SVANOVIR® PRV-gI-Ab

SVANOVIR® PRV-gI-Ab
Test de ELISA para la detección de anticuerpos contra la Enfermedad de Aujeszky
(PRV-gI) en suero.
INFORMACIÓN GENERAL
El virus de la Pseudorabia porcina (PRV) ó herpesvirus porcino tipo 1 fue aislado por
primera vez por Aujeszky en 1902 de un buey infectado con síntomas de rabia, este
virus tiene como hospedador primario el cerdo, aunque utiliza otras especies animales
como hospedadores secundarios siendo suidos infectados la fuente original de infección.
En países con una alta prevalencia de la enfermedad y de forma endémica causa grandes
pérdidas económicas. En animales jóvenes la enfermedad cursa con desórdenes
neuronales y síntomas de alteraciones en el tracto respiratorio. La enfermedad es menos
aguda en animales adultos, los cuales una vez recuperados quedan persistentemente
infectados y el virus permanece latente. De estos animales persistentemente infectados
se ha aislado el virus de ganglios y tonsilas. La transmisión del virus tiene lugar
principalmente a través del contacto con secreciones nasales procedentes de un animal
infectado ó por vía aerógena sin necesidad de contacto directo.
La infección en hembras gestantes provoca abortos, momificaciones y partos
prematuros. Cualquier explotación porcina infectada por el virus de la Pseudorabia
(Enfermedad de Aujezsky) en zonas endémicas debe ser declarada y aislada, así como
proteger los animales no infectados con las medidas de control pertinentes del país. En
algunos países está permitida la vacunación, la cepa vacunal habitualmente utilizada es
una cepa atenuada con una delección, en su genoma (DNA), en concreto en el gen que
codifica el factor de virulencia, la glicoproteína gI. Consecuentemente animales
vacunados no serán portadores de anticuerpos contra la proteína antigénica gI.. La
diferenciación se basa en la presencia de anticuerpos contra la proteína gI en animales
infectados y la ausencia de éstos anticuerpos en animales vacunados.
Tanto animales vacunados como infectados por el virus (PRV) poseen otra
glicoproteína, gII, anticuerpos contra ésta glicoproteína están presentes en suero de
animales tanto infectados como vacunados pero están ausentes en animales no
infectados y no vacunados.
Oficina Central Calle José Echegaray 8 – P.A.E Casablanca I, local 1-3 – 28100 Alcobendas. Madrid.
España – Teléfono: 902 103 578 – Fax: 902 102 459 – e-mail: ventas @tdi.es
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PRINCIPIO DE TRABAJO
SVANOVIR® PRV-gI Ab está diseñado para detectar Anticuerpos específicos contra
la Pseudorabia porcina (PRV) ó herpesvirus porcino tipo 1 en muestras de suero, en el
test gI las placa microtiter están tapizadas con antígeno inactivado que posee la
glicoproteína gI ( y también la gII). El indicativo de la presencia o ausencia de
anticuerpos contra la gI es un anticuerpo monoclonal específico contra gI (mAb)
anticuerpo que va conjugado con la ezcima peroxidasa (HRP).
Si el suero problema carece de anticuerpos contra gI, es decir, animales no infectados,
no vacunados ó vacunados, el antígeno gI quedará libre y el conjugado se unirá al
antígeno. La presencia de (HRP) catalizará el sustrato dando coloración a la reacción.
Si, por otro lado, el suero problema presenta anticuerpos contra gI, como en animales
infectados, estos anticuerpos se unirán al antígeno gI en el pocillo, está unión impedirá
que el conjugado acceda, resultando falta de coloración en la reacción.
De esta forma el test es capaz de discriminar entre animales infectados (reacción
positiva) y animales vacunados con la vacuna gI deleccionada (reacción negativa).
FORMATO DEL KIT
SVANOVIR® PRV-gI Kit contiene todos los reactivos y controles necesarios para la
realización del ensayo.
Existiendo en la actualidad dos formatos del Test.
1.- Artículo numero: 10-7116-02
Test de 2 placas microtiter.
Número de muestras: 192
2.- Artículo numero: 10-7161-10
Test de 10 placas microtiter.
Número de muestras: 960
Volúmenes del equipo: Tiras solas, platos enteros
CONTENIDO DEL KIT
Placas microtiter tapizadas con el antígeno PRV.
Liofilizado (HRP) Conjugado con el anticuerpo monoclonal (mAb) anti-PRV-gI.
20x PBS-Tween
Solución Sustrato (Tetramethylbenzidine conteniendo H2O2). Mantener en oscuridad !
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Buffer de Dilución de muestra.
Solución de Frenado (Contiene ácido sulfúrico). Corrosivo !
Controles:
A. Control Positivo-0,005% Mertiolato.
B. Control Negativo-0,005% Mertiolato.
Material Necesario no suministrado:
1.- Micropipetas. (5-200µl)
2.- Tips.
