Técnicas de congelación y sexado del semen bovino y

Técnicas de congelación y sexado del semen bovino y su importancia en reproducción
bovina
Claudia Jiménez Escobar MV MSc S DVSc DACT
Profesor Asociado UN-FMVZ
Congelación de semen
El proceso de congelación de semen bovino incluye los siguientes pasos: colecta, evaluación del semen, cálculo del
número de pajillas posibles, dilución del semen al volumen requerido y finalmente el proceso de criopreservación.
El proceso de colecta debe ser higiénico y evitando el shock térmico de los espermatozoides (para una revisión
completa del teme refieránse a Baracaldo et al., 2006) .
La colecta se realiza con vagina artificial (VA) o por electroeyaculación (EE; Palmer et al., 2005). Los toros Bos
taurus (“mansos”) se pueden colectar con vagina artificial con la ayuda de una vaca en celo (aunque pude no estar en
celo e inclusive puede ser un buey), mientras que los toros indicus, de ganadería de carne (que se consideren
peligrosos) deben ser colectados por medio de la EE para proteger a los operarios.
Existen varios equipos para EE que dependen del operario o tienen un programa automático que inicia con presionar
un botón. Estos últimos son muy útiles sobre todo cuando hay poca ayuda de personal. El EE consiste en un
transductor con tres electrodos ubicados centralmente y que se coloca por vía rectal una vez se evalúan las heces. El
operario colecta el semen en una bolsa e inmediatamente el semen debe ser evaluado.
La evaluación del semen incluye la determinación del volumen, color, la motilidad (masal e individual progresiva) y
la morfología. Con esta información se calcula el número de espermatozoides viables en la muestra. Después se
divide este número por el número deseado por pajilla (generalmente de 20 millones) y se calculan el total de pajillas
posibles con el semen obtenido. También se calcula el volumen de diluyente que se requiere para ese número de
pajillas.
Parámetros
Volumen:
3 a 6 cc
Olor:
Suigeneris
pH:
6,4 a 6,9
Apariencia:
Cremosa
Muy buena
Lechosa
Buena
Blanquecina lechosa Regular
Traslúcida
Mala
mayor a 750 x 106
400 a 750 x 106
250 a 400 x 106
menor a 200 x 106
Motilidad masal (4x o 10x)
• Semen muy bueno: ondas oscuras marcadas con rápido movimiento.
• Semen bueno: ondas menos oscuras que el anterior, marcadas con movimiento moderado.
• Semen regular: ondas claras con movimiento muy ligero.
• Semen malo: no hay ondas, se observan los espermatozoides inmóviles
Motilidad individual: diluido (400x)
• Muy bueno:
> 80 %
• Bueno:
60 – 79%
• Rregular:
40 – 59%
• Malo:
< al 40%
Morfología
Anormalidades Primarias
Total
Muy bueno
<10
< 25%
Bueno
10 - 19%
26-39%
Regular
20 - 29%
40-59%
Malo
> 29%
>59%
Ejemplo
Volumen:
Concentración
Morfología normal
Motilidad
10 ml
800 millones
80%
80%
TOTAL DE ESPERMATOZOIDES VIABLES
10 x 800 x 0.8 x 0.8 = 5120 millones totales
TOTAL DE PAJILLAS
5120 millones / 20 millones = 256 pajillas
VOLUMEN FINAL PARA PAJILLAS DE 0.5 ML
256/2= 128 ml
VOLUMEN DE DILUYENTE
128-10 (del semen) = 118ml
El diluyente que se añade para congelación generalmente es del tipo TRIS (buffer), El diluyente debe contener
sustancias iónicas o no iónicas que mantengan la osmolalidad del medio (TRIS), una fuente de lipoproteína de alto
peso molecular (yema de huevo, leche descremada), una fuente de energía como fructosa o glucosa, y un
crioprotector. Existen varios tipos de crioprotectores: Los que penetran la membrana como son el 1,2-Propanodiol
(PROH), el Dimetilsulfóxido (DMSO), el Etilén-Glicol (EG) y el Glicerol; los que no penetran la membrana como,
Sacarosa, Glucosa, Dextrosa, Polivinil-pirrolidona (PVP), Dextran, Polietilen-glicol (PEG). De estos el más
utilizado para la criopreservación de semen bovino es el glicerol a una concentración final en el diluyente del 7%.
