GUIA DE VALIDACION DE METODOS PARA EL ANALISIS DE

DIRECCIÒN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Clave: GVMM
Revisión: 00
Fecha de emisión: 03/2015
Página 1 de 10
GUIA DE VALIDACION DE METODOS PARA EL ANALISIS DE
MICROORGANISMOS PATÓGENOS EN PRODUCTOS
VEGETALES
DIRECCIÒN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Clave: GVMM
Revisión: 00
Fecha de emisión: 03/2015
Página 2 de 10
DIRECTORIO
MVZ Enrique Sánchez Cruz
Director en Jefe del Servicio Nacional de Sanidad, Inocuidad y Calidad Agroalimentaria
MVZ. Hugo Fragoso Sánchez
Director General de Inocuidad Agroalimentaria, Acuícola y Pesquera
QA Mayrén Cristina Zamora Nava
Directora del Centro Nacional de Referencia de Plaguicidas y Contaminantes
MVZ Linda Coatlicue García López
Subdirectora de Diagnóstico y Detección de Organismos Patógenos
LAE Daniel González Ávila
Subdirector de Monitoreo y Evaluación de Calidad
MC María Felipa López Durán
Coordinadora del Laboratorio Central
Tecámac, Edo. De México, marzo de 2015
DIRECCIÒN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Clave: GVMM
Revisión: 00
Fecha de emisión: 03/2015
Página 3 de 10
CONTENIDO
1. PROPOSITO
4
2. ALCANCE
4
3. REFERENCIAS
4
4. DESARROLLO
4.1 SELECCIÒN DEL METODO
4.2 ESTABLECIMIENTO DEL PROTOCOLO
4.3 TABLA DE CONTINGENCIAS
4.4 EVALUACIÒN DEL DESEMPEÑO DE METODOS
4.4.1 LIMITE DE DETECCION
4.4.2 REPETIBILIDAD
4.4.3 REPRODUCIBILIDAD
4.4.4 EFICACIA RELATIVA
4.4.5 ESPECIFICIDAD RELATIVA
4.4.6 SENSIBILIDAD RELATIVA
4.4.7 RECUPERACIÓN
4.4.8 ROBUSTEZ
4.4.9 INFORME DE RESULTADOS
4
4
5
7
7
7
7
7
8
8
8
8
8
9
5
ANEXOS
DIRECCIÒN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Clave: GVMM
Revisión: 00
Fecha de emisión: 03/2015
Página 4 de 10
1. PROPÓSITO.
Establecer los lineamientos y criterios para la evaluación del desempeño de métodos aplicados en LDDOP aportando
evidencia objetiva que permita establecer la veracidad de los resultados particulares para su uso.
2. ALCANCE.
El presente documento aplica para el área técnica del Laboratorio de Diagnóstico para la Detección de Organismos
Patógenos (LDDOP)
3. REFERENCIAS
NMX-EC-17025-IMNC-2006 “Requisitos generales para la competencia de los laboratorios de ensayo y de
calibración”.
CRITERIOS DE APLICACIÓN DE LA NORMA NMX-EC-17025-IMNC-2006 / ISO/IEC 17025:2005
UNE-EN ISO 16140 Microbiología de los alimentos para consume humano y animal – Protocolo de Validación de
métodos alternativos.(ISO 16140:2003)
4. DESARROLLO
4.1 Selección del método
Para validar un método, en necesario considerar si el tipo de Método es normalizado o No Normalizado con la
finalidad de establecer los parámetros correspondientes.
4.1.1 Método Normalizado
Se consideran métodos o procedimientos normalizados, aquellos publicados en Normas Oficiales Mexicanas (NOM),
Normas Mexicanas (NMX) ó los emitidos por organizaciones de normalización, extranjeras, regionales e
internacionales; todas reconocidas, tales como FDA, USDA, ISO, EN, ASTM, AOAC, EPA, USP, Estándar Methods,
etc.
Para métodos o procedimientos normalizados el laboratorio debe realizar y presentar evidencia objetiva de la
confirmación del método para demostrar que cumple las especificaciones del mismo y cuenta con la competencia
técnica para realizarlo adecuadamente, tomando en consideración sus propias instalaciones, equipo y personal.
La confirmación del método debe realizarse de acuerdo a lo siguiente:





Repetibilidad.
Reproducibilidad.
Eficacia Relativa.
Especificidad Relativa
Sensibilidad Relativa
4.1.2 Método no Normalizado
Los métodos no normalizados, propios o desarrollados por el laboratorio, los métodos obtenidos de publicaciones
científicas, así como los métodos normalizados modificados o ampliados o usados fuera de su alcance propuesto el
laboratorio debe realizar y presentar evidencia objetiva de la validación del método, para evaluar estos parámetros se
requiere un número mayor de muestras.
DIRECCIÒN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Clave: GVMM
Revisión: 00
Fecha de emisión: 03/2015
Página 5 de 10








