Clase 7-Regulación en eucariotas

Regulación en Eucariotas
Algunos niveles de regulación de la
expresión génica
• Expresión o no expresión de un gen
• Nivel de expresión
• Splicing alternativo
• Estabilidad del ARN
• Modificaciones a proteínas
Niveles generales de regulación
• Transcripcional
• Posttranscripcional
Dolly, el primer mamífero en ser clonado
5 July 1996 – 14 February 2003
Diferencias con procariotas
• Genomas más complejos, más elementos
involucrados en regulación
• ADN eucariótico está empacado en nucleosomas.
La estructura de cromatina es dinámica.
• Estado “basal” de los genes en procariotas es
“encendido”, en eucariotas es “apagado”.
Usualmente la estructura de la cromatina se debe
cambiar para poder activar la transcripción.
Regulación transcripcional en procariotas vs eucariotas
Diferencias con procariotas
• Procariotas: una sola ARN polimerasa. Eucariotas:
3
• Splicing en eucariotas
• ARN polimerasa II (la que transcribe ARNm) es
mucho más grande y compleja que la de
procariotas
• Regulación en eucariotas es más fina y tiene
muchos más elementos
Regulación en eucariotas debe :
• Asegurar que la expresión de la mayoría de los
genes del genoma esté apagada en un momento
dado, mientras que activa un subconjunto de los
genes
• Generar miles de patrones de expresión génica
Regulación en eucariotas:
• Dos grupos importantes de proteínas:
• Complejo de ARN polimerasa II y factores
generales de transcripción (interactúan con
elementos proximales del promotor)
• Factores de transcripción que se unen a
“enhancers” (amplificadores, potenciadores o
activadores de la expresión génica)
Elementos proximales al promotor
Unión ARNpol II al promotor no es suficiente para transcripción
FGT deben unirse a elementos proximales
Importancia de elementos proximales en la
transcripción
Factores
generales de
transcripción
afectan la
expresión de
muchos
genes
ARN polimerasa II
y
Factores generales de
transcripción
Enhancers,
más
específicos
ARN pol II
Unidos a elementos
proximales
Procesamiento cotranscripcional de ARN
Fosforilación de CTD (dominio
de extremo carboxilo) de
ARNpol II es reversible y crea
sitios de unión para enzimas y
factores requeridos para:
-Agregar cap (guanina
modificada)
-Splicing
-Cortar y poliadenilar el ARN
(para estabilidad)
Enhancer y promotor
• Al promotor se unen FT que afectan transcripción en muchos
genes
• A los enhancers se unen FT que regulan la expresión de un
número menor de genes
• A menudo un enhancer actúa en sólo uno o unos pocos tipos
celulares en un eucariota multicelular
Proteínas reguladoras
• Tienen al menos uno de estos dominios funcionales:
1. Reconoce la secuencia reguladora en el ADN
2. Interactúa con una o más proteínas del aparato
transcripcional (ARNpol o una proteína asociada)
3. Interactúa con proteínas unidas a secuencias reguladoras
cercanas en el ADN, para que puedan cooperar en la
regulación de la transcripción
4. Influye directa o indirectamente sobre la condensación de
cromatina
5. Actúa como sensor de condiciones fisiológicas en la célula
Organismo modelo: Saccharomyces cerevisiae
Metabolismo de galactosa
en levadura
• También altamente regulado
• Varios genes codifican para
enzimas que catalizan pasos
de la vía bioquímica que
convierte a galactosa en
glucosa
• Como en bacterias, la
expresión de los genes
depende de la presencia de
galactosa en el medio
Otros genes involucrados
• GAL3, GAL4 y GAL80 codifican para proteínas que
regulan la expresión de los genes que codifican para
las enzimas de la vía bioquímica
• El principal regulador es la proteína Gal4 (proteína de
unión al ADN)
Regulación por Gal4
• En presencia de galactosa, los niveles de expresión de
los genes GAL1, GAL2, GAL7 y GAL10 son 1000x más
altos que en su ausencia
• Pero en mutantes GAL4, todos permanecen inactivos
• Cada uno de estos genes tiene dos o más sitios de
unión a Gal 4 en dirección 5’ del promotor (corriente
arriba).