El diluyente puede venir en dos fracciones o en una fracción. Si viene en una fracción (glicerol 7%) simplemente se
añade el diluyente al semen (lo más rápido posible después de la colecta). Si son dos fracciones, lo que implica es
que una fracción es simplemente buffer (Fracción A) y la otra contiene el crioprotector que generalmente es glicerol
al 14% (fracción B). Cuando son dos fracciones la mitad del diluyente es A (ej 64 ml) y la otra mitad es B (ej 64
ml). La primera fracción se añade a temperatura ambiente y la segunda fracción se añade a 4-5C.
Independiente de si es una fracción o dos el semen, una vez diluido debe empezar una curva de frío lenta para que
éste llegue a 5C en un lapso de 2 horas. Una vez se logran los 5C, si hay que añadir la fracción B, ésta se añade
también a 5C. Después de diluido completamente el semen viene el siguiente paso que es el periodo de equilibrio
que puede durar de 2-24 joras y se realiza a 5C. En este tiempo el crioprotector penetra las membranas del
espermatozoide para protegerlo de los daños que se pueden generar durante la criopreservación y la descongelación.
Después de alcanzado el equilibrio, se congela el semen a vapores de nitrógeno líquido (-120C) por un lapso de 10
minutos y luego se sumergen las pajillas en el nitrógeno para ser almacenadas.
Muy importante el proceso de evaluación del semen postdescongelación. Se considera que el semen apto para usar
en inseminación artificial convencional, debe tener al menos 10 millones de espermatozoides viables a la
descongelación, y este semen debe tener una motilidad progresiva mínima del 30-35%. También se le debe realizar
una prueba de resistencia que consiste en evaluar la motilidad del semen por dos horas. El semen debe tener al
menos 5% de motilidad a las dos horas de descongelado. También se debe tomar una pajilla y enviarse para cultivo
microbiológico.
Después de aprobado, las pajillas se empacan en escalerillas que pueden contener entre 10-20 pajillas. Aun que
también hay goblets que permiten el empaque a granel.
Sexado de semen
Una de las demandas más grandes en la producción bovina actual es la de poder controlar el sexo de la cría. En
general, la producción bovina se ve favorecida con la producción de terneras y solo en contadas ocasiones son
económicamente rentables los terneros (machos). Inicialmente el sexaje fue una técnica asociada a la producción de
embriones, donde se realizaba una biopsia del embrión, se realizaba PCR de las células extraidas y de esta manera se
decidía solo transferir las hembras. Esta técnica no cumplió las expectativas debido a que la tasa de preñez después
de la biopsia del embrión era significativamente menor y se prefería entonces transferir todos los embriones. La
técnica del ultrasonido (US) también permitió la determinación del sexo fetal (ya no del embrión) hacia los 60-70
días de gestación. Sin embargo, una vez se detecta un macho, ya la gestación está avanzada y la inducción del aborto
sería indeseable en términos económicos porque se incrementarían significativamente los días abiertos.
Recientemente (2001), llegó la tecnología del semen sexado de forma comercial, que parecería ser el sueño hecho
realidad. Sin embargo estamos lejos de que está tecnología sea utilizada de rutina pues todavía el sistema es costoso
e ineficiente. El propósito de esta revisión es explicar cómo se realiza el sexaje del semen bovino y discutir sus
aplicaciones en al producción bovina actual.
Métodos de sexaje del semen
Hasta este momento el único método que se considera aceptable para el sexaje del semen es el de citometría de flujo
(Sharpe and Evans, 2009). El proceso consiste en la utilización de un colorante que se adhiere al DNA, Hoechst
33342, y que permite diferenciar la cantidad de DNA presente en el cromosoma Y o X (un 4% más de DNA) de
cada spz (Garner, 2009). El citómetro de flujo permite separar uno a uno los spz para así poder detectar con el rayo
ultravioleta (UV) la cantidad de DNA a través de la cantidad de luz emitida por el colorante. Adicionalmente se
añade otro colorante, yoduro de propidio (PI) que permite determinar los spz muertos o dañados y de esta manera
separarlos de los spz sexados y viables (Figura 1).
