Atenuacin natural de suelos contaminados con residuos txicos de

Atenuación natural de suelos contaminados con residuos tóxicos de
origen minero. Aislamiento y caracterización microbiana
Orquidea Coto Pérez
Facultad de Biología, Universidad de La Habana, Habana, Cuba
1.- Antecedentes
En los últimos años, en varios países del mundo, se ha iniciado una nueva
cruzada en la investigación y aplicación de nuevas alternativas que coadyuven
como herramientas para prevenir ó restaurar los daños ocasionados por
acciones antropogénicas ó desastres naturales que dañan de manera severa
nuestro ambiente. Una de ellas es sin duda alguna la biorremediación, entendida
esta como el uso de organismos vivos (plantas y microorganismos) para
contrarrestar los efectos nocivos causados por desastres naturales u
ocasionados intencionalmente.
El presente trabajo
se enmarca dentro de la problemática medio ambiental
ocasionada por los residuos metálicos tóxicos y sus posibilidades de
remediación a través de procesos naturales. Los vertidos industriales,
particularmente los residuos mineros, contienen elementos potencialmente
tóxicos y son un foco de contaminación importante de los sistemas naturales,
que revierte en último término en la salud humana. La capacidad que tienen los
suelos de atenuar estos fenómenos contaminantes a través de procesos
naturales: biológicos, químicos y físicos, puede utilizarse como tratamiento de
remediación de suelos contaminados, y se conoce con el nombre de atenuación
natural.
Una mina, es una excavación realizada para extraer del subsuelo, sustancias
minerales útiles como carbón, hierro, cobre, estaño, oro, plata. Esta excavación
causa una serie de impactos ambientales: pérdida de recursos; movimiento de
tierras, sobretodo en minas a cielo abierto, que conlleva la alteración de la
topografía del terreno; ocupación de suelo explotable y alrededores para
depositar escombros, materiales de desecho...; emisión de contaminantes tanto
a la atmósfera (polvo y metales pesados ), como a aguas (provocando la acidez
de estas, sobretodo en explotaciones de zinc y cobre), como a suelos
(produciendo una transmisión de los contaminantes a los vegetales); eliminación
de cobertura vegetal en la zona de explotación; desviación temporal o
permanente del curso de las aguas; construcción de pistas y acceso para la
explotación; impacto visual. Hay que hacer especial mención en el efecto
denominado, acidificación de las aguas, que se produce por la oxidación de la
pirita que se originan porque esta, se ve expuesta a condiciones atmosféricas
como resultado de las labores mineras consiguiendo como resultado la
acidificación del agua; como esta es un recurso indispensable para todos los
seres vivos , afectará a animales(tanto a los que habitan en el río, como los que
utilizan el agua de este río o depredan alguna especie de este mismo) a
vegetales y como no al propio causante, el hombre.
Una de las vertientes es la remediación bacteriana, se refiere al uso de
microorganismos. Tradicionalmente, se ha visto a las bacterias como
organismos dañinos para la vida, puesto que solamente las consideramos como
causantes de enfermedades ó incluso de muertes. Así mismo como
contaminantes de alimentos, sin tomar en cuenta que muchas de ellas son
necesarias para nuestra vida cotidiana, tales como las levaduras, la participación
bacteriana en los procesos digestivos, en los procesos de degradación de las
heces, en la desintegración de la basura ó su participación en asociación con
diferentes leguminosas en los procesos de fijación del nitrógeno atmosférico. No
obstante, nunca se había visto la parte positiva de su accionar degradando o
transformando substancias tóxicas, nocivas para nuestra existencia.
La biorremediación bacteriana -ya sea mediante el uso de cepas nativas,
mediante el mecanismo de la bioaumentación o el diseño de cepas modificadas
genéticamente- se ha convertido en una nueva alternativa
para atacar de
manera directa muchos de los problemas que presentan la contaminación de
aguas y suelos causada por diferentes contaminantes.
La capacidad mostrada por aislados bacterianos acumulando, degradando ó
transformando diversos contaminantes a otros de menor nocividad y por lo
mismo de menor impacto al ambiente, es lo que ha incentivado a distintas
instituciones de investigación en la formación de equipos de investigadores, inter
y multidisciplinarios para el diseño y aplicación de nuevas tecnologías,
Hoy día, investigaciones realizadas en distintos centros han aportado múltiples
opciones en el uso de bacterias nativas de los sitios que se encuentran
sometidos a la influencia de la contaminación. Muchas de ellas han adquirido
una capacidad sustantiva para poder sobrevivir en esas condiciones pues se
han adaptando a las mismas.
El impacto ambiental de los contaminantes metálicos en suelos y sedimentos es
estrictamente dependiente de la capacidad de complejamiento de éstos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquímicas y biológicas de su entorno. Los metales son especies químicas no
degradables. Por tal motivo, una vez volcados al medio ambiente, sólo pueden
distribuirse entre los entornos aire - agua - suelo, a veces cambiando su estado
de oxidación, o incorporarse a los seres vivos. Los procesos de adsorción y la
formación de complejos en medios naturales son responsables de que la mayor
parte de los vestigios de metales pesados se acumulen en los sólidos en
suspensión, incorporándose rápidamente a los sedimentos, donde se presentan
los mayores niveles de concentración de estos contaminantes.
