Gaspoz J.

2do Encuentro de Jóvenes Investigadores en Ciencia y Tecnología de Materiales – Posadas – Misiones, 16 - 17 Octubre 2008.
DISEÑO DE BIOMATERIALES POR COACERVACIÓN DE PROTEÍNAS
DE SUERO LÁCTEO Y ALGINATO DE SODIO: EFECTO DEL PH Y
FUERZA IÓNICA
Javier Gaspoz (1)
Director/es: Liliana G. Santiago, Carlos R. Carrara
(1) Grupo de Coloides - Instituto de Tecnología de Alimentos - Fac. de Ing. QuímicaUniversidad Nacional del Litoral
1ro de mayo 3250 - Santa Fe
Email: [email protected]
TÓPICO: BIOMATERIALES
RESUMEN
Las proteínas (Pr) y los polisacáridos (Ps) son biopolímeros ampliamente distribuidos en la
naturaleza. Sus interacciones en solución pueden ser segregativas ó asociativas, un caso particular de las
segundas es la coacervación compleja. Con diversas aplicaciones en: microcápsulas, films, aditivos
alimenticios, etc. Se estudio la modificación del pH y fuerza iónica (µ) sobre la interacción entre proteínas
de suero lácteo (WPC) y alginato de sodio. Se utilizó glucono-δ-lactona para disminuir el pH. Registrando
el mismo y la formación de agregados con un equipo Turbiscan TMA2000, midiendo transmitancia.
Los resultados mostraron tres fenómenos: (i) a pH neutro y baja µ, las Pr y el Ps presentan carga
negativa y podrían existir interacciones atractivas entre los parches positivos de la Pr y el Ps, (ii) a pH
cercano al punto isoeléctrico de la Pr, se forman complejos electrostáticos solubles, (iii) a pHs mas bajos se
produce la agregación de los complejos solubles y consecuentemente la coacervación compleja. El aumento
de µ disminuye las fuerzas repulsivas, existiendo un corrimiento en los pH de coacervación.
El estudio de las variables del proceso de coacervación compleja es relevante dado la potencial
aplicación del mismo para el desarrollo de biomateriales.
Palabras Claves: Coacervación compleja, proteínas lácteas, Alginato de sodio, Microencapsulación.
INTRODUCCIÓN
El estudio de las interacciones entre proteínas y polisacáridos tiene relevancia para muchos productos
farmacéuticos, cosméticos y alimentos procesados, y su interacción macromolecular puede afectar las
propiedades de dichos productos, contribuyendo entre otros factores al mejoramiento de la estabilidad,
textura, propiedades funcionales y vida en estantería. Una de las posibles aplicaciones futuras de estas
interacciones se da en la microencapsulación por coacervación, herramienta eficaz para proteger del
ambiente materiales sensibles (volátiles, enzimas, tinturas, drogas, etc.) y/o permitir su liberación controlada.
La biodegradabilidad de los complejos de biopolímeros puede aprovecharse además como empaque
biodegradable [1].
Las interacciones entre proteínas y polisacáridos en solución pueden ser repulsivas o atractivas. Las
interacciones repulsivas pueden dar a lugar a la cosolubilidad de proteínas y polisacáridos para soluciones
muy diluidas, o bien puede darse un sistema inestable donde las mezclas de biopolímeros tienden a la
segregación [2]. Alternativamente puede darse el acomplejamiento entre ambas especies, debido a la
interacción electrostática atractiva entre los parches cargados positivamente de la proteína y las cargas
negativas del polisacárido. Estos complejos electrostáticos podrán ser a su vez solubles o insolubles. Los
complejos insolubles conducen a una separación de fases de la mezcla en dos capas líquidas: una fase
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concentrada en los dos polímeros y la otra fase conteniendo principalmente solvente. Tal proceso es llamado
coacervación compleja [3].