Figura 1. Proceso de sexaje del semen (Tomado de Seidel, 2007)
La tecnología ha dado pasos gigantes, lográndose una eficiencia del 85-90% para el bovino, que es la especie con
mejores resultados. Con las modificaciones tecnológicas, hoy en día se producen diez dosis seminales cada una con
dos millones de spz, por hora (Garner, 2006). Esto se podría considerar significativamente mejor que los ensayos
inciales, pero solo el 50% de los spz se logran sexar y el resto debe ser descartado (Seidel, 2007).
Se han reportado diferencias entre la cantidad de DNA que separa el spz Y o el spz X siendo más marcada en la
Chinchilla y dentro de los bovinos, la raza Jersey es la que más diferencias muestran entre la cantidad de DNA entre
el cromosoma Y versus el X. Por consiguiente la técnica de sexaje requiere ser estandarizada para cada especie y
raza (Garner, 2006).
Se cuestiona si el colorante que se adhiere al DNA pueda crear alteraciones genéticas en el embrión resultante; sin
embargo los estudios muestran que, a pesar de que el colorante persiste en el embrión hasta la etapa de 8 células, no
se han detectado anomalías genéticas en los terneros nacidos por esta técnica. Vale la pena resaltar que faltan
estudios epidemiológicos que realmente confirmen esta aseveración (Tubman et al., 2004).
Inconvenientes del semen sexado
El principal inconveniente del proceso es el costo del equipo. El equipo cuesta alrededor de 350.000.oo dólares y
adicionalmente su mantenimiento también es costoso.
Con relación al proceso, un inconveniente importante es la baja velocidad con la que se separan los spz y la
alteración en el potencial fertilizable de cada spz. Inicialmente la técnica era muy lenta y para poder tener resultados
aceptables, se empleaban técnicas como la inyección intracitoplasmática (ICSI) muy utilizada en humanos,
inseminación oviductal (humanos) y la producción de embriones sexados por técnicas in vitro (bovinos). Hoy en día
la técnica se ha vuelto más eficiente lográndose que la inseminación artificial (IA) convencional alcance niveles
comerciales interesantes; sin embargo, solamente se consiguen tasas de preñez aceptables en novillas (de Graaf et
al., 2009).
El proceso no se ha podido generalizar con todos los toros debido a que solo los toros de alta fertilidad pueden ser
sexados, ya que las dosis seminales deben ser de 2-5 millones de spz para que el proceso sea comercialmente
factible.
La razón por la que el spz sexado tiene menor fertilidad aun no es clara. Se discute que la dilución del semen durante
el proceso de sexado es deletérea debido a la remoción de lípidos y proteínas protectoras del spz presentes en el
plasma seminal. Adicionalmente se considera que la adición del colorante para detección del cromosoma X o Y, la
exposición a la luz UV, así como las altas temperaturas y los cambios de presión durante el sexaje alterarían dicha
capacidad fertilizante. Por esta razón la capacidad fertilizante de los spz sexados está afectada tanto por los daños
que sufre el spz per se y la dosis seminal tan baja que se utiliza (de Graaf et al., 2009).
Resultados en campo
La principal aplicación de campo es la IA de novillas. Se logra un mejoramiento significativo superior al la técnica
tradicional, se incrementa el número de hembras producidas, reduciendo el despaje de terneros macho recién nacidos
(Weigel, 2004). También se reduce la tasa de distocia y de problemas puerperales asociados a éstas (Seidel, 2003).
Seidel et al., (1999) realizó un estudio en novillas, evaluando las tasas de preñez para diferentes dosis seminales y
diferentes sitio de deposición del semen (cuerpo o punta del cuerno). Según ese estudio no hubo diferencias
significativas en tasas de preñez con dosis bajas, versus dosis tradicionales (20 millones) ni tampoco hubo
diferencias entre los dos sitios de deposición del semen.