El impacto ambiental de los contaminantes metálicos en suelos y sedimentos es
estrictamente dependiente de la capacidad de complejamiento de éstos con
componentes del medio ambiente y su respuesta a las condiciones
fisicoquímicas y biológicas de su entorno. Los metales son especies químicas no
degradables. Por tal motivo, una vez volcados al medio ambiente, sólo pueden
distribuirse entre los entornos aire - agua - suelo, a veces cambiando su estado
de oxidación, o incorporarse a los seres vivos. Los procesos de adsorción y la
formación de complejos en medios naturales son responsables de que la mayor
parte de los vestigios de metales pesados se acumulen en los sólidos en
suspensión, incorporándose rápidamente a los sedimentos, donde se presentan
los mayores niveles de concentración de estos contaminantes.
Todas las interacciones entre los microorganismos y los metales u otros
elementos como carbono, nitrógeno, azufre y fósforo son componentes
fundamentales del ciclos biogeoquímicos. Las interacciones metal-microbiota
son estudiadas entonces en profundidad en el contexto de la biotecnología
ambiental, con el objeto de implementar métodos de remoción, recuperación o
detoxificación de metales pesados y radionucléidos.
Dependiendo del estado de oxidación que se presente un metal y la especie que
esté conformando, un microorganismo puede realizar dos transformaciones
posibles. Una correspondería a la movilización del metal, es decir el pasaje de
un estado insoluble inicial (metales asociados a suelos, sulfuros u óxidos
metálicos, por ejemplo) correspondiente a una fase sólida, a un estado soluble
final, en fase acuosa. Este proceso se conoce con el nombre de lixiviación
microbiana. El otro corresponde a la inmovilización del metal, es decir el pasaje
de un estado soluble inicial en fase acuosa a uno insoluble final en fase sólida. A
su vez existen en la naturaleza diferentes mecanismos por los cuales la
inmovilización del metal puede llegar a ocurrir. Dentro de la amplia diversidad
microbiana, existen microorganismos resistentes y microorganismos tolerantes a
metales.
Por todo lo anterior, el objetivo central del trabajo fue aislar y caracterizar
representantes de la comunidad microbiana
presente en dos
los
muestras de
suelos procedente de Murcia, España: suelo natural (SN) y suelo I (SI)(reservorio de un residual minero de sulfuros polimetálicos).
Materiales y métodos
2.- Aislamiento y caracterización de microorganismos mediante el método
convencional
2.1 Muestras de suelos
Se emplearon dos suelos diferentes de la región de Murcia, España. Estas
fueron identificados como SN (suelo natural) y SI (suelo impactado por la
actividad minera con un alto contenido en sulfuros metálicos donde predominan
los de cobre cinc y plomo, pero especialmente la pirita).
2.2 Aislamiento por el método convencional
Se tomaron 10 gramos de cada muestra y se suspendieron en 90 mL de
solución salina fisiológica estéril al 0,85 %. Los frascos erlenmeyers se
colocaron en una zaranda giratoria durante 30 min, a temperatura de 30 oC. A
partir de las suspensiones se realizaron diluciones seriadas desde 10
-1
hasta
-4
10 . Posteriormente, 100 µL de cada dilución fueron inoculadas por triplicado
en cuatro medios de cultivo para microorganismos heterótrofos: LB, LB+extracto
de suelo, Agar caseína almidón y agar sabouraud.
Las muestras
fueron
diseminadas con espátula de Drigalsky y se incubaron a 300 C durante 48 horas,
hasta la aparición de colonias visibles, mientras que los medios agar sabouraud
y agar almidón fueron incubados durante 7 días.
2.2.1 Medios de cultivos para el aislamiento
- Medio Luria-Bertani (LB): triptona1%,extracto de levadura 0.5%,cloruro de
sodio 0.5%, pH 7,2. En caso de medio agarizado se añadio 2% de agar
(Sambrook y cols,1989) .
- Medio Luria-Bertani(LB) + extracto de suelo (DSMZ-Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, Braunschweig, Germany). El extracto
de suelo es rico en microelementos muy necesarios para aislar microorganismos
de estos medios sólidos. Por este motivo, se utilizó el medio LB con adición de
extracto de suelo. Para su preparación se pesaron 400 g de suelo natural (SN).
Se resuspendieron
en 960 mL de agua destilada. Esta suspensión se
autoclaveó a 121º C durante 1 hora, luego se enfrió. Se decantó y se filtró por
papel. Se distribuyeron alicuoatas de 200 mL y se autoclaveó. Por último las
soluciones de extracto de suelo se guardaron en refrigeración hasta su uso. Por
cada 300 mL de medio LB se adicionaron 10 mL de extracto de suelo.
-Medio agar sabouraud: Peptona 2%, agar-agar 2%. pH 6,5.
-Agar almidón.
El aislamiento de cada uno de los microorganismos contenido en las muestras
SI y SN se realizó sobre la superficie de medios de cultivo sólidos siguiendo la
técnica de la siembra por estrías múltiples en superficie. A cada aislado se le
asignó un código que se corresponde con las iniciales del medio de cultivo de
donde se aisló (LB ó LB+ES) y un subíndice numérico consecutivo.
2.3. Caracterización de los aislados representantes de la población
bacteriana heterótrofa
-Tinción de Gram (Morfología, agrupación, presencia de esporas, cistos).
-Prueba de la oxidasa.
-Medios de cultivos selectivos y diferenciales.
1- Medio Kligler para detectar fermentación de glucosa y/o lactosa
15 g de Peptona bacteriológica; 5 g de Proteosa peptona; 3 g de Extracto de
levadura; 1 g de Dextrosa; 10 g de Lactosa; 0.3 g de Tiosulfato de sodio; 0.2 g
de Sulfato ferroso; 5 g de Cloruro de sodio; 0.024 g de Rojo fenol; 10.5 g de
Agar en 1000 ml de agua destilada.