Las interacciones atractivas y repulsivas entre proteínas y polisacáridos dependerán además de factores
tales como el pH y la fuerza iónica (µ) del sistema. Por encima del pI de las proteínas y con polisacáridos
aniónicos, en general ocurrirán interacciones repulsivas, mientras que por debajo del pI ocurrirán
interacciones atractivas (acomplejamiento) [4, 5].
Los sistemas coloidales pueden ser considerados cinéticamente estables si su velocidad de
desestabilización es lo suficientemente baja comparada con el tiempo de vida medio esperado. Existen dos
fenómenos principales de desestabilización que afectan la homogeneidad de las dispersiones coloidales
acuosas: la migración de partículas y la variación del tamaño de partícula o agregación.
Las sustancias elegidas para este trabajo fueron el concentrado de proteínas de suero lácteo (Whey
Protein Concentrate, WPC) y el Alginato de Sodio (AS). El WPC está compuesto mayoritariamente en un
52% por ß-lg y un 20% de α-la, con un pI de 5,2 y 4,1 respectivamente [6]. El Alginato de sodio es un
polisacárido obtenido a partir de algas pardas; es una sal del ácido algínico formado por una
copolimerización 1,4 de unidades de ácido D-manurónico y ácido L-gulurónico. A pH neutro, el AS tiene
carga negativa debido a la ionización de los grupos carboxílicos, y solo por debajo de pH 2,5 su carga neta se
vuelve positiva [7, 8].
El objetivo de este trabajo de investigación fue: profundizar los conocimientos teóricos sobre el
proceso de interacción entre las proteínas del suero lácteo y el alginato de sodio en fase acuosa, estudiando el
efecto de la modificación de variables del medio acuoso proteína/polisacárido (Pr/Ps), pH y fuerza iónica (µ)
sobre el proceso de interacción entre los mismos, mediante una técnica de espectroscopía de transmitancia.
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
Materiales. El concentrado de proteínas de suero lácteo comercial (whey protein concentrate, WPC)
fue provisto por Arla Food (Porteña, Córdoba, Argentina). Su composición fue: proteínas 76,81 % (N x
6,38); grasas 1,00 %; cenizas 2,05 %; humedad 7,18 %. La cantidad de iones calcio (Ca2+) presente en el
polvo de WPC se cuantificó por espectrometría de emisión de llama y fue de 0,31 % (P/P). Una muestra
comercial de alginato de sodio (AS) fue provista gentilmente por Degussa (Buenos Aires, Argentina) y
utilizada sin purificación. Su composición fue: carbohidratos 63%, humedad 14 %, ceniza 23% (Na+
9300mg/100g, K+ 800mg/100g) y un peso molecular de 135 KDa (datos provistos por Degussa). Se utilizó
glucono-delta-lactona comercial de SIGMA (St. Louis, USA) (pureza mínima 99,9%, PM 178,14).
Preparación de las soluciones y mezclas. La muestra en polvo de alginato de sodio (AS) fue disuelta
en agua ultrapura Milli-Q con agitación a 800 rpm y calentado a 70 ºC durante 35 minutos hasta disolución
completa. Se agregó azida sódica 0,02 % (P/V) para su conservación y fue almacenada a 4ºC hasta el día de
su utilización. Las soluciones de WPC fueron preparadas en el momento de realizarse las mezclas,
disolviéndolas conjuntamente con el NaCl para modificar la fuerza iónica, si lo requiriese, y agitando a 800
rpm a temperatura ambiente (25–27 ºC). Los sistemas mixtos de WPC/AS fueron obtenidos mezclando
volúmenes apropiados de cada solución de biopolímero. La concentración total de biopolímeros se mantuvo
constante para todos los casos en 0,3 % (P/V).
Una vez preparadas las soluciones de los sistemas mixtos WPC/SA, se ajustó el pH a 7 con HCl y
NaOH 0,1 M, y se agregó glucono-delta-lactona (GDL) en polvo a 0,35 % (P/V) como modificador del pH.