• Dímeros de Gal4 se unen a secuencias específicas de
ADN de 17pb corriente arriba de los genes regulados
Unión de Gal4 a elementos UAS (upstream
activation sequences)
Si hay deleción de sitios de unión los genes no se expresan, aún en presencia de
galactosa
Estos UAS son un tipo de “enhancer”, típicos de eucariotas, a distancia
considerable del promotor
Dos dominios de Gal4, unión al ADN y activación de
transcripción
Doble dominio es común también en
otros factores de transcripción
lacZ: gen reportero
Lex A: gen represor de E. coli (para
ver efecto con otro gen)
Regulación de actividad de Gal4
•En mutantes de GAL80 todos los genes GAL activos
aún cuando no hay galactosa
•Sugiere que Gal80 inhibe genes GAL
•Mutantes GAL3: genes GAL inactivos aún con
galactosa presente
•Sugiere que Gal3 favorece expresión de genes
GAL
Regulación de actividad de Gal4
Gal80 se expresa de manera
continua e inhibe actividad de
Gal4
Gal80 siempre reprime
transcripción de genes GAL
Papel de Gal3 es liberar a los
genes GAL de represión
cuando hay galactosa
Gal3+galactosa-cambio de
conformación que hace que se
una a Gal80
Gal80 libera a Gal4
¿Diferencia con regulación en procariotas?
Gal4 funciona en la mayoría de los
eucariotas
•Gal4 funciona como activador de transcripción en
insectos, células humanas y otros eucariotas
•Sugiere que la maquinaria bioquímica y los mecanismos
de activación de genes son comunes a muchos
eucariotas
•Gal4 y sus UAS (upstream activation sequence) han sido
elementos populares en análisis genético para la
manipulación de la expresión génica
Proteínas activadoras de transcripción reclutan a la
maquinaria de transcripción
Activadores reclutan a la ARNpol II a los promotores de dos maneras:
-interactuando con subunidades de complejos proteicos con función
en iniciación de transcripción
-reclutando proteínas que modifican la estructura de la cromatina
Cromatina dinámica
•Segundo mecanismo de regulación: modifica estructura
de cromatina alrededor de regiones reguladoras
•ADN de bacterias está más accesible. Genes
“encendidos” a menos de que haya represión
•En eucariotas está organizado en cromatina. Genes
inaccesibles y “apagados” a menos de que sean
activados
Estructura de la cromatina
Estructura de la cromatina
2 de:
H2A
H2B
H3
H4
Nucleosoma es AND alrededor de 8 histonas
Estructura de la Cromatina
•Se hereda de una generación celular a otra:
herencia epigenética
Mecanismo de regulación: Remodelación de
cromatina
Hace accesibles
regiones
reguladoras
Modificaciones de histonas
•Importantes en remodelación de cromatina
•Ocurre en residuos de lisina y arginina en los
extremos amino-terminales expuestos de las histonas
(colas de las histonas)
Acetilación de histonas
•Una de las modificaciones de histonas más
estudiadas
La reacción es reversible
44 residuos de lisina que pueden aceptar grupos acetilo (muchas posibilidades de
regulación)
Código de histonas
Relación acetilación-actividad
•En general:
•Genes activos: nucleosomas hiperacetilados
•Genes inactivos: nucleosomas hipoacetilados
•Enzima que agrega grupos acetilo: HAT
Modificación de colas de histonas causa remodelación
de cromatina
Agregar y elminar grupos acetilo y metilo a colas de histonas hace que los
nucleosomas se separen, exponiendo ADN a la actividad de proteínas
reguladoras de transcripción
Desacetilación de histonas
•HDACs desacetilan
Complejo que contiene una HDAC
En presencia de glucosa el gen GAL1 apagado
Metilación de colas de histonas
Herencia de modificaciones de histonas y
estructura de cromatina
• En replicación, el replisoma:
•Copia ADN
•Desensambla los nucleosomas en las hebras
parentales y los vuelve a ensamblar en las
hembras parentales y nuevas
Metilación de ADN
• Se agregan grupos metilo a residuos específicos de
citosina: los que están en dinucleótidos CG. Se da
metilación simétrica.
C*G
G C*
Metilación de ADN en mamíferos
• 70-80% de todos dinucleótidos CG están metilados
•La mayoría de los no-metilados están en grupos
cerca de promotores. Se les llama islas CpG
(p=enlace fosfodiéster)
• ¿Se asocia la metilación de C con regiones activas
o inactivas del genoma?
