Identificación y Serotipificación de Salmonella spp.
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Identificación y Serotipificación de Salmonella spp. IV Curso de Capacitación del Programa WHO Global Salmonella Surveillance – América Central San José de Costa Rica (Costa Rica) – 27 de abril al 2 de Mayo de 2009 Dra. María Inés Caffer Servicio Enterobacterias Departamento Bacteriología INEI – ANLIS “Dr. Carlos G Malbrán” Característica Microbiológicas del Género Salmonella El género Salmonella pertenece a la Tribu Salmonelleae, de la Familia Enterobacteriaceae. Los miembros del género Salmonella son bacilos gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm, generalmente móviles por flagelos perítricos (excepto S. Gallinarum), anaerobios facultativos, no esporulados. Taxonomía del Género Salmonella El Género Salmonella comprende 2 especies: Salmonella enterica que se divide en 6 subespecies: Salmonella enterica subespecie enterica (I) Salmonella enterica subespecie salamae (II) Salmonella enterica subespecie arizonae (IIIa) Salmonella enterica subespecie diarizonae (IIIb) Salmonella enterica subespecie houtenae (IV) Salmonella enterica subespecie indica (VI) Salmonella bongori (V) Nomenclatura del Género Salmonella Únicamente las serovariedades de Salmonella enterica subespecie enterica ( que costituyen más del 99,5 % de los aislamientos de Salmonella) se designan con un nombre, relacionado con el lugar geográfico donde se aisló la primera cepa de la nueva serovaridad. Este nombre se escribe con letras romanas, no en itálica y la primer letra va con mayúscula. Ej. Salmonella Typhimurium; Salmonella Oran Las serovariedades pertenecientes a las subespecies restantes de Salmonella enterica y a Salmonella bongori (muy escasas en patología humana y veterinaria) se designan con el nombre de la subespecie, seguido de la fórmula antigénica. Ej. Salmonella IV 50 : b : - y Salmonella IV 44 : a : -. Los nombres de todas las serovariedades están contenidos en el Esquema de Kauffmann-White, publicado por el “Centro Colaborador de la OMS de Referencia e Investigación de Salmonella”, del Instituto Pasteur de París. Técnicas de aislamiento, identificación y caracterización de Salmonella spp. Flujograma de Aislamiento, Identificación y Caracterización de Salmonella spp. a partir de materia fecal MATERIA FECAL (HISOPO) Suspensión en solución fisiológica 1er. día Aislamiento en medios selectivos y diferenciales Caldo de enriquecimiento 18-24 hs, 37ºC Aislamiento en medios selectivos y diferenciales Colonias típicas 2do. día TSI LIA Estría 18-24 hs, 37ºC 3er. día Serotipificación O Lectura Colonias típicas P. bioquímicas TSI LIA Caldo Flagelar Estría 18-24 hs, 37ºC Lectura de P. Bioq. 4to. día Serotipificación O Lectura de P. Bioq. Serotipificación H P. bioquímica Una vez realizada la identificación bioquímica y la serotipificación, se continúa con: • La determinación de la sensibilidad a los antimicrobianos • Estudios de subtipificación molecular por electroforesis en campo pulsado (PFGE), para el estudio de brotes y para el monitoreo programado de aislamientos circulantes. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella Pruebas bioquímicas S. enterica subesp. enterica (I) Dulcita + ONPG Malonato Gelatina Sorbita + KCN L(+) tartrato + Mucato + Salicina Lactosa Habitat de Animales la mayoría de sangre de las caliente cepas S. enterica subesp. salamae (II) S. enterica subesp. arizonae (IIIa) S. enterica . diarizonae (IIIb) S. enterica subesp. houtenae (IV) S. enterica subesp. indica (VI) S. bongori (V) + + + + + - + + + + + - (75%) + + + + - (70%) + (75%) + + + + - d d + + d + + + + + - Animales de sangre fría y medio ambiente + 90 % ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones Pruebas bioquímicas