La molécula de GDL sufre en solución una hidrólisis casi inmediata, por lo que fue agregada 2 min. antes de
comenzar a medir y con agitación durante 35 seg. Las mediciones de %T y pH en función del tiempo se
realizaron en simultáneo durante 2 horas.
Diseño del experimento. Para este trabajo se estudiaron los siguientes factores y niveles: pH 7 – 3,5;
relación proteína/polisacárido (Pr:Ps) WPC:AS (1:1), (2:1) y (4:1); y fuerza iónica (µ) [NaCl] 0, 15, 30 y 50
mM. Se evaluaron como respuesta el % de transmitancia a 850 nm y el pH.
Mediciones de pH y transmitancia. El pH en función del tiempo se registró electrónicamente con un
pH-metro Sper Scientific, con una sonda de temperatura incluida en el equipo y un electrodo de pH
(calomel).
La transmitancia se determinó con un equipo para analizar estabilidad de dispersiones coloidales
Turbiscan TMA 2000 (Tolousse, Francia), tal y como es utilizado por Closs et al. [9]. Las muestras fueron
puestas en tubos cilíndricos y luego en el equipo. Los perfiles de transmitancia en función de la altura del
tubo a distintos tiempos fueron evaluados mediante el análisis de su valor medio. Estos cálculos son útiles
para el caso de fenómenos de variación de tamaño, y están disponibles desde el software del equipo.
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De acuerdo a la ley de Lambert-Beer, la transmitancia o flujo transmitido T es definida como
T = − ln( I / I o ) , donde la intensidad de luz I es la que pasa a través de un volumen de solución en un cubo
de 1 cm e Io es la intensidad de luz incidente. La expresión analítica del flujo transmitido T medido por el
equipo como función del camino libre medio de fotones l:
T (l , ri ) = T0 ⋅ e
−
2 ri
l
,
l ( d ,φ ) =
con
2d
donde ri es radio interno de la celda de medición,
3φQe
T0(nf) es la transmitancia de la fase continua y Qe es un parámetro óptico del modelo.
Por lo tanto, la transmisión es directamente dependiente del diámetro medio de partícula d y de su
fracción volumétrica Φ.
Tratamiento de Datos. Todas las mediciones fueron realizadas por duplicado, y los valores promedio
y desviación estándar fueron presentados en las gráficas como pares de coordenadas acompañadas de su
correspondiente barra de desviación. Los cálculos fueron realizados mediante el software StatGraphics Plus
5.1 y las presentaciones gráficas con el software OriginPro 7.5 SR0 (OriginLab Corporation, Northampton,
USA).
RESULTADOS Y DISCUSIÓN
Efecto del pH. Las curvas presentadas en función del pH fueron obtenidas a partir de datos de
porcentaje de Transmitancia (%T) y pH en función del tiempo durante un periodo de 2 hs, pero han sido
reescaladas como curvas en función del pH para poder analizar los cambios de %T en función del pH. En la
Figura 1 se muestra la transmitancia (%) en función del pH para las relaciones WPC:AS (1:1; 2:1 y 4:1).
Se observa que a medida que el pH desciende la transmitancia disminuye. Dicho descenso revela tres
regiones (A, B y C). El %T de la mezcla WPC/AS es casi constante a valores de pH por encima de un valor
de pH crítico (pHC) (región A), observable en las tres curvas. En las curvas correspondientes a las relaciones
2:1 y 4:1 se puede observar una segunda región comprendida entre pHC y un pH de separación de fase
(llamado pHΦ1) donde la transmitancia disminuye notablemente a medida que desciende el pH (región B).
Luego, a partir de pHΦ1 la transmitancia desciende abruptamente (región C).
WPC:AS (1:1)
WPC:AS (2:1)
WPC:AS (4:1)
50
40
T (%)
T (%)
30
20
10
A
0
7,0
6,5
6,0
B
pHC
pHC
5,5
5,0
C
pHC
4,5
pHφ1 pHφ1
4,0
pH
Figura 1: Efecto de la relación WPC:AS sobre el
%T a 850 nm en función del pH.
