LABORATORIO No 6 ENZIMAS DE RESTRICCION

BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR
LABORATORIO No 5: ENZIMAS DE RESTRICCION
1. INTRODUCION
Las enzimas de restricción, también conocidas como endonucleasas, son enzimas
que cortan los enlaces fosfodiéster del material genético a partir de una secuencia
que reconocen. Las mismas permiten cortar ADN de hebra doble, donde
reconocen secuencias palindrómicas (secuencias que se leen igual en ambas
direcciones).
2. OBJETIVOS
•
•
•
3.
Identificar la función y clases de enzimas de restricción existentes
Adquirir destreza en la realización de hidrólisis de ADN por enzimas de
restricción
Adquirir la habilidad para realizar e interpretar mapas de restricción
MARCO TEORICO
Las enzimas de restricción son endonucleasas que reconocen una secuencia
entre 4-8 pb en ADNs. El sitio de reconocimiento se llama sitio de restricción, y la
enzima rompe un enlace fosfodiéster en la hebra de arriba y otro enlace
fosfodiéster en la hebra complementaria.
Estas enzimas se encuentran en muchas especies de bacterias, donde funcionan
in vivo como parte de un sistema de restricción y modificación (sistema R/M). Este
sistema es análogo a un sistema inmune, y le permite distinguir a la bacteria entre
su propio ADN y el ADN exógeno, siendo este último degradado por la enzima de
restricción. El ADN propio no es reconocido por sus enzimas de restricción, puesto
que previamente lo ha modificado por metilación a través de la acción de una
metiltransferasa (enzima que transfiere grupos metilo desde S-adenosilmetionina a
bases específicas).
Son extraídas de organismos procarióticos (bacterias), donde actúan como un
mecanismo de defensa, para degradar material genético extraño que entre en la
célula. Las bacterias tienen la capacidad de metilar su ADN, lo cual sirve para
distinguir entre el ADN extraño y el ADN propio. Las enzimas de restricción no
pueden cortar ADN metilado, de este modo solo afectan el ADN extranjero y no el
ADN bacteriano.
Existen tres tipos de enzimas de restricción. Las enzimas de restricción de tipo II
cortan en una posición específica del ADN dentro de su secuencia de
reconocimiento, denominada sitio de restricción.
Las endonucleasas se nombran a partir de las bacterias de las que son
extraídas, su nombre está dado según el género y la especie de la bacteria de
donde se aisló por primera vez esta enzima. La primera letra representa el
género de la bacteria, las próximas dos indican la especie, una cuarta letra
indica la cepa, y un número al final indica la cantidad de enzimas que se han
aislado de esa cepa. Ej:
Eco RI
E
Co
R
I
= género Escherichia
= especie coli
= cepa RV 13
= primera endonucleasa aislada de esta cepa
Las enzimas de restricción al cortar el DNA pueden producir 2 tipos de cortes:
1. Cohesivos o pegajosos: Cortes escalonados, dejando productos con
extremos complementarios (cohesivos) Ej: Eco RI
GAATTC
CTTAAG
EcoRI
GGATCC
CCTAGG
AAGCTT
AACGAA
BamHI
HindIII
2. Abruptos: Cortes simétricos, dejando productos con extremos ciegos Ej: Alu I
AATATT
TTATAA
SspI
CCCGGG
GGGCCC
SmaI
Aunque se utilizan ambas clases de fragmentos (con extremos ciegos y con
extremos escalonados), en ingeniería genética se prefieren aquellos con extremos
complementarios, puesto que permiten la unión espontánea del gen a clonar con
el vector. Si las moléculas a utilizar presentan extremos ciegos, hay que
conferirles extremos cohesivos, por ejemplo utilizando la enzima transferasa
terminal.
Importante: Una unidad de enzima se define como la cantidad de enzima que se
necesita para cortar 1µg de ADN en 1 hora. El buffer siempre debe añadirse como
un 10% de la reacción total de digestión.
Mapa de restricción
Un patrón de ADN generado mediante electroforesis que se produce después de
cortar con una enzima de restricción.
La representación de una molécula de ADN, ya sea circular o lineal, donde se
indiquen los sitios de restricción que poseen, se denomina mapa de restricción.
Mapa de restricción del plásmido YIP5 de 5.541 pb. Los números indicados después de
cada enzima de restricción indican las posiciones de los sitios de corte.