2- Medio King B (King.B, y col, 1954) para la detección cualitativa de sideróforos.
3- 20 g de Proteasa peptona; 1.5 g de Fosfato dibásico; 1.5 g de MgSO4 x
7H2O; 10 g de Glicerol; 15 g de Agar en 1000 mL de agua destilada.
4.- Medio Citrato: K2PO4 (10%); MgSO4 x 7 H2O (10%); NaCl (10%); CaCl 2 x
H2O (10%); Fe EDTA (1.64%).
5.- Detección de microorganismos fijadores de dinitrógeno atmosférico
Medio Sabih: 20 g de Manitol; 0.2 g de K2PO4, 0.2 g de MgSO4; 0.2 g de NaCl;
0.1 g de K2SO4; 5 g de CaCO3; 15 g de Agar en agua destilada.
Medio Rojo Congo: 0.15 g de K2HPO4; 0.12 g de MgSO4 x 7 H2O; 0.1 g de NaCl;
0.5 g de Extracto de levadura; 0.015 g de FeCl3 x 6H2O; 5 g de Ácido málico,
4.8 g de KOH, 20 g de Agar en agua destilada. En este medio se inocularon los
cultivos que crecieron en el medio Ashby.
6.- Solubilización de fósforo inorgánico
El medio LB fue suplementado con fosfato tricalcico (2,5 g/L), solución de azul
de bromofenol (0,4% en etanol), pH 6,7 con NaOH (0,1N) y de esta solución se
añade 6 mL por 1000 mL de medio de cultivo.
7.- Determinación cualitativa de fosfatasa ácida
El medio LB fue suplementado con fenolftaleina di-fosfato al 0,2% y verde de
metilo al 0,005 % como indicador de pH, el cual fue esterilizado por filtración con
membranas de nitrocelulosa, tamaño de poro 0,2 µm.
2.4. Identificación taxonómica
Para la identificación de los bastones o cocobacilos con respuesta positiva a la
prueba de la oxidasa, se utilizó el sistema de identificación API 20 NE. Este es
un sistema estandarizado que combina ocho pruebas bioquímicas y doce
pruebas de asimilación, además de la prueba de oxidasa. Este sistema se aplica
a bacterias no pertenecientes a la familia enterobacteriaceae.
2.5 Aislamiento y caracterización de representantes de la comunidad
bacteriana del ciclo del hierro
2.5.1 Aislamiento de heterótrofas acidófilas, oxidadoras y reductoras de hierro.
Medios de cultivos líquidos para enriquecer los microorganismos acidófilos:
-Medio Harrison (1984)
g/L
(NH4)2SO4
K2HPO4
KCl
MgSO4 x 7 H2O
Glucosa
Extracto de levadura
2,0
0,5
0,1
0.5
1,0
0,1
pH 3,0
-Medios de cultivo Fe(II) liq, Fe (III) liq .
Estos contenían sales minerales como solución basal (SB), extracto de levadura
(EL), elementos trazas (ET) (Christopher y col., 2005-IBS).
Glicerol como fuente de carbono (10 mM) y hierro férrico o hierro ferroso (25
mM). Las soluciones de sulfato ferroso y sulfato férrico fueron preparadas como
soluciones patrón 1 M (pH 1,7), esterilizadas por filtración a través de
membranas con poros de 0,2 µM, al igual que la solución de glicerol (1M).
En frascos estériles de 50mL, se adicionaron 5 gramos de suelo I (impactado) y
30 mL del medio de cultivo correspondiente. Los frascos se colocaron en una
zaranda giratoria a temperatura de 30o C hasta evidencia de crecimiento
microbiano.
El frasco conteniendo medio de cultivo con hierro férrico se llenó hasta el tope
con el objetivo de reducir al máximo la presencia de oxígeno en el sistema y se
colocó en la incubadora en condiciones estáticas.
Con el objetivo de purificar los representantes bacterianos de la población
heterótrofa acidófila del suelo impactado, se procedió a realizar diluciones
cualitativas en placas multipocillos a partir de los cultivos de enriquecimientos.
Para lo cual, se adicionó 2 mL del medio de cultivo a las placas multipocillos y se
inoculó 1 mL del cultivo de enriquecimiento al primer pocillo; posteriormente, se
realizaron diluciones seriadas. .
Más tarde, se observaron al microscopio con contraste de fase, entre cubre y
porta, las preparaciones alícuotas de los diferentes cultivos obtenidos en las
placas multipocillo.
2.6 Aislamiento y caracterización de Shewanellae
2.6.1 Muestras
En frascos estériles de 50 mL se adicionaron 5 gramos de suelo I (impactado) y
en paralelo 5 g de suelo natural. Se llenaron los frascos hasta la superficie
superior, con el objetivo de reducir al máximo la presencia de oxígeno.
2.6.2 Medios de cultivo
Medio LB pH 7,2 + lactato (20 mM) y tiosulfato (50 mM). Los frascos se
incubaron en incubadora a temperatura de 30o C en condiciones estáticas
durante una semana, como mínimo.
Posteriormente:
- Se inoculó sobre medio LB sólido +lactato+tiosulfato (100 µL de cada cultivo
(SN y SI)) con el objetivo de aislar todos los representantes microbianos del
género, que estuviesen presentes. A cada colonia aislada se le realizaron pases
sucesivos, sobre medio agarizado, hasta obtener colonias aisladas. Después se
realizó su identificación mediante el sistema API 20NE.