Límite de detección.
Repetibilidad.
Reproducibilidad.
Eficacia Relativa.
Especificidad Relativa / Exclusividad
Sensibilidad Relativa / Inclusividad
Recuperación
Robustez
4.2 Establecimiento del Protocolo
Antes de iniciar con la validación de un método, es necesario contar con el “Protocolo de Validación”
correspondiente al método a validar. Para ello, es necesario realizar lo siguiente:
Nota: Durante la ejecución del protocolo de validación se deberán documentar todas las actividades realizadas junto
con los resultados obtenidos.
4.2.1 Pruebas preliminares
Las pruebas preliminares se realizan para asegurar que no existe algún factor que no permita la detección del
organismo de interés por el método empleado, se pueden realizar pruebas preliminares para determinar:



El efecto o interferencia de la matriz sobre el método
Evaluar reactivos que van a ser utilizados
La preparación de laS muestras, etc.
Estas pruebas se registraran en el formato correspondiente.
4.2.2 Selección de matriz
Los criterios de selección de matriz para la evaluación del desempeño del método, se basan en:








Alertas / Notificaciones
Vinculación epidemiológica entre la matriz y el organismo diana.
Programas de Monitoreo y Vigilancia
Petición explicita del cliente
Idoneidad y disponibilidad de la matriz.
Categorías de matrices (Ver Anexo).
Registro histórico de muestras analizadas
Otras
4.2.4 Preparación del inoculo
Para realizar las diluciones que se van a emplear para inocular las muestras se siguen las indicaciones de trabajo
para diluciones bacterianas del laboratorio, tomando en cuenta las organismos Diana / Blanco y No Diana / Blanco.
Microorganismo diana. El nivel de inoculo debe ser de 10 a 100 veces mayor que el nivel de detección relativo
mínimo del método y debe emplearse el protocolo completo del método y cuando se obtengan resultados falsos
negativos o dudosos, la cepa debe ser analizada otra vez con el método de referencia.
Microorganismo no diana. El nivel de inoculo de cepas debe ser mayor al nivel del microorganismo diana (10 veces
más), mínimo 1 microorganismo no diana por ensayo.
DIRECCIÒN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Clave: GVMM
Revisión: 00
Fecha de emisión: 03/2015
Página 6 de 10
Tabla 1. Criterios generales para la validación de métodos cualitativos.
Criterios
Nivel 1
Nivel 2
Número de microorganismos
10 (20 para Salmonella)
30 cepas
1, 2
diana (inclusividad)
Número de microorganismos
10 cepas
20 cepas
3
no diana (exclusividad)
Número de alimentos
1 o más
1 o más
el nivel usualmente
Niveles de inoculación / matriz encontrado en la matriz / 3 1 inoculado y 1 sin inocular
5
- 5 niveles
Número de repeticiones de
20 cepas
20 cepas
cada nivel
Adición de cepas competitivas
Microflora natural presente
Comparación con método de
Si
Si
referencia
1
Cuando no sea posible cumplir con los criterios de inclusividad/exclusividad, el laboratorio podrán utilizar las cepas disponibles, o trabajar en
colaboración con otro laboratorio; siempre que el material sea de una fuente trazable y documentada.
2
La elección de cepas de inclusividad deberá considerar la relevancia genética, grupos serológicos, diversidad bioquímica, virulencia, frecuencia de
ocurrencia, etc., del organismo diana o blanco. (Consultar apéndice 3, Guidelines for the Validation of Analytical Methods for the Detection of
Microbial Pathogens in Foods).
3
La elección de cepas de exclusividad debe basarse en la estrecha relación del organismo diana o blanco con organismos que potencialmente
puedan presentar una reacción cruzada, por presentar características similares de virulencia, frecuencia de ocurrencia, etc. (Consultar apéndice 3,
Guidelines for the Validation of Analytical Methods for the Detection of Microbial Pathogens in Foods).
4
Para la validación de métodos moleculares, los criterios de inclusividad y exclusividad deben considerar adicionalmente la cantidad de templado,
el uso de células bacterianas, purificación de ácidos nucleicos, la comparación previa de los primers, sondas o secuencias con bases de datos
genómicas. Adicionalmente, se debe incluir el uso de cepas control positivo y negativo, así como el control interno de reacción para PCR en tiempo
real.
5
Primer nivel: Deberá ser el control negativo; segundo nivel: el nivel teórico de detección; tercer nivel: deberá ser un nivel de detección por arriba
del nivel teórico; cuarto y quinto nivel: Deberán ser mayores que el nivel de detección anterior.
4.2.3 Preparación de la muestra
La preparación de la muestra debe considerar la microflora natural presente en la matriz, la cual se determinará
mediante el conteo de mesófilos aerobios (APC) para verificar la microflora fondo.
Cuando no sea posible asegurar la presencia del microorganismos diana en la matriz vegetal, se procederá a la
inoculación artificial, conforme al punto 4.2.4 y 4.2.5
Registrar la muestra en el formato de inoculación de muestras del laboratorio, con la siguiente información







