Degradación de proteína

MÉTODO ENZIMÁTICO PARA PREDECIR LA DEGRADACIÓN
DE LAS PROTEÍNAS
Í
EN EL RUMEN
Dr. Alejandro Velásquez Briceño
Octubre de 2012
INTRODUCCIÓN
EFECTOS DE LA DINÁMICA DE DEGRADACIÓN
DE LAS PROTEÍNAS DE LA DIETA
EN EL RUMEN
DESCRIPCIÓN DEL PROBLEMA
LIMITACIONES DE LAS METODOLOGÍAS PARA
MEDIR LA DEGRADACIÓN DE PROTEÍNAS
EN EL RUMEN
ALIMENTACIÓN
ANIMAL
EFICIENCIA
SINCRONÍA Energía/Nitrógeno
RUMINAL
DINÁMICA DE DEGRADACIÓN DE
LAS PROTEÍNAS DE LA DIETA
EN EL RUMEN
Salud
ruminal
Degradación de la
materia orgánica
DINÁMICA DE DEGRADACIÓN DE
LAS PROTEÍNAS DE LA DIETA
EN EL RUMEN
Proteína
Metabolizable
Metabolismo del
N en el animal
Excreción de N-compuestos
al medio ambiente
MEDICIÓN DE LA DEGRADACIÓN DE LAS PROTEÍNAS
Residuo de proteína
no degradada
Productos de la
hidrólisis
PRINCIPALES LIMITACIONES DE LAS METODOLOGÍAS PARA
PREDECIR LA DEGRADABILIDAD DE PROTEÍNAS EN EL RUMEN
Protocolos
P
t
l
complejos
Animales
A
i l
fistulados
Falta de
flexibilidad
analítica
Baja
B
j
repetibilidad
METODOLOGÍAS PARA ESTUDIAR
DEGRADABILIDAD DE PROTEÍNAS
In vivo
In situ
In vitro
Químico
QUÍMICO
¾ Fraccionamiento químico de las proteínas (Sniffen et al., 1992)
FQP: FRACCIONAMIENTO QUÍMICO DE LAS PROTEÍNAS
FRACCIONES NITROGENADAS
¾Pool A = N soluble no proteico (no precipitable con TCA).
¾Pool B1 = N soluble (proteína precipitable con TCA).
¾Pool B2 = N insoluble en buffer, soluble en Detergente Neutro.
¾P l B3 = N iinsoluble
¾Pool
l bl en DN,
DN soluble
l bl en D
Detergente
t
t Á
Ácido.
id
¾Pool C = Indisponible (residuo no hidrolizado).
Sniffen et al. (1992)
BIOLÓGICAS & ENZIMÁTICAS
¾ In situ con bolsas de dacrón (Mehrez y Ørskov, 1977)
¾ In vitro con enzimas comerciales (Pichard y Van Soest, 1977)
¾ In vitro con fluido ruminal inhibido (Broderick, 1987-2004)
¾In vitro con fluido ruminal libre de MO (Luchini et al
al., 1993)
¾In vitro con enzimas ruminales (Kohn y Allen, 1995;
Velásquez y Pichard, 2010)
MÉTODO ENZIMÁTICO PARA ESTUDIAR
DEGRADABILIDAD DE PROTEÍNAS
EN EL RUMEN
In vitro con enzimas ruminales (Velásquez y Pichard, 2010)
HIPÓTESIS
Utilizando una preparación de extractos enzimáticos de
origen ruminal, es posible simular in vitro la degradabilidad
de las proteínas en el rumen.
rumen
EVENTOS ENZIMÁTICOS HIDROLÍTICOS EN EL RUMEN
Adherencia y colonización microbiana de partículas
Principalmente bacterias y protozoos
Degradación
enzimática
Intracelular
Sustrato inducción
Extracelular
Control génico
Síntesis de enzimas
Acción sinérgica de enzimas hidrolíticas en la degradación del sustrato
PROTEASAS AMILASAS,
PROTEASAS,
AMILASAS CELULASAS,
CELULASAS XILANASAS
(Hristov et al., 2008; Riasi et al., 2008)
CULTIVO DE FLUIDO
RUMINAL IN VITRO
ENERGÍA
&
NITRÓGENO
INTERACCIONES
ECOLÓGICAS
MICROBIALES
CULTIVO DE FLUIDO
RUMINAL IN VITRO
INCREMENTO EN BIOMASA
&
BIODIVERSIDAD MICROBIAL
DEPENDENCIA
SUSTRATO
(INDUCCIÓN)
CONCENTRACIÓN
Ó ENZIMÁTICA
Á
CULTIVO DE FLUIDO
RUMINAL IN VITRO
DIVERSIDAD ENZIMÁTICA
MATERIALES Y MÉTODOS
ANIMALES DONANTES DE FLUIDO RUMINAL
¾Dos vacas adultas fistuladas al rumen con cánula de
15 cm de diámetro.
