IA-MBA-PT- 002 Determinación de Listeria
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LANASEVE Rige a partir de: 14/06/11 Código: IA-MBA-PT- 005 Determinación de Listeria monocytogenes en productos cárnicos listos para consumir y muestras de superficie por PCR Versión 04 Página 1 de 4 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección 1. Objetivo Disponer de un método para detectar la presencia de Listeria monocytogenes. 2. Alcance Para aplicar en muestras de productos cárnicos listos para consumir y muestras de superficie. 3. Responsabilidad y Autoridad El Jefe de Sección: Velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento. Coordinador Técnico de Sección: Velar por el cumplimiento de las normas establecidas en este procedimiento Analista de laboratorio: Realizar el ensayo según lo descrito en este procedimiento. 4. Definiciones No aplica 5. Abreviaturas y/o siglas PCR: Reacción en cadena de la polimerasa 6. Referencias y o Bibliografía IA- IA-MBA-PT- 002 Determinación de Listeria monocytogenes en productos cárnicos listos para consumir y muestras de superficie. IA-MBA-PE-009-RE-011 Hoja de trabajo: Análisis de Listeria monocytogenes SEG-PE- 005 Control de medios de cultivo IA-MBA-PE- 015 Control de calidad de reactivos IA-MBA-PE-009 Manejo de la muestra. USDA/FSIS Microbiology Laboratory Guidebook Online, MLG 8.07 revisión 07 y MLG 8A.04 revisión 04 (03/08/09) ® Instructivo Guía DuPont Qualicon BAX System 7. Descripción del procedimiento 7.1 Fundamento teórico El método consiste en el enriquecimiento de la muestra en caldo UVM y caldo MOPS – BLEB posteriormente se realiza la prueba de PCR por medio del Sistema BAX. Las muestras positivas se cultivan en un medio selectivo y se confirman, por medio de pruebas bioquímicas, pruebas diferenciales (motilidad, hemólisis) y prueba del ARN Ribosomal. 7.2 Equipo, materiales, medios de cultivo y reactivos 7.2.1 Equipo Balanza sensibilidad ± 0,1g Homogenizador o Stomacher Incubadora de 30 ºC ± 1ºC Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 14/06/11 Código: IA-MBA-PT- 005 Determinación de Listeria monocytogenes en productos cárnicos listos para consumir y muestras de superficie por PCR Versión 04 Página 2 de 4 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección Incubadora de 35 ºC 2 ºC ® Sistema BAX (Ciclador/detector, computadora e impresora) Calentadores para blocks Block de enfriamiento para lisis a 4 ºC ± 2 ºC Block de calentamiento a 55 ºC ± 2 ºC Block de calentamiento a 95 ºC ± 3 ºC Block de enfriamiento para PCR a 4 ºC ± 2 °C Bandeja para tubos de PCR Gradilla para tubos de PCR Pipeta repetidora de 20 µ l -200 µl Pipeta repetidora de 5 µ l -50 µl Pipeta repetidora multicanal de 5 µl -50 µl Abridor de tubos PCR Abridor tubos Simport T100-4G para lisis 7.2.2 Materiales Bolsas plásticas estériles 7 pulg x 12 pulg (ancho x largo) LABPLAS EPR 7012 Bolsas plásticas estériles con esponja LABPLAS KSS21100 Pipetas de vidrio de 1 ml, 2 ml Asas bacteriológicas Aplicador es con algodón estéril Marcadores de tinta permanente Desinfectante Virkon S Solución de cloro al 1% Solución de etanol al 70 % Guantes de nitrilo libre de talco Puntas para micropipeta 20 µl -200 µl Puntas para pipetas repetidoras de 20 µl -200 µ l Puntas para pipetas repetidoras de 5 µl -50 µl Jeringa dosificadora de 5 ml Biotubo para lisis Simport T 100-4G Tapas para Biotubo para lisis Simport T100-35 7.2.3 Medios de Cultivo Caldo UVM Acido Morfolin propano sulfonico + Caldo Buferado Enriquecimiento Listeria (MOPS-BLEB) Agar Oxford Modificado (MOX) 7.2.4 Kit ® BAX Assay for Screening L. monocytogenes (Qualicon D11000157) a 4 °C ± 2 °C 7.2.5 Cepas de referencia Listeria monocytogenes ATCC 19111 Listeria innocua ATCC 33090 Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 14/06/11 Código: IA-MBA-PT- 005 Determinación de Listeria monocytogenes en productos cárnicos listos para consumir y muestras de superficie por PCR Versión 04 Página 3 de 4 Elaborado por: Jefe de Sección 7.3 Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección Procedimiento Día 1 7.3.1 Procesar y enriquecer la muestra de acuerdo al procedimiento IA-MBA-PT- 002 sección 7.31 al punto 7.3.7 Día 2 7.3.2 Transferir 0.1 ml 0.02 ml de caldo UVM a tubos con 10 ml 0,5 ml de MOPS-BLEB. Incubar los tubos MOPS-BLEB inoculados a 35 °C 2 °C por 18-24 horas. 