Identificación de la muestra
Cantidad de la muestra.
Concentración de Inoculo de organismo Diana
Concentración de Inoculo de organismos No Diana
Método de preparación de la muestra
Tamaño de la muestras
Estado de maduración de la matriz
4.2.5 Inoculación de muestras
Considerando que las matrices vegetales frescos, no presentan una distribución uniforme de contaminación
microbiológica, se pueda presentar una inhibición propia de la matriz, un estrés microbiano, o una lesión de los
microorganismos, será necesario realizar una contaminación artificial con el organismo diana, y en su caso la inclusión
de microflora competitiva.
DIRECCIÒN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Clave: GVMM
Revisión: 00
Fecha de emisión: 03/2015
Página 7 de 10
La inoculación de las muestras se realiza en condiciones asépticas, preferentemente dentro de una cabina de
seguridad biológica.
Para realizar la inoculación de las muestras se deberá emplear material de referencia, si está disponible o material
verificado en las instalaciones del LDDOP, presentando certificado de calidad y/o informe de verificación.
La inoculación artificial debe asegurar la uniformidad de la contaminación en la matriz, que permita la recuperación del
microorganismo en la porción de la matriz utilizada.
4.3 Tabla de contingencias
Al tratarse de pruebas cualitativas los resultados se dan en dos categorías, Positivo/Negativo y se establece una
tabla de comparación respecto con el valor esperado y el valor obtenido por lo de esta forma se pueden ingresan los
datos en una tabla de resultados de validación, donde se realice la captura y análisis de resultados.
Respuesta
Resultado Positivo
Resultado Negativo
Tabla de contingencias
Muestra inoculada
Verdadero positivo (VP)
Falso negativo (FN)
Muestra no inoculada
Falso Positivo (FP)
Verdadero Negativo (VN)
4.4 Evaluación del desempeño de métodos.
Proceso que se realizara en el laboratorio para demostrar que un método produce consistentemente resultados
confiables en las condiciones particulares del laboratorio evaluando los siguientes aspectos:
4.4.1 Limite de detección
Demostrar la concentración más baja en la que el método es capaz de recuperar al microorganismo de las muestras
inoculadas con un nivel bajo de inoculo (menor a 5 UFC´s).
LD= VP x 100
Ni
Dónde:
VP= Resultados Positivos de muestras con inoculación baja
Ni = Muestras inoculadas (menos a 5 UFC´s)
Criterio de aceptación: Mayor o igual 50%.
4.4.2 Repetibilidad (R)
Grado de concordancia entre resultados sucesivos e independientes obtenidos por el mismo método empleando un
material idéntico bajo las mismas condiciones (aparatos, operadores, laboratorio e intervalos de tiempos cortos, es
decir condiciones de repetibilidad)
R= N x 100
VP
Criterio de aceptación: Mayor o igual a 90%.
4.4.3 Reproducibilidad
Grado de concordancia entre resultados de análisis individuales en materia de análisis idéntico empleando el mismo
método y obtenido por operadores en diferentes laboratorios empleando equipos diferentes (es decir unas condiciones
de reproducibilidad)
DIRECCIÒN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Clave: GVMM
Revisión: 00
Fecha de emisión: 03/2015
Página 8 de 10
El análisis es realizado por al menos dos personas y se evalúan los criterios de Eficacia Relativa, Especificidad
Relativa y Sensibilidad Relativa de forma independiente.
Criterio de aceptación: Mayor igual al 95% de eficacia relativa por cada analista
4.4.4 Eficacia Relativa (ER)
Grado de correspondencia entre la respuesta obtenida por el método con las muestras inoculadas y las que no están
inoculadas
ER= VP+VN x 100
N
Criterio de aceptación: Mayor igual a 95%
4.4.5 Especificidad Relativa (ES) / Exclusividad
Capacidad del método para distinguir el analito blanco u organismo diana, de otros organismos similares, pero
genéticamente distintos o no blancos, es decir la capacidad de no detectar el analito cuando no está presente en la
muestra.
ES = VN x 100
Ns
Criterio de aceptación: Mayor igual al 95%
4.4.6 Sensibilidad Relativa (SR) / Inclusividad
Capacidad del método para detectar el analito cuando se encuentra presente, en una amplia gama de
microorganismos no diana. Por ejemplo: clasificación taxonómica, composición inmunológica, genética, etc.
SR = VP x100
Ni
Criterio de aceptación: Mayor igual al 95%
4.4.7 Recuperación (Re)
Determina la fracción del analito adicionado a la muestra (Fortificada) antes del análisis que es recuperado con la
prueba
%Re= VP x 100
Ni
Criterio de aceptación: Mayor igual al 95%
N= Número total de muestras
Ni= Número de muestras inoculadas
Ns= Número de muestras sin inocular
4.4.8 Robustez
La robustez es una medida de la capacidad de un procedimiento analítico de no ser afectado por variaciones
deliberadas de los parámetros del método; proporciona una indicación de la fiabilidad del procedimiento en un uso
DIRECCIÒN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Clave: GVMM
Revisión: 00
Fecha de emisión: 03/2015
Página 9 de 10
normal. En este sentido el objetivo de la prueba de robustez es optimizar el método analítico desarrollado o
implementado por el laboratorio, y describir bajo qué condiciones analíticas (incluidas sus tolerancias), se pueden
obtener resultados confiables.
Un método de ensayo es más robusto entre menos se vean afectados sus resultados frente a una modificación de las
condiciones analíticas.
Entre las condiciones analíticas que podrían afectar a un método se encuentran:
· Analistas
· Equipos
· Reactivos
· pH
· Temperatura.
· Tiempo de reacción.
· Matriz.
· Otros.
Para realizar en análisis de robustez se aplica el test de Youden y Steiner aplicado de la siguiente forma:
Prueba de Robustez de Younden y Steiner
Letra
A/a
B/b
…
Descripción
Condición 1
Condición 2
…
Valor Nominal
X
Y
…
Valor Alto
A
B
…
Valor Bajo
a
b
…
Se deben establecer las comparaciones posibles, es decir las diferencias entre la variable de alto valor contra la de
valor bajo:
(A – a), (B – b), (C – c), (D – d), (E – e), (F – f) y (G – g)
Condición
A/a
B/b
C/c
…
Resultados
1
A
B
C
…
2
A
B
c
…
3
A
B
C
…
4
A
b
c
…
5
a
B
C
…
6
a
b
c
…
7
a
b
C
…
8
a
b
c
…
Donde los resultados obtenidos se reportan como presencia (1) o ausencia (0)
Para las variables A y a:
Donde el promedio de A se calcula: (A+A+A+A) = X
4
Donde el promedio de a se calcula: (a+a+a+a) = X
4
4.4.9 Informe de resultados
El método estadístico utilizado para la evaluación del método se deberá incluir en el informe de resultados, así
como la eliminación de resultados aberrantes, tales como:
 Controles negativos (sin inocular) que arrojen un resultado positivo, son indicadores de un error del
laboratorio/operador.
 Evidencia de no homogeneidad o uniformidad del material inoculado.
DIRECCIÒN GENERAL DE INOCUIDAD AGROALIMENTARIA, ACUÍCOLA Y PESQUERA
CENTRO NACIONAL DE REFERENCIA DE PLAGUICIDAS Y CONTAMINATES
VALIDACIÓN DE MÉTODOS MICROBIOLÓGICOS
Clave: GVMM
Revisión: 00
Fecha de emisión: 03/2015
Página 10 de 10

