>>2A≈2C≈2D
Ro 25-6981
NR2B NTD
2B>>2A≈2C≈2D
>3000 veces
CP 101,606
NR2B NTD
2B>>2A≈2C≈2D
>700 veces
Selectividad
≤ 10 veces
> 10 veces
≤ 10 veces
≤ 10 veces
~50 veces
>100 veces
Abreviaturas: (R)-AP5, (R)-2-amino-5-fosfonoheptanoato; (R)-AP7, (R)-2-amino-7fosfonoheptanoato; PAMPA, ácido (RS)-4-(fosfonometil)-piperazina-2-carboxílico; (R)CPP, acido (R)-4-(3-fosfonopropil) piperazina-2-carboxylico; PPDA, ácido (2R,3S)-1(fenantrenil-2-carbonil)piperazina-2,3-dicarboxílico; 7-CKA, ácido 7-cloroquinurénico;
5,7-DCKA, ácido 5,7-dicloroquinurénico; ácido 7-cloroquinurénico; CNQX, 6-ciano-7nitroquinoxalina-2,3-diona; DNQX, 6,7-Dinitroquinoxalina-2,3-diona; PCP, fenilciclidina;
MK-801, dizolcipina; Ro 25-6981, hidrocloruro de (aR,bS)-a-(hidroxifenil)-b-metil-4(fenilmetil)-1-piperidinpropanol (Modificada de Paoletti and Neyton, 2007).
62
2.7 Uso clínico de moduladores del NMDAR
Un número considerable de padecimientos neurodegenerativos han mostrado
alteraciones en la actividad y/o composición del receptor NMDA. Dentro de los
mecanismos observados incluyen activación excesiva, sobreexpresión, hipofunción,
entre otros. La mayoría de estrategias terapéuticas utilizadas (antagonistas no
competitivos y bloqueadores del poro) hasta el momento no han completado las
fases clínicas por falta de selectividad y seguridad, por lo que continua el estudio con
moléculas más selectivas (principalmente de NR2B). Hoy en día una serie de
compuestos recién identificados selectivos de NR2B, pero de estructura diferente al
ifenprodil, se han sumado al estudio para tratamientos clínicos de padecimientos
como: dolor neuropático, Parkinson, Huntington y depresión mayor. También se ha
puesto interés en la búsqueda y utilización de moduladores alostéricos positivos para
tratamientos de otro tipo de padecimientos como la esquizofrenia.
2.7.1 Compuestos no selectivos
2.7.1.1 Antagonistas competitivos
Los antagonistas competitivos, aquellos que actúan en el sitio ABD, carecen
de selectividad para discriminar entre los subtipos NR2, provocando una inhibición
generalizada y con ello efectos adversos que alteran el comportamiento, sistema
cardiovascular y además poseen actividad citotóxica, por tal motivo no han
funcionado para usos clínicos (Kohr, 2007).
2.7.1.2 Bloqueadores del poro
Algunos bloqueadores del poro también han mostrado dependencia al pH,
aumentando su afinidad por su sitio de unión dentro del poro, pero carecen de buena
selectividad. La memantina fue aprobada en el 2006 para el tratamiento de Alzheimer
para casos severos y moderados gracias a su baja afinidad y cinética rápida de
disociación (Johnson and Kotermanski, 2006;), caso contrario con la ketamina, ésta
permanece atrapada dentro del poro aún cuando se disocia el agonista del receptor.
Este grupo de compuestos podrían ser clínicamente prometedores como
63
neuroprotectores si se desarrollaran derivados que presenten mayor selectividad,
conservasen su dependencia al pH y una cinética rápida de desbloqueo, así se
podría actuar sobre la actividad del receptor sin interferir con la transmisión sináptica
normal (Dravid et al, 2007).