de Salmonella enterica subesp. enterica (I) Pruebas bioquímicas Fermentación de lactosa *** ONPG . Producción de SH2 Fermentación de glucosa *** Fermentación de dulcita *** Fermentación de adonita *** Decarboxilación de lisina ** Decarboxilación de ornitina ** Hidrólisis de arginina ** Hidrólisis de urea ** Producción de indol Hidrólisis de gelatina **** Reacción de rojo de metilo * Reacción de Voges Proskauer * Citrato de Simmons ** Utilización de malonato * Salmonella enterica subep. enterica (I) + +/con gas + + + + + + - *Lectura a los 2 días; ** Lectura hasta los 4 días; *** Lectura hasta los 7 días; **** Lectura hasta los 30 días Caracteres bioquímicos diferenciales entre S. Typhi, S. Paratyphi A y Salmonella spp. P. bioquímicas SH2 (TSI) Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Arginina dehidrolasa Glucosa (gas) Citrato Simmons S. Typhi Trazas + - S. Paratyphi A + + - Salmonella spp. + + + + + + + 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I) y Proteus mirabilis Pruebas bioquímicas SH2 (TSI) Hidrolisis de urea Fenilalanina deaminasa Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Lactosa Dulcita ONPG Salmonella enterica subesp. enterica (I) + + + + - Proteus mirabilis + + + + - + 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I) y Citrobacter freundii Pruebas bioquímicas SH2 (TSI) Urea (hidrólisis) Lisina decarboxilasa Ornitina decarboxilasa Lactosa (fermentación) Sacarosa (fermentación) Dulcita (fermentación) Malonato (fermentación) ONPG Salmonella enterica subesp. enterica (I) + Citrobacter freundii + + + - d d d d d d + + + 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos; d: diferentes reacciones Caracteres bioquímicos diferenciales entre Salmonella enterica subesp. enterica (I), Edwarsiella tarda y Escherichia coli SH2 + P. bioquímicas Indol Citrato Simmons Lisina decarbox. Arginina dehidrol. Manita Dulcita Ramnosa Xilosa ONPG S. enterica subesp. enterica (I) + + + + + + + - E. tarda E. coli SH2 + + + - + + -/+ + +/+ + + + 90% ó más de los resultados positivos; - 90% ó más de los resultados negativos Serotipificación de Salmonella spp. Esquema de Kauffmann-White Estructura antigénica de Salmonella spp. Citoplasma Pilus Flagelo bacteriano Cápsula Ag flagelar H Pared celular Líp ido A Membrana plasmática Co re ADN LP S Ribosomas Ag Vi Ag somá somático O ANTIGENOS DEL GENERO Salmonella El estudio de la estructura antigénica del género Salmonella permite tipificar las bacterias que lo componen en serovariedades (serotipos). La serotipificación completa se basa en la determinación de los antígenos somáticos O, los antígenos flagelares H y el antígeno capsular Vi (si está presente). La serotipificación: Es un importante complemento de la identificación bioquímica. Permite determinar la prevalencia de una serovariedad en distintas zonas geográficas. Es de utilidad en el estudio de brotes y en la vigilancia basada en el laboratorio I.- Antígeno somático O ESTRUCTURA DEL LPS S. Typhimurium Antigeno O CORE Exterior Interior Hep PP – EIN Hep Hep Gal GlcNAc Glc KDO LIPIDO A Abe Glc Man Rha Gal P KDO P KDO Ein Gal n Abe: Abecuosa Man: D-Manosa Rha: L-Rhamnosa Gal: D-Galactosa GlcNAc: N-Acetil-D-Glucosamina Glc: D-Glucosa Hep: L-Glicero-D-Manoheptosa KDO: 3 Deoxi-D-Acido Manooctulosilonico EtN: Etanolamina P: Fosfato Rick,P. E. coli and S. Typhimurim Celular and Molecular Biology. Vol 1, 1987 I.- Antígeno somático O EXPRESIÓN DEL ANTIGENO O Expresión del Antígeno somático O La estructura somática se denomina con la letra O seguida de : “dos puntos” y luego de números arábigos separados por comas Por ejemplo: S. Typhimurium O:1,4,[5],12 S. Enteritidis O:1,9,12 Los símbolos para los factores somáticos determinados por conversión fágica están subrayados (por ej. 1,9,12) [ ] = los factores O entre corchetes, no subrayados, pueden estar presentes o ausentes sin relación con la conversión fágica. Por ej. factor [5] del grupo O:4 (B). Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H Fórmula antigénica (Esquema de Kauffmann-White) II.- ANTÍGENO FLAGELAR H Estructura del antígeno flagelar de S. Typhimurium Rick,P. E. and coli and S. Typhimurim Rick,P. E. coli S. Typhimurim Celular and Celular andMolecular MolecularBiology. Biology.Vol Vol1,1,1987 1987 II.- ANTÍGENO FLAGELAR H EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO H Unas pocas serovariedades de Salmonella spp. poseen una sola fase flagelar, esos aislamientos se denominan monofásicos Ejemplo: Salmonella Enteritidis (9,12:g,m:-) Salmonella Typhi (9,12 [Vi]:d:-) Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H Fórmula antigénica (Esquema de Kauffmann-White) II.- ANTÍGENO FLAGELAR H EXPRESIÓN DEL ANTÍGENO H La gran mayoría de las serovariedades tienen dos especificidades o dos fases en su antígeno flagelar o sea son aislamientos difásicos. En el Esquema de Kauffmann-White, ambas fases están separadas por : “dos puntos” Ejemplo: Salmonella Typhimurium (4,5,12:i:1,2) Salmonella Panama (9,12:l,v:1,5) 1.- La fase 1 (identificada en los ej. por las fases: i o l,v, se denominan con letras separadas por comas) 2.- La fase 2 (identificada en los ej. por las fases: 1,2 o 1,5 se denominan con números arábigos o letras separados por comas ). [ ] = Cuando los factores H están entre corchetes significa que ellos se encuentran excepcionalmente en cepas salvajes. Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H Fórmula antigénica (Esquema de Kauffmann-White) Estructura antigénica O + Estructura Flagelar H Fórmula antigénica: 4,5,12:i:1,2 (O: 4,5,12 / H: i:1,2) Esquema de Kauffmann – White S. Typhimurium Fenómenos de variación que afectan la serotipificación Variaciones somáticas Variación de S R (Lisa Rugosa) Variación M N (Mucoide No mucoide) Variación V W (Capsular No capsular) Variación S T R Variación de Forma Variación No fimbriada Fimbriada Variaciones flagelares Variación OH O Variación de Fase Variaciones Somáticas VARIACION S – R No se puede determinar el Ag O Para obtener colonias lisas: Realizar subcultivos en agar sangre o agar Mueller Hinton Reaislar la cepa Si no es posible revertir la rugosidad: Confirmar la identificación por pruebas bioquímicas Determinar el Ag H VARIACION V - W El antígeno Vi es un antígeno capsular que se encuentra en Salmonella Typhi, Salmonella Paratyphi C y algunas cepas de Salmonella Dublin SUSPENSION BACTERIANA ANTISUERO “Vi” ANTISUERO “O” Capsulada V Calentada 1 h a 60 º C ó 30 min. a 100º C Variación V - W + - - + + + VARIACIONES FLAGELARES VARIACION DE FASE Es la variación reversible de los antígenos H. Ocurre en el género Salmonella (Fase 1 y Fase 2) La gran mayoría de las serovariedades son difásicas: pueden expresar alternativamente antígenos flagelares de dos especificidades. Flujograma de Serotipifacacion de Salmonella spp. Aislamiento con identificación bioquímicas de Serotipificación somática (aglutinación en lámina) Estría en TSA Aglutinación con solución salina al 2% Negativa Negativa (3) Aglutinación c/ antisueros poliv. flagelares H (4) Cepa Rugosa (2) Positiva Aglutinación c/ antisueros de grupo O Serotipificación flagelar (aglutinación en tubo) Caldo flagelar Positiva Aglutinación c/ antisueros poliv. somáticos (1) Salmonella spp. Negativa (5) Aglutinación c/ antisueros de fases H / factores H (6) Inversión o Inducción de Fase (Si es necesario) Formula antigénica H Positiva Aglutinación c/ antisueros de factores O Formula antigénica O Positiva Formula Antigénica Esquema de Kauffmann-White RESULTADO FINAL 1 Antisueros polivalentes somáticos: OS-A y OS-B 2.