3,5
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
Sin NaCl
NaCl 15mM
NaCl 30mM
NaCl 50mM
7,0
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
pH
Figura 2: Efecto de µ sobre el %T a 850 nm en
función del pH. WPC:AS (1:1).
Esta disminución en la transmitancia podría ser generada por un aumento en el tamaño de los
agregados proteína/polisacáridos debido al aumento de las fuerzas atractivas y a una reorganización
estructural; también podría ser debido a un aumento del número de agregados de acuerdo a la Ley de
Lambert-Beer. Para pH mayores a pHc (región A) ambos biopolímeros serían cosolubles y se encontrarían
en forma independiente en el seno de la solución, como consecuencia de transiciones electrostáticas de las
proteínas a medida que el pH empieza a descender. Para valores de pH menores de pHc (región B), la mayor
afinidad electrostática de las proteínas del suero por el polisacárido (de carga neta negativa) generaría la
formación de complejos solubles entre ambas especies (coacervados). Para pH menores de pHΦ1 (región C)
3,5
Javier Gaspoz
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
Sin NaCl
NaCl 15mM
NaCl 30mM
NaCl 50mM
T (%)
T (%)
la formación de complejos aumentaría junto con la agregación de dichos complejos en estructuras coloidales
de mayor tamaño. Esto conduce a una separación de fases entre una fase acuosa y una fase coacervada, que
depende de la velocidad con la que las partículas de coacervado migren en el seno de la solución. Weinbreck
et al. [3, 10] establecen los valores de pHc y pHΦ1 para una mezcla compleja de proteínas y polisacáridos
como los puntos de la intersección a las rectas tangentes de las curvas, y que señalan un cambio en el
comportamiento de la solución.
Efecto de la relación Pr:Ps. En la Figura 1 también se muestra el efecto de la relación WPC:AS
sobre la transmitancia. A medida que aumenta la relación WPC:AS la intensidad de la señal de transmitancia
disminuye en todo el rango de pH. El aumento de la relación Pr:Ps ejerce también una influencia sobre el
pHC y el pHΦ1 de cada sistema mezcla, aumentando los valores pHc y pHΦ1 efectivos para el cual la mezcla
experimenta cada una de las transiciones. Por otro lado, los puntos inflexión de las curvas son más notorios.
Estos resultados pueden ser explicados considerando la Teoría de Transmisión de la luz (ver Materiales y
Métodos), que demuestra que a medida que aumenta el tamaño de partícula o aumenta la fracción
volumétrica de partículas, disminuye el %T para partículas menores de 1 micrón.
La cantidad de moléculas de proteínas de lactosuero disponibles por cadena de polisacárido es
importante en la formación de complejos electrostáticos, y existen condiciones específicas de pH, relación
Pr:Ps y µ para la cual se alcanza la electroneutralidad del complejo [11]. Debido a que las proteínas del suero
son moléculas pequeñas y globulares en relación a la cadena de alginato de sodio, más grande y ramificada,
se necesitaría un mayor número de proteínas para poder neutralizar las cargas negativas del polisacárido, por
lo que existe una relación óptima Pr:Ps. En este trabajo, la relación 4:1 ha mostrado ser la más eficiente de
las tres en lograr la neutralización de cargas y por lo tanto la formación de complejos coacervados.
7,0
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
pH
Figura 3: Efecto de µ sobre el %T a 850 nm en
función del pH. WPC:AS
(2:1).
3,5
50
45
40
35
30
25
20
15
10
5
0
-5
Sin NaCl
NaCl 15mM
NaCl 30mM
NaCl 50mM
7,0
6,5
6,0
5,5
5,0
4,5
4,0
3,5
pH
Figura 4: Efecto de µ sobre %T a 850 nm en
función del pH. WPC:AS (4:1).