Tamaño de los fragmentos de restricción:
Si los sitios de restricción fueran distribuidos al azar en la longitud de una molécula
de ADN, una enzima que reconociera una secuencia de 4 nucleótidos, cortaría
1/256 nucleótidos, mientras que una enzima que reconociera 6 nucleótidos
cortaría en promedio 1/4.096 nucleótidos.
La digestión por EcoRI (secuencia de reconocimiento de 6 nucleótidos) de una
molécula de ADN bacteriano de 4 millones de pares de bases producirá
aproximadamente 103 fragmentos diferentes, mientras que la digestión total de
ADN de un mamífero va a producir alrededor de 106 fragmentos.
Es por esto que la frecuencia de aparición de un sitio depende de su secuencia de
nucleótidos. Por ejemplo, la enzima NotI que reconoce un sitio de 8 nucleótidos 5'GCØGGCCGC-3' no corta en más de 3 el ADN de mamíferos y produce
fragmentos de talla media de 1 a 1,5 millones de pares de bases. Esta enzima se
utiliza en los trabajos de cartografía física del ADN
4. PRELABORATORIO
1. Enumere los factores que son críticos al trabajar con enzimas de restricción y
que pueden afectar la actividad de las mismas.
2. Describa las características de las endonucleasas tipo I y III y de ejemplos.
3. ¿Cuantas endonucleasas tipo II se han encontrado hasta el momento? Nombre
por lo menos 10.
4. Defina Isoschizómeros y de ejemplos.
5. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS
• Enzima de restricción (según disponibilidad)
• Buffer respectivo para la enzima de restricción señalada
• Tubos Eppendorf de 1.5mL estériles
• Baño serológico a 37°C
• Micro pipetas
• Cubeta de hielo
• Micro centrífuga (centrífuga para Eppendorf)
6. PROCEDIMIENTO
- Partir de un muestras de ADN bicatenario con concentración de 0,1 µg/µL y
longitud de 10.000 pb.
- Colocar 10 µl de ADN en los tubos de Micro centrífuga, 7 µl de agua, 1 µl de
enzima de restricción a utilizar (de 5 Unidades /ul )y 2 µl de la solución tampón
10X para la enzima de restricción.
- Mezclar y centrifugar.
- Colocar a incubar en baño serológico (37°C) por 1 hora
- Correr los productos en gel de azarosa teñido con bromuro de etidio y visualizar
en transiluminador UV
EJEMPLIFICACION DEL PROCEDIMIENTO UTILIZANDO LA ENZIMA DE
RESTRICCION EcoRI
Visualización de los productos de hidrólisis: Servir los hidrolizados en un pozo del
gel de electroforesis. En uno de los pozos adyacentes, depositar una muestra de
ADN no hidrolizado y en otros dos, una mezcla de moléculas de ADN de tamaño
conocido (marcadores), que servirán para calcular las tallas de los fragmentos
obtenidos.
Gracias a un transiluminador UV, las moléculas de ADN pueden visualizarse. El
marcador de peso molecular permite analizar que la Eco RI ha cortado la molécula
original de 10.000 pb en dos fragmentos, de 7.500 y 2.500 pb respectivamente.
7. POST-LABORATORIO
1. Mencione 3 diferencias en actividad de las endonucleasas en procariontes y
eucariontes.
2. Las enzimas de restricción de tipo II reconocen secuencias de ADN específicas
y cortan fuera de esas secuencias. Cierto o Falso (justifique).
3. Estas enzimas se pueden acoplar a cebadores o primers para obtener
secuencias de corte dentro de amplicones obtenidos por PCR? ¿Qué utilidad
tienen?
4. Mencione un ejemplo de una enzima que genere terminales cohesivos y una
que genere terminales abruptos.
8. BIBLIOGRAFÍA
-Catálogos y fichas técnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega,
Biorad, Biologend, Bioline, Roche, etc.
-Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition,
Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,
-David, L.G. Dibner, M.D. & Battery, J.F. Basic methods in molecular biology.
Elsiever Science publishing Co. Ind. NY. 1986.
-Catálogos de PROMEGA casa comercial PROMEGA.
9. AUTOEVALUACION
NUMERO DE
LA PRACTICA
LOGRO
(Objetivos
cumplidos)
SI
NO
FORTALEZAS
DEBILIDADES
SUGERENCIAS
A
CADA
DEBILIDAD