-Para revertir una cepa de la forma rugosa a lisa, se realizan subcultivos en agar sangre o Mueller Hinton. Si no es posible revertir la rugosidad, se debe confirmar la identificación por pruebas bioquímicas y realizar la serotipificación flagelar H. 3.- Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación somática" 4.-Antisueros polivalentes flagelares: HS-1; HS-A; HSB; HS-C 5.-Ver Consideraciones a tener en cuenta en "Serotipificación flagelar”. 6. Si la serovariedad de Salmonella es difásica y sólo expresa una fase, realizar "Método de inversión de fases" Inversión o Inducción de Fase Ejemplo: Salmonella Typhimurium (4,5,12.i:1,2) Cultivos de S. Typhimurium 1 2 Flagelos de especificidad H:1,2 Flagelos de especificidad H:i POBLACIÓN BACTERIANA BALANCEADA SE EXPRESAN IGUALMENTE LAS DOS FASES NO realizar inversión de fase POBLACIÓN BACTERIANMAYORITARIA EXPRESA FLAGELOS DE ESPECIFICIDAD H:1,2 Realizar inversión de fase Flujograma de Inversión o Inducción de Fase Serotipificación somática O (O: 4,5,12) Serotipificación flagelar H Si la población está balanceada da Fase 1 (H:i) y Fase 2 (H:1,2) Si la población expresa flagelos de fase 1 (H:i) Si la población expresa flagelos de fase 2 (H:1,2) Inversión de fase con antisuero H:i Inversión de fase con antisuero H:1,2 Se inmoviliza la Fase 1 y se expresa fase 2 Se inmoviliza la Fase 2 y se expresa fase 1 Fórmula antigénica: O:4,5,12 H:i:1,2 (Esquema de Kauffmann-White ) Salmonella Typhimurium Determinación de la estructura antigénica flagelar de una serovariedad difásica que expresa sólo una fase flagelar Una serovariedad difásica en algunas ocasiones puede expresar sólo una fase flagelar Ej. Salmonella subespecie I 4,5,12:i:En este caso sólo se expresa la fase flagelar H:i (Fase 1) Tubo de Craigie El cultivo queda inmóvil (en el lugar de siembra) ya que no se expresa la Fase 2 Siembra del cultivo sin formolar Agar movilidad Craigie + 2 gotas del Antisuero de Inversión de fase “i” Esquema de Kauffmann-White Grimont. P.A.D. & Weill, F -X. 2007. Antigenic formulas of the Salmonella serovars, 9 th revision. WHO Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella . Institut Pasteur, Paris, France Interpretación del Esquema de Kauffmann - White Primera columna: Indica el nombre de la serovariedad, si la misma pertenece a S. enterica subesp. enterica (I) o las siglas S. II, S. IIIa, S. IIIb, S. IV, S. V o S. VI, indicando que la serovariedad estudiada pertenece a las otras subespecies, o a S. bongori que no se denominan con un nombre. Segunda columna: Antígenos somáticos O. Los números arábigos indican el o los factores somáticos y se escriben separados por una coma Tercera y cuarta columna: Antígenos flagelares H. Se indican los factores de las fases 1 y 2, del antígeno H, respectivamente . Para la fase 1 los factores se denominan con letras minúsculas, seguida algunas veces por un número que figura como subíndice, para la fase 2 en general se emplean números arábigos, aunque también se utilizan letras minúsculas. Un signo “negativo” indica que la fase considerada está ausente y por lo tanto la serovariedad es monofásica. Recomendaciones y Conclusiones Realizar una correcta identificación bioquímica Realizar una correcta identificación de los determinantes antigénicos somáticos y flagelares Si el aislamiento no reacciona con ninguno de los antisueros flagelares polivalentes, es necesario realizar sucesivos pasajes por tubos de Craigie, con el fin de exaltar la movilidad, hasta lograr el recorrido completo en 18 – 24 hs, de incubación a 37ºC En los casos de serovariedades de Salmonella spp. difásicas, que expresen una sola de las fases flagelares se debe realizar la técnica de Inversión de Fase Realizar una correcta interpretación del Esquema de Kauffmann - White MUCHAS GRACIAS !!!