-Cada colonia aislada fue inoculada sobre medio sólido M1; todas las placas se
incubaron en jarra de anaerobiosis. Una vez obtenidas las colonias se le siguió
dando pases sucesivos bajo esta condición de cultivo.
-Se tomó una alícuota del sobrenadante de cada cultivo de enriquecimiento
líquido (SN y SI) para determinar la concentración de hierro en solución
mediante lecturas en absorción atómica. Además, se tomaron muestras de los
precipitados de color negro para realizarles difracción de rayos X.
Medio M1
Está compuesto por Buffer fosfato pH 7,0 -PB), solución de elementos trazas
(MSS); solución de sales básicas ( BSS). Se le adiciona mezcla de aminoácido o
extracto de levadura o extracto de suelo. Fuente de carbono (lactato) y aceptor
de electrones (óxido de Fe(III)).
Se pesaron 0,95 g de oxido de hierro por cada frasco a utilizar. Se taparon con
tapón de algodón y se esterilizó en autoclave a 1210 C durante 15 minutos.
Posteriormente, se le adicionó medio de cultivo M1 estéril hasta la parte
superior del frasco. El volumen efectivo fue de 60 mL. Cada frasco se inoculó a
partir de las colonias aisladas bajo condición de anaerobiosis y, por último, se
cerraron herméticamente los frascos o ampolletas con la ayuda del sellador y las
tapas metálicas. Por último, se incubaron bajo condiciones estáticas durante
más de un mes. Posteriormente, se tomó una alícuota para observar bajo el
microscopio y determinar presencia y viabilidad bacteriana.
2.6.3 Caracterización molecular
Los aislados puros que cumplieron con los prerrequisitos anteriores, se enviaron
a caracterizar molecularmente por técnicas de hibridación de ADN y PCR para
comprobar su identificación.
2.7 Aislamiento y caracterización de representantes de la comunidad
bacteriana autótrofa
2.7.1 Bacterias oxidantes del azufre
10 g de suelo se adicionaron a 90 mL del medio de cultivo estéril OK y 1 g de
azufre elemental (pH 2,5). Los frascos se incubaron en agitación (150 rpm) a
30o C.
2.7.2 Bacterias oxidantes del hierro
10 g de suelo se adicionaron a 90 mL del medio de cultivo estéril 9K y solución
de sulfato ferroso (pH 2,5). Los frascos se incubaron en agitación (150 rpm) a
30o C .
2.8 Conservación de los cultivos
Se utilizó el método de conservación en congelación. Para lo cual 600 µL de
cultivos de una noche, se inocularon en 400 µL de solución de glicerol al 50 %
estéril, y por último se guardaron para su conservaron a – 20oC.
3. Resultados
3.1 . Aislamiento de los representantes de la comunidad microbiana
heterótrofa “convencional”
En la tabla 1 se muestran la concentración de
la
población
bacteriana
heterótrofa convencional presente en las dos muestras objeto de estudio en
este trabajo: suelo natural (SN) y suelo I (SI).
Tabla 1. Poblaciones bacterianas
Muestra
LB
SN
SI
Población bacteriana heterótrofa (UFC/mL)
LB+ES
Agar almidón
Agar sabouraud
2,2 x 105
0
2,5 x 105
2,0 x10
8,0 x 103
0
0
0
En la figura 1 se aprecia la diversidad bacteriana presente en el suelo natural.
Resultados similares se obtuvieron al inocular la misma muestra (SN) en el
medio de cultivo LB pero con adición de extracto de suelo. Al inocular la muestra
SI sobre los medios LB, LB+ES, Agar Almidón y Sabouraud glucosa sólo se
obtuvieron colonias en el medio LB+ES; el número de colonias fue mínimo
(Figura 3) en comparación con las obtenidas del suelo natural.
Figura 1. Población bacteriana heterótrofa presente
en el suelo natural (SN). Inóculo (100 µL),
medio nutritivo (LB), Temp. 30º C durante 48
horas.
Las características físicas y químicas del suelo natural fueron favorables para el
crecimiento de la microbiota heterótrofa y no así las del suelo impactado (Figura
2 y Figura 3), lo que evidencia carencia de materia orgánica en el SI lo que limita
el desarrollo de microorganismos heterótrofos.
El mantenimiento de las diversas poblaciones de microorganismos del
suelo es un prerrequisito para un suelo “saludable”.
Figura 2. Inóculo (100 µL) de la
disolución de la muestra SI, medio
nutritivo (LB), Temp. de 30o C durante
48 horas.
Figura 3. Representantes de la población
bacteriana heterótrofa del suelo impactado
(S I), inóculo: 100 µL de la disolución,
medio LB+ES, incubación a 30o C
durante 48 horas.
3.2 Caracterización de los representantes de la
comunidad microbiana
heterótrofa “convencional”
3.2.1 Pruebas fisiológicas y bioquímicas
Teniendo en cuenta la actividad de los microorganismos en el suelo, se
seleccionaron algunas pruebas para iniciar la caracterización de los aislados
(Tabla 1).
El 50 % del total de los aislados heterótrofos del suelo natural manifestaron
fenotípicamente el carácter de diazotrofía (fijación biológica del dinitrógeno),
lo que se evidenció por el crecimiento de las bacterias en los medios de cultivo
Ashby y/o Rojo Congo (Figura 4). A estos medios de cultivo no se le adicionó
fuente de nitrógeno. La diazotrofía es un carácter muy importante en las
bacterias del suelo. Ninguno de los dos aislados del SI mostró este carácter.