Herencia metilación ADN
• Se hereda establemente de una generación celular
a la siguiente
Después de replicación hay hebras hemimetiladas, ADN metiltransferasa
las metila
Activación de genes transitoriamente
FT
Coactivador:
intermediario entre
FT y polimerasa
Enhanceosoma: complejo proteico que actúa de forma sinérgica para activar transcripción
Forma de hacer transcripción regulable: varios sitios de unión a ADN en un enhancer.
Depende de cuáles y qué tantos FT se pegan el nivel de transcripción varía
Aisladores: impiden que enhancers afecten genes
que no les corresponden
Heterocromatina vs eucromatina
• Heterocromatina: altamente condensada, pocos
genes
•H. constitutiva: siempre condensada
•H. facultativa: puede expresarse a veces
•Eucromatina: menos condensada, más genes
Improntas
La mayoría de los genes se expresan
equitativamente de los cromosomas materno y
paterno
Improntas genómicas son el marcado epigenético
de un gen basado en su padre de origen y
resulta en expresión monoalélica
Improntas
No se apega a reglas de genética clásica porque el
complemento de genes improntados maternos y
paternos no es equivalente
El mecanismo parece involucrar metilación
específica dependiente del progenitor en
regiones CpG, que se borra en la formación de
gametos
Si está activo o no
depende de cuál
progenitor se originó, no
de si estaba activo en el
progenitor
Improntas en enfermedades genéticas
Varias enfermedades asociadas con defectos en
imprinting
Resultado de:
Deleciones (que resultan en falta de expresión)
Pérdida de impronta por mutación (que resulta en
expresión dialélica en lugar de monoalélica)
Disomía uniparental (que resulta en expresión
doble o no expresión del todo)
Mecanismos que generan UPD
Síndrome de Prader-Willi
•Normal: se expresa copia
paterna
•70% tiene deleción de 15q12
derivada del padre
•25% tiene matUPD15
Características clínicas:Síndrome de Prader-Willi
1-12 000/15 000
Hiperfagia, obesidad, baja estatura, problemas de
aprendizaje
Recién nacidos con debilidad muscular son
evaluados genéticamente
Detección temprana: se prescribe hormona de
crecimiento, también disminuye apetito
7 genes (o algunos de los 7) han sufrido deleción
o no se expresan en el cromosoma paterno
Síndrome de Angelman
•Normal: se expresa copia
materna
•70% tiene deleción de
15q12 derivada de la
madre
•2% tiene patUPD15
Características clínicas:Síndrome de
Síndrome de Angelman
Retraso en desarrollo, disminución en intelecto,
inestables al caminar, problemas al dormir,
epilepsia, felices
Boca ancha, dientes espaciados, barbilla
prominente
Genes en cromosoma 15 sufren deleción o no se
expresan en el cromosoma materno
15q11-q13
Caracterizado por sobrecrecimiento somático,
anomalías congénitas y predisposición a
cáncer infantil
Gigantismo, macroglosia, anomalías de orejas y
otros, onfalocele (protrusión de órganos
abdominales por el ombligo)
Muchos con tamaño aumentado de órganos
internos, tumores embrionales como tumor de
Wilms, hepatoblastoma o rabdomiosarcoma
Hiperplasia e hipertrofia de islotes pancreáticos: a
menudo lleva a hipoglicemia neonatal
Impronta genómica de Igf2
Patrón de herencia inusual en genes improntados
Pasos en establecimiento impronta
Ciclo de Improntas
ARN Xist (rojo) cubre una de las dos copias del cromosoma X
Individuos normales: metilación generalizada excepto
en islas CpG
Cáncer: hipometilación generalizada (vuelve genoma
inestable) y metilación específica de algunos
genes (supresores de tumores)
Cambios epigenéticos preceden al tumor y se
podrían utilizar como marcadores
Patrón similar se observa en individuos sanos con la
edad
Hipometilación/ Hipermetilación ADN en cáncer
Silenciamiento post-transcripcional
Represión de la traducción por miARN
miARN regula a gen
blanco
Es regulación posttranscripcional
Degradación de ARN desencadenada por siARN
A diferencia de miARN no regula otro
gen sino que marca el gen que se está
expresando para degradación de su
ARN
Epigenética
Se define como cambios heredables
que ocurren en la actividad y
expresión de genes sin afectar al
secuencia de ADN
Mecanismos epigenéticos
• Metilación de ADN
• Modificaciones a histonas
• ARNs no codificantes
• Remodelación de cromatina