2.7.2 Antagonistas selectivos de la subunidad NR2B
Hasta el momento, los compuestos más prometedores son el ifenprodil, sus
derivados y los nuevos antagonistas selectivos de la subunidad NR2B. Son
antagonistas no competitivos que exhiben un grado mayor de selectividad por la
subunidad NR2B, además de ser más eficientes en altos niveles de glutamato y pH
bajo, condiciones que se presentan en ciertas alteraciones del cerebro. Pero casi
ninguno de estos compuestos ha completado las fases clínicas por falta de
seguridad, a pesar de ser efectivos en animales (Paoletii and Neyton, 2007).
Padecimientos como dolor crónico, enfermedad de Huntington, Alzheimer, isquemia
cerebral y depresión mayor son blancos de estudio para el desarrollo de nuevas
terapias basadas en el antagonismo selectivo de los receptores del tipo NMDA, en
especial aquellos que presentan la expresión de la subunidad NR2B.
2.7.3 Dolor
La subunidad NR2B fue relacionada con el dolor crónico debido a la
distribución que presenta este subtipo, expresándose tanto en el hasta dorsal de la
médula espinal, como en algunos centros del SNC como el tálamo y la corteza
cingulada anterior, que están involucradas en la percepción del dolor. Además de
haber varios estudios que revelan la eficacia del ifenprodil y sus derivados en
modelos de dolor agudo, neuropático
y visceral (Boyce et al, 1999). Los
compuestos: ketamina y dextrometorfano, han mostrado actividad terapéutica eficaz
en contra del dolor neuropático, pero sus efectos adversos son generalizados debido
a su amplio espectro de acción sobre el NMDAR (Chizh, 2007). Pero el potencial de
los antagonistas de la subunidad NR2B ha ganado mayor precedencia clínica en el
tratamiento del dolor por la eficacia observada por CP-101,606 en un estudio clínico
fase 2 en pacientes con trauma en médula espinal, aunque aún exhibe algunos
64
efectos adversos centrales y cardiotóxicos (acción sobre hERG) y carece de
biodisponibilidad oral (Sang et al, 2003). A pesar de las complicaciones, las
empresas Gedeon Richter, Forest Laboratories, Merck y Evotec tienen identificados
nuevos compuestos que han mostrados mejores resultados de seguridad y
disponibilidad en los ensayos clínicos fase 2 (Mony et al, 2009).
2.7.4 Huntington
La enfermedad de Huntington es un padecimiento autosomal dominante,
caracterizada por alteraciones cognoscitivas, psiquiátricas y motoras de progresión
lenta. Ocasionada por la mutación de un gene hereditario llamado Huntington, cuya
proteína presenta una secuencia de poliglutamatos. Esta enfermedad se manifiesta
por pérdida de neuronas GABAérgicas (spiny medianas) en el cuerpo estriatado. La
neurodegeneración en esta zona se debe se da por desregulación de los receptores
NMDA ligado a un aumento en la expresión de la subunidad NR2B (Li et al, 2003).
Por lo tanto, una intervención en las fases tempranas de esta enfermedad, con
antagonistas selectivos de la subunidad NR2B, podría ofrecer un potencial
terapéutico para este desorden.
2.7.5 Parkinson
Las neuronas dopaminérgicas de la sustancia nigra par compacta tienen sus
axones proyectados directamente al neoestriado. Ambas regiones mantienen
conexión indirecta con la porción motora de la corteza cerebral. Así este sistema
modulatorio de la SNc facilita de alguna manera el inicio del movimiento voluntario
(Boron y Boulpaep, 2003). Una pérdida en el número de neuronas dopaminérgicas
de la sustancia nigra provoca una deficiencia de dopamina estriatal ocasionando el
padecimiento crónico-progresivo conocido como enfermedad de Parkinson, en el
cual hay una pérdida del control del movimiento voluntario. La degeneración de las
neuronas dopaminérgicas en sustancia nigra y la subsecuente depleción de
dopamina en la vía nigro-estriatal resulta en una sobre activación de las
proyecciones glutamatérgicas sobre los núcleos del estriado y ganglio basal (Brazis
et al, 2001). Ha sido propuesto que los NMDARs desarrollan un papel importante en
65
el desarrollo de discinesia inducida por levodopa y algunos antagonistas no
selectivos muestran actividad antiparkinsoniana ó antidiscinésica en modelos con
roedores y monos, pero solo la amantadina, antagonista de baja afinidad por los
NMDARs, ha exhibido actividad antidiscinésica en humanos (Del Dotto et al, 2001).