Por otro lado, se conoce que los microorganismos productores de sideróforos
juegan un papel muy importante en el suelo, ya que estos compuestos reducen
la población rizosférica de hongos y bacterias fitopatógenas (Buysens, y cols,
1996).
Ninguno de los aislados del SN ni del SI produjeron pigmento fluorescente al
cultivarlos sobre medio Agar King B, lo que evidencia la no producción de
sideróforos (Tabla 2). Este resultado pudiera estar en correspondencia con las
características químicas del suelo en estudio, ya que los sideróforos se
producen en ambientes con bajas concentraciones de hierro (Villegas y cols,
2002), aspecto que no cumplen las muestras analizadas en este trabajo. Esto
evidencia la interacción genotipo-fenotipo-medio ambiente.
Los microorganismos solubilizadores de P pueden constituir hasta el 40 % de las
poblaciones cultivables de los microorganismos del suelo. Estos juegan un papel
importante en la mineralización del Po del suelo y su contribución a la actividad
fosfatasa total del suelo es considerable (Richardson, 1994).
El fósforo inorgánico del suelo puede encontrarse como anión de fosfato que es
adsorbido por los constituyentes del propio suelo mediante asociaciones
relacionadas con las cargas; sales como óxidos de hierro y aluminio, silicatos de
aluminio y carbonatos de calcio; o dependiendo del pH, existen como
precipitados pobremente solubles de Ca-P en suelos alcalinos y Fe-P y Al-P en
suelos ácidos (Sanyal y De Datta, 1991). Estas formas precipitadas de P
incluyen un rango de mono-(Ca5(PO4)3OH y fluoro (Ca5(PO4)3F) apatitas y
además varias formas amorfas y cristalinas de Al-P y Fe-P que incluyen a la
berlinita (AlPO4).
El 25 % de los aislados del suelo natural expresaron capacidad de síntesis de
fosfatasa ácida (Tabla 2).
En las figuras 5A y 5B
se observa
el fenotipo
fosfatasa ácida positivo en los aislados ES3, ES5, ES6 y Es8a lo que se expresó
por la coloración verde del cultivo sobre el medio agar LB suplementado con
fenolftaleína difosfato y verde de metilo (Riccio y col, 1997).
Tabla 2. Pruebas fisiológicas y bioquímicas.
Aislados
T.Gram
Oxidasa
M.Ashby
Rojo
Congo
King B
(Pigmento
fluorescente)
citrato
Fosfatasa
ácida
Ca3(PO)2
Crec/acidez
LB1/SN
-
-
+
-
-
´+
-
+
Gluc y Lac.
(f) No gas
LB2/SN
LB3/SN
LB4/SN
LB5/SN
LB6/SN
LB7/SN
LB8/SN
LB9/SN
LB10/SN
LB11/SN
LB12/SN
ES1/SN
-
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
-
-
+
+
+
NI
NI
NI
´+
-
+++
NI
+++
-
+
+
+
NI
NI
NI
NI
NI
+
SI
SI
ES2/SN
ES3/SN
ES4/SN
ES5/SN
ES6SN
ES7/SN
ES8a/SN
ES9/SN
ES10/SN
ES11/SN
ES12/SN
ES1/SI
ES2/SI
-
NI
NI
+
-
+
+
+
+
+
+
-
+
+
+
+
+
+
-
-
´+
+
+
+
-
+++
+++
+++
+++
-
+
+
+
+
NI
NI
+
-
Leyenda: + (Crecimiento), +++ (expresión fenotipica de la fosfatasa ácida),
- (no crecimiento), NI (no inoculación).
Kligler
Gluc (f)
Gluc y Lac.
(f) No gas
NI
NI
Figura 4. Crecimiento sobre medio Rojo Congo. Incubación 30o C,
durante 24 -72 horas.
Figura 5. Determinación cualitativa de la actividad fosfatasa ácida. Medio LB
+ fenolftaleína di-fosfato (PDP) +Verde de metilo pH 7,2. Incubación 24 horas
a Temp. 30o C.
3.3 Aislamiento y caracterización de representantes de la comunidad
bacteriana del ciclo del hierro
3.3.1 Bacterias acidófilas
La acidofilia obligada es un carácter bien definido entre las bacterias pero no
está restringido a un grupo particular. En función de la fuente de carbono pueden
ser agrupadas en autótrofas y heterótrofas.
Teniendo en cuenta que uno de los caracteres para la clasificación fenética de
las bacterias es la ecología, en esta ocasión se seleccionó sólo el SI para definir
el carácter acidófilo de sus representantes. El pH del SN no se encuentra en un
rango ácido.
En las figura 6 se muestran los cultivos de enriquecimiento de bacterias
heterótrofas acidófilas del suelo impactado. En los tres medios de cultivo
selectivos se observan cambios físico-químicos. Se empleó como fuente de
carbono glicerol o glucosa; por tal motivo aseveramos la presencia de bacterias
heterotrofas y como el pH de los medios se ajustó entre 2,5 y 3,0, se demuestra
el carácter acidófilo de los cultivos.
Al incubar con agitación (Figura 6A y Figura 6B) y anaerobiosis (Figura 6C), se
produjeron cambios de coloración de transparente (medio sin inocular-no
mostrado) a tonalidades de ámbar a ámbar rojizo (Figura 6A y Figura 6B).
También se aprecia la formación de una biopelícula o precipitado de color negro
cuando la muestra se incubó en ausencia de oxígeno (Figura 6C).
Estos
cambios
evidencian
la
presencia
de
bacterias
heterótrofas
acidófilas: oxidadoras (Figuras 6A y 6B) y reductoras (Figura 6C) de hierro
en el suelo impactado.