3.- Agua Destilada.
4.- Contenedor de 1ó 2 litros de capacidad para preparar PBS-Tween.
5.- Fotómetro para placas microtiter con filtro de 450 nm.
MUESTRAS
Se necesitan 100 µl de suero sanguíneo o plasma para cada pocillo. Las muestras de
suero o plasma pueden ser frescas, refrigeradas o previamente congeladas y
descongeladas en el momento del ensayo.
PREPARACIÓN DE LOS REACTIVOS
PBS-Tween.
Diluir la solución 20X de PBS a una concentración 1/20 en agua destilada. Preparar
500 ml por placa diluyendo 25 ml en 475 ml de agua destilada.
Asegurarse de que no se han formado cristales de precipitado en el fondo, en tal caso
calentar la solución con agitación.
Anti-PRV-gl Conjugado
Reconstituir el liofilizado con 10.5 ml de PBS-Tween, añadiendo el buffer con cuidado
a la botella, agitar suavemente unos minutos. Se debe preparar inmediatamente antes de
usar.
PRECAUCIONES
1.- Leer detenidamente todas las instrucciones del Kit antes de ser utilizado.
2.- Mantener el Kit y sus componentes entre + 2º C y + 8º C.
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3.- Todos los reactivos deben ser preparados a temperatura ambiente: 18-25º C.
4.- No mezclar componentes, reactivos o libros de instrucciones entre distintos Kits.
5.- Evitar cualquier tipo de contaminación al preparar los reactivos.
6.- Antes de proceder con el ensayo, revisar la fecha de caducidad.
7.- Utilizar tipos distintos para cada muestra a ensayar.
8.- Incluir en todos los ensayos controles positivos y negativos. Se recomienda incluir
duplicados de los controles.
9.- Usar agua destilada para preparar los reactivos.
10.- La solución de frenado contiene ácido sulfúrico y es corrosivo, usar guantes.
PROCEDIMIENTO
1.- Todos los reactivos deben ser preparados a temperatura ambiente: 18-25º C.
2.- Añadir 100 µl del control positivo (reactivo A) y 100 µl del control negativo
(reactivo B) a los pocillos previamente seleccionados. Se recomienda duplicar los
controles.
3.- Añadir 100 µl de suero problema diluido a cada pocillo, se recomienda duplicar las
muestras.
4.- Incubar la placa a 37º durante una hora.
5.- Lavar los pocillos tres veces con PBS.
6.- Añadir 100 µl de HRP conjugado a cada pocillo e incubar a 37º C durante 30
minutos.
7.- Repetir el paso 5.
8.- Añadir 100 µl de Sustrato a cada pocillo e incubar 15 minutos a temperatura
ambiente, 18-25º C. Contar el tiempo desde que se añade al primer pocillo.
9.- Parar la reacción añadiendo 50 µl de Solución de Frenado a cada pocillo, agitar la
placa. Añadir en el mismo orden que se añadió el Sustrato.
10.- Medir la densidad óptica (OD) en un fotómetro para microplacas a 450 nm, para
prevenir fluctuaciones en los valores de OD, medir dentro de los 15 minutos después de
añadir la Solución de Frenado.
CÁLCULOS
1.- Calcular las medias de los valores de OD para los controles.
2.- Calcular el valor del porcentaje de densidad óptica (OD p) para cada muestra y para
el control positivo de la siguiente forma:
OD p = Medias de los valores OD de las muestras x 100 / Medias de los valores OD del Control Negativo.
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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
1.- Si el valor OD p es menor o igual que 50 la muestra es positiva y contiene
anticuerpos contra gI.
Diagnóstico serológico: animal infectado por el virus.
2.- Si el valor OD p es mayor que 60 la muestra es negativa y no contiene anticuerpos
contra gI.
Diagnóstico serológico:
a) Animal no infectado por el virus y no vacunado contra Aujeszky ó
b) Animal no infectado por el virus pero vacunado con una vacuna contra Aujeszky
con la glicoproteína gI deleccionada.
3.- Si el valor OD p está entre 50 y 60 muestra dudosa, se recomienda repetir el test
Para validad el test, los controles deben estar entre los siguientes límites:
OD Control Negativo
OD p Control Positivo
0,9-1,4
< 30
Si el test según alguno de los parámetros anteriores resultara inválido, se debe repetir el
ensayo.
Muestras con un valor de OD p entre 50 y 60 deben ser repetidas. Si el resultado vuelve
a ser dudoso, se recomienda tomar una nueva muestra del animal y testarla en paralelo
con las anteriores.
Para evaluar si el animal que ha resultado negativo ha sido vacunado o no, se
recomienda utilizar el test SVANOVIR® PRV-gII.
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