Valores atípicos
Las actividades realizadas así como los resultados obtenidos se describirán en un informe de validación anexando
la evidencia que lo respalde.
5. ANEXOS
5.1 CATEGORIAS DE MATRICES
•
FRUTAS
Bayas y otras frutas pequeñas
(Ej. fresas, zarzamora, uva)
Frutas de hueso (Ej. durazno)
Frutas pomáceas (Ej. manzana)
Frutas tropicales y subtropicales variadas
(de piel comestible) (Ej. higo)
Frutas tropicales y subtropicales variadas
(de piel no comestible) (Ej. papaya)
Frutos cítricos (Ej. naranja)
•
•
HIERBAS AROMATICASY ESPECIAS
Especias (Ej. tomillo
Hierbas aromáticas (Ej. epazote
•
•
•
•
•
HORTALIZAS
•
Brasicáceas (Ej. brócoli)
•
•
De Bulbo (Ej. cebollin)
Cucurbitáceas (Ej. calabaza)
•
De fruto (Ej. tomate, chile)
•
De hojas verdes (Ej. espinaca, lechuga)
•
•
De tallo (Ej. apio)
Leguminosas (Ej. ejote)
OTROS
•
•
Setas
Brotes de semilla (Ej. Germen de alfalafa)
•
•
SUPERFICIES DE CONTACTO
(Vivas e inertes)
Hisopo
Esponja
AGUA
•
•
Agua de Riego en producción primaria
Agua potable proceso de empaque