En los procesos de oxidación de sulfuros, como pirita y calcopirita, se forman
jarositas que son precipitados insolubles de sulfatos de hierro hidratados (figura
6A). A diferencia, del frasco correspondiente a la figura 6C (condiciones de
anaerobiosis) donde no se aprecia la formación de estos compuestos insolubles
de hierro (III) en la pared del frasco. En este caso, además del cambio de
coloración del medio líquido también se aprecia un precipitado de color negro
sobre la muestra sólida residual. De este precipitado se podría inferir la
formación de un sulfuro de hierro por la acción combinada de bacterias acidófilas
reductoras de hierro y reductoras de sulfato.
El hierro ferroso se encuentra en bajas concentraciones en la biosfera y los
compuestos que contienen hierro férrico, específicamente óxidos insolubles e
hidróxidos, son más abundantes aunque el hierro ferroso puede generarse por la
acción de los microorganismos en zonas anaeróbicas (Figura 6C).
Algunas bacterias heterótrofas acidófilas poseen la capacidad de reducir hierro
férrico (Figura 6C). Entre estas se citan a Acidiphilium organovorum, A. cryptum
y A. ferrireductans (SHJ) (Jonhnson y Mc Ginness, 1991, Johnson, 1995).
A.ferrireductans posee un sistema reductor de hierro constitutivo pero es
también capaz de oxidar hierro ferroso bajo condiciones de aerobiosis (Bridge y
Johnson, 1995).
Biopelícula
Actividad
bacteriana
Biooxidación del Fe (II)
Biorreducción de
Fe (III) y sulfato
A
B
C
Figura 6. Cultivo de enriquecimiento de microorganismos acidófilos al adicionar 5
g de suelo impactado (SI) en tres medios de cultivos diferentes:
A: (sulfato ferroso /glicerol/Extracto de levadura 0,02%, pH 3,0 /aerobiosis)
B : Medio Harrison: Glucosa/extracto de levadura/aerobiosis
C: (sulfato férrico/glicerol/Extracto de levadura 0,02%, pH2,5/anaerobiosis).
Temperatura 30o C. Aerobiosis: agitación 150 rpm
Anaerobiosis: Llenado total del frasco con medio de cultivo, cierre hermético y no
agitación.
Posteriormente, se procedió al aislamiento y purificación de los representantes
microbianos presentes en los cultivos de enriquecimiento del SI (Figuras 7 y 8).
Después, se realizaron preparaciones en fresco de los diferentes cultivos de las
placas multipocillo. Estos se observaron bajo el microscopio de contraste de
fase. En todos los cultivos se observaron células con diferentes morfologías,
como cilindros, espirilos, vibrios, esféricas y algunos bacilos con estructuras
refringentes en uno de los extremos de la célula. En todos los casos las células
presentaron motilidad.
Los resultados de las Figuras 9 y 10 (FEG y SEM) demuestran la presencia de
una comunidad bacteriana heterótrofa, acidófila, reductora de hierro (III) en el
suelo impactado en correspondencia con las características física-química de la
muestra.
CE: cultivo de
enriquecimiento de
BRFe (SI) en medio con
Glicerol / sulfato férrico
S
S
F
F
Figura 7. Aislamiento de bacterias heterótrofas
acidófilas por diluciones seriadas (1 mL de cultivo de
enriquecimiento de BRFe (III) en 2 mL de medio CBM.
Incubación Temp. 30o C durante 8 días.
S: la alícuota para las diluciones se tomó de la
superficie.
F: la alícuota para las diluciones se tomó de la
superficie.
Figura 8. Aislamiento de bacterias heterótrofas
acidófilas mediante diluciones seriadas (1mL del
cultivo de enriquecimiento de BRFe (III) en 2 mL de
medio Harrison). Incubación a. 30o C durante 8 días.
S: la alícuota para las diluciones se tomó de la
superficie.
F: la alícuota para las diluciones se tomó de la
superficie.
presente en el suelo impactado (SI) al enriquecerla en medio de cultivo selectivo
para bacterias En las que en el suelo impactado existe Del cultivo de
enriquecimiento del SI que fue incubado bajo condiciones de anaerobiosis
(Figura 6C) se tomó una alícuota y se procedió con la metodología para obtener
preparaciones para observarlas al microscopio electrónico, a continuación una
representación de las células observadas.
Element
OK
Mg K
Al K
Si K
PK
SK
KK
Fe K
Cu K
Zn K
As L
Pb M
Totals
App
Conc.
29.96
0.21
1.40
8.42
2.11
4.48
0.59
131.70
1.90
13.27
0.08
0.76
Intensity
Corrn.
1.1272
0.3686
0.4834
0.6044
0.9376
0.7719
1.0728
0.9577
0.8442
0.8589
0.5599
0.7357
Weight%
12.72
0.28
1.39
6.66
1.08
2.78
0.26
65.79
1.08
7.39
0.07
0.50
Weight%
Sigma
0.15
0.06
0.05
0.08
0.05
0.06
0.03
0.25
0.11
0.17
0.10
0.15
Atomic%
31.36
0.45
2.03
9.36
1.37
3.42
0.27
46.48
0.67
4.46
0.04
0.09
100.00
Figura 9. Espectro (FEG) del cultivo de enriquecimiento del SI (5 g) en medio glicerol (10 mM),
sulfato férrico (25 mM, pH 2,5). Llenado del frasco con medio de cultivo hasta el tope o parte
superior. Incubación en condiciones estáticas.