Los antagonistas selectivos de la subunidad NR2B han mostrado mayor eficacia en
modelos preclínicos que los antagonistas de amplio espectro (Wessell et al, 2004).
Pero mientras que el ifenprodil ha fallado en las fases clínicas en terapias junto con
L-dopa, su derivado CP-101,606 dio mejores resultados antidiscinésicos, pero se
requieren dosis asociadas con disociación de la personalidad y amnesia (Nutt et al,
2008). Adicionalmente, el nuevo compuesto MK-0657 adjunto con L-dopa ha
completado recientemente sus estudios clínicos fase 1 pero la empresa Merck no ha
mostrado completamente sus datos aún (Mony et al, 2009).
2.7.6 Depresión mayor
La depresión mayor se manifiesta por trastornos en el estado del ánimo.
Estudios clínicos revelaron efectos antidepresivos de la ketamina que perduran
varios días con una sola administración, pero su aplicación es limitada debido a los
efectos adversos generalizados que ostenta (Zarate et al, 2006). Los antagonistas
selectivos de NR2B también actúan como antidepresivos en estudios preclínicos, se
ha visto que el compuesto CP-101,606 es bien tolerado por lo que el MK-0657 ha
sido sometido a investigación (Preskorn et al, 2008).
2.7.7 Esquizofrenia
Mucha evidencia ha indicado que una modificación de las funciones del
receptor NMDA, reducida o alterada, puede ser la llave característica en el mayor
desorden cognitivo humano, la esquizofrenia (Mohn et al, 1999). Bloqueadores no
selectivos, como el PCP o la ketamina interrumpen la formación de memoria y
causan un síndrome similar a esquizofrenia en humanos, recapitulando síntomas
positivos y negativos y de desorden cognitivo (Tsai and Coile, 2002). Este
decremento en la función del receptor NMDA se puede deber a una sobreexpresión
de la subunidad NR3A, ya que se ha observado que receptores NMDA que contienen
66
esta subunidad (NR1|NR2|NR3A) exhiben una reducción de su actividad similar al
inducido por el efecto del PCP y la ketamina, además la permeabilidad al calcio
disminuye significativamente con el subtipo NR3A. Una hipofunción del NMDA
distorsionaría los mecanismos de señalización dependientes de calcio, tal como se
ha observado en esquizofrenia (Lidow M, 2003).
La relación de la esquizofrenia con la hipofunción es aceptada hoy en día por
evidencias neurofisiológicas y bioquímicas (Woo et al, 2008). Estos resultados
indican, que aumentar la actividad de los NMDAR puede ser benéfico para el
tratamiento de desordenes cognitivos. Sabemos que una activación directa de los
receptores por el sitio del glutamato, puede generar excitotoxicidad, pero
aumentando la actividad del sitio del co-agonista glicina es una buena posibilidad y
ha tenido beneficios clínicos (Javitt, 2008).
Otra alternativa prometedora podría residir en el desarrollo de moléculas
capaces de aumentar la actividad del NMDAR a través de sus sitios moduladores
(Potenciadores NMDA ó moduladores alostéricos positivos). Hay dos mecanismos
potenciales a través de los cuales la actividad de los NMDAR puede ser potenciada:
primero, previniendo el cierre del dominido NR2 NTD con compuestos que desplacen
al ligando endógeno Zn+2 y mantener la hendidura del dominio NTD en la
conformación abierta.
Segundo, estabilizando el estado abierto del canal
(enlenteciendo la desactivación) ó bloqueando la entrada al estado desensibilizado
con componentes que se unan a la interface del dímero ABD, dando varias
oportunidades para potenciar la actividad del NMDAR y saber si es viable como
blanco para el desarrollo de nuevos tratamientos antipsicóticos (Paoletti and Neyton,
2007).