Efecto de la Fuerza Iónica (µ). La influencia de µ fue estudiada mediante la adición de cantidades
variables de microiones (0 – 50 mM de NaCl) a una mezcla de concentración total constante de biopolímeros
de 0,3% (P/V) para tres relaciones de WPC:AS; 1:1, 2:1 y 4:1. Las Figuras 2, 3 y 4 muestran que a medida
que aumenta µ disminuye la transmitancia en todo el rango de pH, para cada una de las relaciones Pr:Ps. Las
mayores diferencias se observan entre las mezclas sin sal y aquellas con 15 y 30 mM [NaCl], mientras que
no existen diferencias entre las curvas de 30mM y 50 mM [NaCl]. Las formas de las curvas son más
sigmoidales y los valores de %T son menores a medida que aumenta µ. Estos cambios característicos de
transiciones entre las regiones A, B y C son mucho más abruptos que las observadas en los sistemas en
ausencia de NaCl, sugiriendo un mayor grado de interacción entre proteínas y polisacáridos.
Por otro lado, en la Tabla 1 se puede observar que a medida que aumenta la [NaCl] los valores de
pHΦ1 se desplazan hacia valores de pH más altos, mientras que los valores de pHc aumentan para [NaCl] 15
mM y luego disminuyen o permanecen constantes dependiendo de la relación Pr:Ps.
Javier Gaspoz
Tabla 1: Efecto de la relación Pr:Ps y µ sobre los valores de pHc y pHΦ1.
0 mM
Conc. NaCl
Rel. Pr:Ps
WPC:AS
(1:1)
WPC:AS
(2:1)
WPC:AS
(4:1)
pHC
pHΦ1
15mM
pHC
pHΦ1
30 mM
pHC
pHΦ1
50 mM
pHC
5,29
5,49
4,46
5,48
4,51
5,33
–
(0,03)
(0,02)
(0,02)
(0,12)
(0,03)
(0,09)
5,31
4,07
5,51
4,50
5,45
4,63
5,26
(0,06)
(0,06)
(0,04)
(0,00)
(0,07)
(0,03)
(0,01)
5,24
4,01
5,52
4,70
5,50
4,89
5,42
(0,14)
(0,03)
(0,06)
(0,01)
(0,16)
(0,07)
(0,09)
(los valores entre paréntesis son las desviaciones estándar de cada observación)
pHΦ1
4,52
(0,02)
4,71
(0,03)
4,86
(0,04)
Estos resultados podrían sugerir que a medida que aumenta la [NaCl], por un lado se produciría un
mayor tamaño y/o número de los agregados de acuerdo a la Ley de Lambert-Beer (menor %T). No obstante,
a partir de [NaCl] 30 mM ya no aumentaría el número de agregados ni el tamaño. Por otro lado, en el sistema
WPC/AS estudiado, la adición de pequeñas cantidades de microiones promovería la coacervación (aumento
de pHΦ1), favoreciendo la solubilidad de los biopolímeros, el acceso a las cargas y la atracción electrostática.
Como resultado, los polímeros interactúan a un pH mayor ya que se alcanza antes la electroneutralidad.
Trabajos previos [3, 12] han señalado la influencia de µ sobre el acomplejamiento entre WPC y goma
arábiga (GA), aunque a concentraciones de microiones bastante mayores, encontrando una concentración
crítica de sal a la cual se suprime el acomplejamiento. Por otro lado a muy baja concentración salina el
acomplejamiento puede ser suprimido, como fue confirmado recientemente por Seyrek y Dubin [13].
El resultado también podría ser explicado considerando que la separación de fases resulta de la
compensación de cargas de los complejos. Debajo de su pI las proteínas tienen carga neta positiva y se unen
a los grupos carboxilos del AS. Sin embargo, debido a la densidad de cargas del AS y la relación Pr:Ps de la
solución la electroneutralidad no será alcanzada totalmente por el WPC libre (posiblemente también debido a
problemas estéricos). Así, si pequeños microiones están presentes en la solución, éstos pueden apantallar las
cargas negativas residuales del AS y reducir la repulsión electrostática entre los complejos, permitiendo una
efectiva separación de fases. Se requieren, sin embargo, ensayos adicionales a mayores concentraciones de
NaCl, e incluso estudiar el efecto de cationes divalentes, para poder corroborar esta hipótesis.