7.3.3 Con una asa bacteriológica rayar aproximadamente 0,1 ml de UVM la superficie de una placa de MOX. Alternativamente se puede introducir un aplicador con algodón estéril el UVM y rayar el 25% al 50 % de la superficie de MOX y con un asa bacteriológica estéril rayar la superficie del plato restante para aislar colonias de la superficie previamente inoculada. Incubar a 35 °C 2 °C por 26 2 horas. Día 3 ® 7.3.4 Hacer la prueba de PCR BAX Listeria monocytogenes siguiendo instrucciones del fabricante. 7.3.5 Confirmación de resultados BAX positivos: Con una asa bacteriológica rayar aproximadamente 0.1 ml de MOPS-BLEB la superficie de una placa de MOX. Alternativamente se puede introducir un aplicador con algodón estéril el MOPS-BLEB y rayar el 25 al 50 % de la superficie de MOX y con un asa bacteriológica estéril rayar la superficie del plato superficie del plato restante para aislar colonias de la superficie previamente inoculada. Incubar a 35 °C 2 °C un mínimo de 24 horas. 7.3.6 Hacer aislamiento e identificación siguiendo procedimiento IA-MBA-PT- 002 sección 7.3.10, 7.3.21 y del 7.3.23 al 7.3.28. 7.4 7.4.1 Interpretación de resultados Muestras que dan negativo a la prueba BAX y son negativas en el MOX de 24 horas del primer enriquecimiento se reportarán como negativas. Si la prueba BAX es negativa pero el cultivo en MOX presenta colonias típicas o la prueba de BAX es positiva, indeterminada o presenta un resultado invalido, se debe continuar con el cultivo de las muestras. 7.4.2 Basado en el análisis de las causas, los resultados indeterminados o inválidos en las muestras analizadas se procede a: Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada LANASEVE Rige a partir de: 14/06/11 Código: IA-MBA-PT- 005 Determinación de Listeria monocytogenes en productos cárnicos listos para consumir y muestras de superficie por PCR Versión 04 Página 4 de 4 Elaborado por: Jefe de Sección Revisado por: Coordinador Técnico de Sección Aprobado por: Jefe de Sección - Repetir la prueba del BAX a partir de la muestra lisada. ® -Preparar nuevos tubos de BAX y repetir el análisis de PCR. Si el control positivo da un resultado negativo, en la prueba de PCR BAX, se debe: a) Hacer el análisis de nuevo a partir de la muestra de reserva desde la preparación de la muestra y el enriquecimiento. b) O rayar el MOPS-BLEB, de los controles y las muestras, en MOX y seguir procedimiento IA-MBA-PT- 002 a partir sección 7.3.10. Si por alguna razón no se pueda hacer uso del BAX (interrupción fluido eléctrico o fallo del equipo) se debe seguir procedimiento IA-MBA-PT- 002 Determinación de Listeria monocytogenes en productos cárnicos listos para consumir y muestras de superficie, a partir de la sección 7.3.10. 7.5 Control de Calidad 7.5.1 Cada lote de reactivos y los kit BAX para Listeria monocytogenes se les hará control de calidad por medio de cepas de referencia siguiendo procedimiento IA-MBA- PE-015 Control de Calidad de Reactivos. 7.5.2 El control de calidad de los medios de cultivo utilizados se debe llevar a cabo de acuerdo al procedimiento SEG-PE-005 Control de medios de cultivo. 7.6 Puntos Críticos de Control Control de las temperaturas de los incubadores: se debe mantener el registro de la temperatura óptima de cada incubador, así como las medidas correctivas a seguir en caso de alguna variable. 8. Anexos No aplica Normativo Propiedad del SENASA, el documento vigente se encuentra en INTERNET cualquier versión impresa es una copia no controlada