A
B
C
Figura 10. Microfotografías de representantes bacterianos de bacterias heterótrofas
acidófilas del ciclo del hierro. Cultivo de enriquecimiento del SI (5 g) en medio glicerol
(1 0mM), sulfato férrico (25 mM), pH 2,5. Llenado del frasco con medio de cultivo hasta
el tope o parte superior. Incubación en condiciones estáticas.
3.3.2 Bacterias neutrofilas. Enriquecimiento de representantes del género
Shewanellae (BRFe)
Shewanellae, como grupo bacteriano, ha sido considerado como un sistema
modelo excelente para el estudio de la biorremediación de los metales toxicos.
Su capacidad para reducir U (VI) a U (IV) insoluble y Cr (VI) a Cr (III) insoluble
ha dado a este grupo un gran protagonismo en sistemas contaminados, donde la
adición de nutrientes y la adición de microorganismos podrían ser utilizadas para
la inmovilización in situ de elementos tóxicos. En la figura 11 se visualiza la
formación de pirita a causa de la acción de la comunidad bacteriana reductora
de Fe (III) presente tanto en el suelo natural (Figura 11A) como en el suelo
impactado (Figura 11B). Visualmente, el precipitado fue mayor en el frasco del
suelo impactado (B).
A
Figura 11 . Cultivo de enriquecimiento de la población bacteriana FeR obtenida de la
inoculación de SN (frasco A) y SI (frasco B) a los 8 días de incubación en condiciones
estáticas. Medio LB+lactato + tiosulfato. Temperatura 30o C
B
Entre las características distintivas del género Shewanellae se citan:
-
Metabolizar el lactato como fuente de carbono vía respiración anaerobia
utilizando como aceptor de electrones tiosulfato, nitrato o/y óxidos de
metales. Este aspecto se demuestra en la Figura 11, lo que se puso de
manifiesto con ambas muestras analizadas.
-
Metabolismo anaerobio. Este aspecto también se demostró al cultivar los
aislados sospechosos de BRFE,
posible Shewanellae, bajo condición
anaerobia.
-
La producción de H2S durante el crecimiento anaeróbico en presencia de
tiosulfato.
Esta
característica
también
se
puso
de
manifiesto
inmediatamente al destapar los cultivos de enriquecimientos de SN y SI.
El mayor desprendimiento de este gas ocurrió en la muestra de suelo
impactado, así como la mayor cantidad de precipitado (sulfuro de hierro)
(Figura 11B). Esto podría deberse a que la concentración de hierro en el
suelo impactado es casi (25 %) tres veces superior a la del suelo natural
(9 %).
Por otro lado, la concentración de
hierro en disolución, en los cultivos
enriquecidos, se determinó mediante lecturas en Absorción Atómica y se
constató que el cultivo de SN presentó 0,8 ppm mientras que el SI fue de
105,5 ppm. De estos datos, se infiere que hubo mayor actividad reductora de
Fe(III) en la muestra de SI.
En la Figura 12 se muestra el análisis del cultivo SI por FEG.
Element
OK
Na K
Al K
Si K
SK
Ca K
Fe K
Totals
App
Conc.
44.32
0.65
0.20
1.65
17.12
1.32
69.21
Intensity
Corrn.
1.0614
0.4118
0.5472
0.6771
0.8583
1.0266
0.9054
Weight%
29.04
1.09
0.26
1.70
13.87
0.89
53.15
Weight%
Sigma
0.26
0.13
0.07
0.07
0.13
0.05
0.25
Atomic%
54.36
1.42
0.29
1.81
12.95
0.67
28.50
100.00
Figura 12 . Espectro (FEG) del cultivo de enriquecimiento del SI (5 g) en medio glicerol
(10 mM), sulfato férrico (25 mM), pH 2,5. Llenado del frasco con medio de cultivo hasta
el tope o parte superior. Incubación en condiciones estáticas.
3.3.3 Análisis de difracción de rayos X
Se tomaron de los cultivos de enriquecimientos (suelo impactado y del suelo
natural) los precipitados formados por la actividad bacteriana reductora de
hierro (III) presente en las muestras bajo análisis. En las figuras 13 y 14 se
muestran los difractogramas obtenidos. En el del primer caso (SI) se observaron
bandas correspondientes a las fases: sílice, clorita y sulfuro de cobre (II)
C o unts
300
je s us -1
200
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
P o s itio n [°2 The ta ]
Figura 13. Difractograma de rayos X correspondiente al precipitado producido por el
crecimiento de microorganismos reductores del hierro sobre el suelo impactado por el
vertido de residuos
En el caso del cultivo de enriquecimiento del suelo se observan las bandas
correspondientes a: sílice, calcita, sulfuro de cobre (II) y algo de óxido férrico.
Las bacterias mesófilas que respiran Fe(III) pertenecientes a la subclase
Gamma Proteobacteria, utilizan Fe (III) y O2 como aceptores finales de
electrones. Entre estos se citan a los géneros Shewanellae, Ferrimonas y
Aeromonas. Utilizan H2 y sólo un rango muy limitado de ácidos orgánicos
(lactato y piruvato) como dadores de electrones para reducir Fe(III) y Mn (IV).
Counts
jesus-2
200
100
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Position [°2Theta]
Figura 14. Difractograma de rayos X correspondiente al precipitado producido por el
crecimiento de microorganismos reductores del hierro sobre el suelo natural
Las microfotografias que se muestran a continuación (Figuras 15 a 17)
evidencian la presencia de bacterias reductoras de hierro correspondientes al
género Shewanella. Esto se afirma teniendo en cuenta que tanto los cultivos de
enriquecimiento como los cultivos puros aislados de SN y SI crecieron bajo las
condiciones
selectivas
del
género
Shewanellae.