CONCLUSIONES
Mediante el estudio del efecto del pH del medio, la fuerza iónica µ y la relación Pr:Ps sobre las
mezclas acuosas WPC/Alginato de sodio, se encontraron tres fenómenos: (i) a pH neutro y baja µ, tanto la
proteína como el polisacárido presentan carga neta negativa y aunque podría existir una interacción
electrostática atractiva entre los parches positivos de la proteína y las cargas negativas del polisacárido, los
componentes del sistema son cosolubles, (ii) a pH cercano al punto isoeléctrico de la proteína o
inmediatamente por debajo del mismo, se forman complejos electrostáticos proteína-polisacárido, y (iii) una
mayor reducción del pH del medio acuoso conduce a la agregación de los complejos solubles y
consecuentemente a la coacervación compleja.
El descenso de pH, el aumento de µ y el aumento de la relación Pr:Ps dentro del rango estudiado
aumentaron las fuerzas atractivas. Existe un rango estrecho de condiciones que permiten la formación de
complejos solubles, y otro rango de condiciones que produce la formación de coacervados con una
separación de fases asociativa. Se encontró que el rango óptimo de pH para la formación de complejos
solubles es entre pH 5,4 y 4,6 aproximadamente, dependiendo de las concentraciones exactas de solutos y
electrolitos. Por debajo de ese límite inferior ocurre en algunos casos la coacervación con separación de
fases. Es necesario una relación mínima de Pr:Ps que garantice la compensación de cargas y permita la
electroneutralidad del agregado coacervado y la neutralidad de cada fase.
Si bien el pH es el principal elemento promotor de estos fenómenos, la alteración de µ influye en la
formación y agregación de los coacervados. Además el aumento de la relación WPC/AS produjo una mejor
coacervación y una eficaz precipitación y separación de fases. Los valores de pHc aumentaron en este caso
levemente con el aumento de la relación WPC:AS, y los valores de pHφ1 mostraron un aumento importante
con el aumento de la relación WPC:AS.
La puesta a punto de una técnica analítica, el estudio de turbidez por medidas de transmitancia en el
tiempo, resultó una gran herramienta para la obtención de resultados. La intensidad del flujo transmitido
demostró ser una técnica de alta reproducibilidad que aporta una herramienta al estudio de la estabilidad de
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soluciones, permitiendo el análisis del tamaño de partícula y la migración de partículas durante la
coacervación y que no ha sido utilizada hasta ahora para estos fines.
Para finalizar, las proteínas de suero son una fuente económica y eficaz de materia prima para la
generación de coacervados complejos y la generación de nuevos biomateriales. Su alta solubilidad y afinidad
electrostática por los polielectrolitos aniónicos (a pH < pI de su principal componente, la β-lactoglobulina),
favorece las condiciones de generación de la coacervación compleja. Por su parte, el AS es un hidrocoloide
soluble, con una densidad de cargas no muy alta, estable en el rango de pH estudiado y con baja viscosidad.
Esto lo convierte en un complemento eficaz para aplicaciones tecnológicas.
El potencial de la coacervación compleja en áreas nuevas de investigación como la
microencapsulación es enorme, y la profundización del estudio de las interacciones dinámicas de los
coacervados nos permite cimentar una base experimental sólida para continuar estudiando esta
importantísima y potencialmente provechosa área de investigación.
Agradecimientos: Se agradecen los fondos recibidos del Proyecto CAID (12H429) (UNL), PICTO
35831 (ANCYPT – UNL) y PICTO 36237 (ANCYPT – UNL).
REFERENCIAS
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