Tabla 1. Resultados de tasas de preñez con semen sexado (Seidel et al., 1999).
En Dinamarca se realizó un estudio con un número significativo de hatos (N=60). En dicho estudio la dosis seminal
fue de 2 millones de espermatozoides (spz) con una motilidad mínima del 35%. Solo se inseminaron novillas en
excelente condición corporal. Las tasas de preñez fueron un 5-10% menores comparada con la de las novillas
inseminadas con 15 millones de spz no sexados y el 90% de los partos fueron de terneras (Borchersen and Peacock,
2009).
No se recomienda la utilización de semen sexado en novillas sincronizadas para inseminación a tiempo fijo (IATF)
ya que las tasas de preñez también son menores. Por consiguiente para lograr la mejor eficiencia se deben inseminar
novillas en buena condición corporal y a celo detectado (Seidel, 2007).
Dentro de las múltiples aplicaciones del semen sexado estaría en la industria de transferencia de embriones (ET). Un
estudio japonés reportó el uso de semen sexado en novillas y vacas Holstein superovuladas. Las novillas
superovuladas fueron inseminadas con 10 millones de spz a las 12 y 24 horas de iniciado el celo. En este estudio no
se encontraron diferencias significativas en el número de embriones recuperados ni en la calidad de los mismos. En
ese mismo estudio se comparó a nivel de campo, la producción de embriones con semen sexado entre vacas y
novillas. Se encontró que las novillas produjeron un mayor número de embriones fertilizados que las vacas.
También se encontró que inseminar dos veces (cada una con 5 millones de spz daba más embriones que inseminar
una sola vez. Otro importante hallazgo en este estudio, es la diferencia que se encontró con cada uno de los Toros.
Es decir que hay toros cuyos spz sobreviven mejor al sexaje que otros y por consiguiente los toros deben ser
evaluados en su potencial fertilizante después del sexaje, tanto para programas de IA convencional como para
programas de ET o de producción de embriones in vitro (Hayakawa et al., 2009).
Un estudio en Finlandia, similar al anterior, evaluó los resultados de ET en novillas y vacas Holstein, pero esta vez
utilizaron dosis de 2 millones de spz sexados inseminando cada 12 horas por 2-4 veces. En este estudio nuevamente
se encontró que en las novillas no había diferencias significativas en el número o calidad de los embriones obtenidos
pero en las vacas si hubo una reducción sustancial (de alrededor de un 50%) en el número de estructuras fertilizadas.
En este estudio también se comparó si las tasas reproducción de embrioines mejoraban si el semen se depositaba en
la punta del cuerno de cada lado o si se depositaba todo el semen en el cuerpo del útero. Este estudio no encontró
diferencias significativas a este respecto (Peippo et al., 2009).
El efecto de la dosis seminal sobre las tasas de preñez también ha sido evaluado. Se evaluaron dosis desde 1 a 6
millones de spz y se comparó la deposición de semen en el cuerpo del útero o en la punta del cuerno uterino
ipsilateral a la ovulación. No hubo diferencias entre los dos sitios de deposición del semen, ni tampoco hubo
diferencias significativas en las tasas de preñez con dosis desde los 1.5 millones de spz (Seidel et al., 1999; Seidel y
Schenk, 2008).
Comentarios finales
La criopreservación de semen puede tener dos propósitos: para uso interno o para comercialización. Si es para uso
interno el procedimiento puede ser efectuado a nivel de finca, pero si es para uso comercial este proceso debe ser
realizado en centros de colecta y congelación de semen debidamente acreditados por el ICA.
En cuanto a la utilización de semen sexado, a pesar de que se ha avanzado mucho en el proceso, todavía las tasas de
preñez son bajas en vacas y por consiguiente su uso se restringe principalmente a novillas fértiles. También se ha
explorado su uso a nivel de producción de embriones in Vitro, donde existe mucha variación entre los toros. El
semen sexado no es para todos los toros y por ende no se encuentra disponible semen sexado de todos los toros.
Referencias
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