Estos
cultivos
fueron
codificados como BRFe y un número consecutivo más las iniciales del suelo (SN
o SI). Una de las características más distintivas fue la formación del producto
maloliente H2S, debido al metabolismo del tiosulfato adicionado al medio; éste
fue reducido por la acción microbiana observándose el desprendimiento del
citado gas que produjo el olor y burbujeo característico al destapar el frasco.
Otra prueba fue la formación de sulfuros de hierro (Figuras 11A y 11B) por el
metabolismo del lactato y tiosulfato. Por último, el crecimiento bacteriano se
produjo sobre medio M1 con óxido de hierro reactivo como aceptor final de
electrones.
Otra característica distintiva del género es la presencia de flagelos y pilis; en las
microfotografías obtenidas a partir de colonias puras, se aprecia la presencia de
flagelos (Figura 17) y la morfología cilíndrica de los cultivos. Ante la tinción de
Gram respondieron de forma negativa.
A
B
C
D
E
Figura 15. Microfotografias de representantes microbianos del SI proveniente
del cultivo de enriquecimiento obtenido de la adición de SI en medio
LB+lactato + tiosulfato. Temperatura de 30o C a los 8 días de incubación en
condiciones estáticas.
F
Figura 16. Microfotografias de representantes microbianos del cultivo sobre medio
agar M1, temperatura 30o C a los 8 días de incubación. Inóculo (pirita formada en el
fondo del cultivo de enriquecimiento del SI en medio LB+lactato + tiosulfato).
Flagelos
Figura 17. Microfotografia al FEG de una colonia aislada de
posible Shewanellae, obtenida en medio agar M1 (lactato y
tiosulfato). Incubada en jarra de anaerobiosis, Temperatura de 30º
C durante 6 días.
3.1 Enriquecimiento de bacterias autótrofas acidófilas
Las dos muestras de suelos bajo estudio fueron adicionadas a medio 0 K con
azufre como fuente energética. En el frasco donde se adicionó SN (Figura 18) no
se aprecia cambio de coloración del medio; dicha coloración es marrón como
consecuencia de la dispersión de la muestra en el medio líquido. Mientras que
en el cultivo de la muestra de SI se infiere la presencia de bacterias oxidantes
de hierro(II) y azufre. Esto se constató por la disminución del pH del medio de
cultivo y la formación de jarositas adheridas a las paredes del frasco que
contenía los cultivos.
Sin inocular
SN
SI
Figura 18. SN y SI en medio 0 K. Agitación de 150
rpm a 30º C, durante dos meses de incubación.
4. Conclusiones
1.- Se aislaron,
conservaron
y caracterizaron
25 cultivos bacterianos
heterótrofos mesófilos del suelo natural y dos cultivos del suelo impactado
(SI). La biota bacteriana del suelo natural es heterogénea y presenta una
alta incidencia de bacterias transformadora de la materia orgánica; aspecto
que es mínimo en el suelo impactado.
2.- En ambos suelos se detectó la presencia de bacterias heterótrofas
reductoras de hierro.
3. También se detectó la presencia de una comunidad microbiana
heterotrofa reductora de hierro en el suelo impactado, tanto acidófila como
neutrófila.
4.- Hubo formación biogénica de sulfuro de hierro por la actividad
bacteriana anaeróbica del ciclo del hierro.
5.- Se demostró la interacción ambiente-genotipo y la
incidencia de la
actividad antropogénica en los ecosistemas microbianos analizados.
Referencias
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tailings spoil at the Sao Domingos former copper mine. Proceedings of the 16th
International Biohydrometallurgy Symposium. Editors: STI. Harrison, De
Rawlings and J. Petersen. ISBN: 1-920051-17-1.
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pyochelin and pyoverdin in suppression of Pythium induced damping off of
tomato by Pseudomonas aeruginosa 7NSK2 . Appl Environ Microbiol. 62: 865871
- Díaz de Villegas, M. E., Villa, P., Frías, A. 2002. Evaluación de la producción de
sideróforos por Pseudomonas aeruginosa PSS. Rev. Latinoam. Microbiol. Vol.
44 No. 3-4, pp.112-117.
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that share their habitat. Annu. Rev. Microbiol. 38, 265-292.
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biorremediation of acidic mine effluents. Int. Biodeter. Biodegrad, 41-58.
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medium for growing mesophilic and moderately thermophilic, iron-oxidizing,
acidophilic bacteria. J. MIcrobiol. Methods 13, 113-122.
- Riccio, M.L., Rossolini, G.M., Lombardi, G., Chiesurin, A, y Satta, G (1997).
Expression cloning of different bacterial phosphatase-encoding genes by
histochemical screening of genomic libraries onto an indicator medium containing
phenolphthalein diphosphate and methyil green. J.Appl. Bacteriol, 82:117-185.
- Richardson, A.E. 1994. S microorganisms and phospohorous avaliability. In
“Soil biota management in sustainable farming systems. Eds CE Pankhurst, BM
Doube. VVSR Gupta and PR Grace. Pp. 50-62. ( CSIRO Publishing Melbourne).
-Sanyal, S.K., De Datta, S.K. 1991. Chemistry of phosphorus transformations in
soil. Advances in Soil Science 16: 1-120.
- Sambrook, J.; Fritsch, E.F and Manniatis, T. (1989).
Molecular cloning: a
laboratory manual. 2nd ed .Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor,
N.Y.. Cold