¾Alimentadas
Ali
t d
a nivel
i l d
de mantención
t
ió con d
dos d
dosis
i
diarias.
¾La alimentación consistió en:
1) Heno de alfalfa (80 %)
2) Maíz grano chancado (20 %)
3) Sales minerales (120 g/d)
¾Contenido de Proteína Cruda
14,7%.
PREPARACIÓN DEL FLUIDO RUMINAL PARA SU CULTIVO IN VITRO
Colección de fluido ruminal (3,5 litros)
4 horas postprandial
Separación de la fracción
líquida
q
y sólida (filtración)
(
)
1 kg fracción líquida
1 kg fracción sólida
Mezcla
Homogenización (2 minutos)
Waring Blendor
Filtración en paño quesero y en lana de vidrio
con vacío y gaseo permanente de CO2
(Goering y Van Soest, 1970)
Fluido ruminal preparado
para su cultivo in vitro
ESTRATEGIA DE INCUBACIÓN IN VITRO DEL
FLUIDO RUMINAL
MEDIO DE CULTIVO
¾ 100 ml:
¾ 100 ml:
¾ 100 ml:
¾ 200 ml:
¾ 20 ml:
¾ 5 g:
inóculo (fluido ruminal).
solución macro y micro mineral.
buffer bicarbonato de sodio (pH 6,8).
agua destilada.
solución reductora (Sulfuro de sodio).
sustratos mixtos inductores.
CONDICIONES AMBIENTALES
¾39ºC.
¾pH 6,8.
¾anaeróbica (presión positiva de CO2).
Composición de los sustratos inductores y tiempo de incubación
en la fase previa a la extracción enzimática.
Ingredientes
Tratamientos
Sustrato de
incubación
Almidón
de maíz
FDN de
ballica
Afrecho soya +
harina alfalfa*
Incubación
h
%
Rico en proteína
10
40
50
4
Rico en almidones
60
20
20
4
Rico en fibra
05
75
20
6
Control**
00
00
00
0
*Afrecho de soya + Harina de alfalfa: 50/50.
incubar
** Fluido ruminal sin incubar.
OBTENCIÓN DE EXTRACTOS ENZIMÁTICOS
Centrifugación del fluido ruminal cultivado.
cultivado
6000 g, 4ºC, 10 minutos
Resuspensión del pellet en buffer fosfato
de potasio, 50 mM; pH 7,1
(Nouaille et al., 2004)
Sonicación
S
i
ió de
d la
l masa microbiana
i
bi
(4 ciclos x 30 s, 70 W-20 kHz)
(Pan et al., 2003)
Centrifugación a 15000 g x 15 minutos a 4ºC
(separar restos y detritos celulares)
Recuperación del sobrenadante
(contenido enzimático)
Precipitación de proteínas: Sulfato de amonio (55 %)
%).
Agitación orbital por 1 hora a 0ºC
Centrifugación a 16000 g x 30 minutos a 4ºC
(recuperar enzimas en el precipitado)
Resuspensión del pellet rico en enzimas
Buffer Tris-HCL 50 mM (pH 6,5)
((Karadzic et al.,, 2004))
P
Diálisis de extracto enzimático
(24 horas)
Mantención de extracto enzimático
dializado a -32ºC x 1 hora
Liofilización de extracto enzimático
Almacenamiento de extracto
enzimático a - 32ºC
A
F
RESULTADOS
Zimograma de actividad proteolítica
de los extractos enzimáticos.
Zimograma de actividad proteolítica de los
extractos enzimáticos. Sustrato: g
gelatina.
Extracto enzimático*
Peso
molecular
KDa
*Sg
Extracto enzimático
** P
PM
kDa
A
130
F
P
C
AZA
***
F
2998a
sp
C
2132b
sp
ZA**
1ª
117
2ª
85
3ª
49
4ª
34
5ª
6ª
25
* Extracto de actividad enzimática preferentemente: proteolítico
(P), amilolítico (A), fibrolítico (F) y control (C). ** Zona de
actividad proteolítica, (sp) square pixels.