67
68
III. CONCLUSIONES
El estudio del receptor NMDA es importante por su gran participación en
muchos procesos sinápticos: fisiológicos y neurodegenerativos, que se llevan a cabo
en el sistema nerviosos central. Estos procesos involucran la excitabilidad general,
plasticidad sináptica y neurodegeneración por excitotoxicidad.
El papel principal de los NMDARs en el cerebro es la inducción y desarrollo de
la potenciación y depresión a largo plazo, se cree que estaos dos mecanismos son
controlados bidireccionalmente, manejándolas como dos procesos con vías
independientes.
Estos mecanismos se llevan a cabo gracias a que este receptor posee un canal
iónico que conduce cationes con alta permeabilidad al Ca2+ y a sus diferentes subpoblaciones de receptores, principalmente aquellos que presentan subunidades de la
familia NR2 (A-D), las cuales han mostrado un particulares acceso a proteínas y
enzimas intracelulares, capaces de modular segundos mensajeros involucrados en la
señalización y que pueden influir en la magnitud de la señal de calcio generada,
tráfico y expresión de genes. Pero las bases moleculares mediante el cual el NMDAR
lleva a cabo estas funciones aún no se han identificado completamente.
Existe una gran variedad de subtipos de receptores NMDA derivados de
combinaciones di-homólogas y tri-heterólogas de sus subunidades, distribuidas en el
sistema nervioso central con diferentes patrones espacio-temporales no muy bien
entendidos y con propiedades biofísicas (conductancias, constantes de desactivación
y desensibilización) que también varían dependiendo de las subunidades que lo
ensamblen,
tampoco han sido caracterizadas en su totalidad a pesar de influir
significativamente en la duración de las corrientes postsinápticas excitatorias.
Además no se han identificado compuestos completamente selectivos para
discriminar y modular las diferentes subunidades que lo componen, complicando las
estrategias terapéuticas y de manipulación para el estudio del NMDAR.
69
Por lo tanto, es necesario continuar investigando al NMDAR para conocer los
mecanismos que gobiernan su participación en el cerebro, encontrar nuevos
compuestos
capaces
funcionamiento,
de
modularlo
e
identificar
proteínas
claves
de
su
de esta manera, contar con nuevas estrategias con potencial
farmacológico para la intervención de padecimientos neurodegenerativos que
involucran la desregulación del receptor NMDA.
70
IV. PERSPECTIVAS
Conocer la manera en que los diferentes subtipos de receptores NMDA
contribuyen en los procesos de excitotoxicidad y plasticidad sináptica en el sistema
nervioso central sería de gran ayuda para poder entender los mecanismos
involucrados en
aprendizaje, memoria, adquisición de experiencia, supervivencia
neuronal y neurodegeneración. Nosotros nos hemos interesado en los subtipos NR2
porque son los que le confieren al receptor mayor variedad farmacológica y funcional
y también se encuentran involucradas en procesos fisiopatológicos.
En nuestro laboratorio contamos con los cDNAs de los subtipos NR1 y NR2,
también el equipo de perfusión rápida necesario para reproducir
los tiempos de
activación-desactivación (ver figura 29), entre otros protocolos. Nosotros pretendemos
contribuir en la caracterización de las propiedades biofísicas del canal del NMDAR en
células HEK-293 y en neuronas, así como la modulación y mecanismos que algunos
compuestos ejercen sobre su actividad.
Adicionalmente, el receptor NMDA cuenta con diversos sitios que poseen
potencial farmacológico aun no explorados, como la interfase del dímero ABD (sitio 3,
ver figura 29), el cual es análogo en receptores AMPA, en los cuales los fármacos
ciclotiazida y aniracetam actúan como moduladores alostéricos de tipo positivo y es
posible que para el caso de los receptores NMDA pudieran conservar la actividad y
servir para probarse en modelos de esquizofrenia. Por lo tanto, podríamos aprovechar
el equipo de perfusión rápida para probar la actividad de fármacos de este tipo en el
NMDAR mediante protocolos de estimulación usando receptores con las subunidades
NR2 (A-D).
71
72
V. BIBLIOGRAFÍA
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