Estudio de la cinética de degradación de proteínas a través
de extractos enzimáticos de origen ruminal y comparación
con metodologías
t d l í tradicionales.
t di i
l
CONDICIONES Y TIEMPOS DE INCUBACIÓN
¾ Incubación:
- 100 mg PC de cada sustrato.
- Extracto enzimático (P+A+F).
- 30 mll d
de b
buffer
ff Tris-HCl
T i HCl 50 mM
M ((pH
H6
6,5).
5)
- 39ºC.
os s enzimática:
e
át ca 100
00 U
UE.
¾ Dosis
¾Estrategia cinética: sustrato limitante.
¾Tiempos de incubación: 0,
0 1,
1 3
3, 6
6, 12
12, 18
18, 24
24, 36 y 48 h
h.
SUSTRATOS EVALUADOS
¾Afrecho de soya
y ((AS))
¾Gluten feed (GF)
¾Afrecho de canola (AC)
¾Afrecho de maravilla (AM)
¾Harina de alfalfa (HA)
¾T éb l alejandrino
¾Trébol
l j di
(TA)
¾Ballica perenne (BP)
¾ Avena sativa (AV)
RESULTADOS
Degradación de proteína (48h) de acuerdo a las
metodologías enzimas ruminales (EER), proteasas de
Streptomyces griseus (Sg); degradación de proteína in
situ y fraccionamiento químico de las proteínas (FQP).
Promedio de ocho sustratos alimenticios.
84 8 b
84,8
100
Degrada
ación 48 h (%
% PC)
90
75,5 c
89,6
, a
74,6 c
80
70
60
50
40
30
20
10
0
EER
EER
Sg
Sg
In
In situ
situ
FQP
FQP
Metodología
METODOLOGÍA
Letras distintas entre barras señalan diferencias significativas
según método de comparaciones χ² (P<0,05).
Tasa de proteolisis (kd) de acuerdo a las metodologías
enzimas ruminales (EER), proteasas de Streptomyces
griseus (Sg) y degradación de proteína in situ.
situ Promedio
de ocho sustratos alimenticios.
0,086 a
Ta sa d e p ro te o liisis (kd )
0,1
0,09
0,08
0,071 b
0,064 c
0,07
0 06
0,06
0,05
0,04
0,03
0,02
0,01
0
EER
EER
Sg
Sg
In situ
In
situ
Metodología
METODOLOGÍA
Letras distintas entre barras señalan diferencias significativas según
método de comparaciones χ² (P<0,05).
dede
proteína.
Afrecho
de
DegradaciónDegradación
de proteína
acuerdo
a las metodologías
enzimas ruminales e incubación
situ
soya in situ.
soya.
Afrecho de soya
Límite persistencia proteolítica
100
90
80
70
60
50
40
30
20
10
0
Degrad
dación (%
% PC)
93,2 a
85,6 b
Enzim as rum
In situ
Enzimas rum: kd = 0,066
0 066
In situ: kd = 0,072
Lag enzimas ruminales = 0 h
Lag in situ = 2,73 h
0
6
12
18
24
30
36
Ti
Tiem
po iincubación
b ió (h)
42
48
CONCLUSIONES
1. El cultivo in vitro de fluido ruminal en un medio enriquecido,
permite obtener extractos enzimáticos con una elevada
actividad proteolítica.
p
2. Los extractos enzimáticos presentan diversas proteasas. No
obstante, la distribución de éstas en los zimogramas, en general,
son muy similares entre los preparados enzimáticos de fluido
ruminal cultivado y sin cultivar.
3. Es posible incrementar la actividad proteolítica de extractos
enzimáticos ruminales con adición de carbohidrasas.
4. El uso de los preparados enzimáticos ruminales resultó exitoso
para describir la actividad proteolítica en las primeras horas de
incubación. No obstante, en tiempos tardíos se observa una
disminución de dicha actividad respecto a la técnica in situ.
situ
5 L
5.
La d
degradación
d ió proteica
t i observada
b
d mostró
t ó una alta
lt repetibilidad
tibilid d
en la aplicación del método desarrollado en esta investigación,
lo cual constituye una ventaja para la estandarización futura de
la técnica.
GRACIAS POR SU ASISTENCIA Y ATENCIÓN