con propiedades antimicrobianas

Aceites Esenciales
con propiedades antimicrobianas
RESUMEN
El presente estudio trata sobre la extracción y
evaluación del perfil biológico antimicrobiano in vitro de
aceites esenciales de especies vegetales aromáticas. Los
aceites fueron obtenidos mediante destilación por
arrastre de vapor de agua de diferentes órganos: partes
aéreas (hojas y tallos) y dermis de cítricos (cáscara). El
crecimiento del hongo saprófito Neurospora crassa fue
inhibido por el aceite de Citrus limetta (Lima) a
concentraciones de 0, 5 mg/ml. El aceite de Rosmarinus
oficinalis (Romero), a una concentración de 1 mg/ml,
inhibió el crecimiento de la bacteria Staphylococcus
aureus. Mientras que los aceites de Petroselium
sativum (Perejil), Satureja boliviana (Khoa), Schínus
molle (Molle), Citrus aurantium (Naranja), Citrus
paradisii (Toronja) y Citrus nobilis (Mandarina),
inhibieron el crecimiento tanto de hongos a 0, 5 mg/ml,
como bacterias a 1 mg/ml Entre estas últimas esencias,
las del Perejil y Molle a 3.7 mg/ml y la Khoa a 7.5 mg/
ml inhibieron el crecimiento de Sigella flexneri.
1. INTRODUCCION
Universidad Mayor de San Andrés
Facultad de Ciencias Farmacéuticas
y Bioquímicas
Instituto de Investigaciones Fármaco
Bioquímicas-IIFB
Area Temática de Química Farmacéutica
• A quien debe dirígírse la correspondencia
• í[email protected]
Bolivia presenta una diversidad de zonas geográficas con climas
variados, favoreciendo de esta manera que exista una gran riqueza
de flora con propiedades medicinales aún no estudiadas en su
totalidad. Con este trabajo pretendemos contribuir a las
investigaciones científicas sobre aceites esenciales de plantas
aromáticas comunes en nuestro país. Los aceites esenciales son los
constituyentes odoríferos o esencias de una planta, son productos
volátiles, aromáticos, constituidos por una mezcla compleja de varias
sustancias,' 2.2 generadas por lo general mediante la ruta biosintética
del ácido mevalónico.4,5,6
El término aceite probablemente se origina del hecho que, el
aroma de una planta existe en forma líquida inmiscible en agua, en
glándulas o entre células. Los aceites esenciales se hallan en las
flores, sumidades floridas, hojas, frutos y semillas de los vegetales a
veces, aunque no muy frecuentemente, en los tallos y raíces. Su
distribución es amplia en el reino vegetal.3,4,5
Los aceites esenciales son utilizados en la industria cosmética,
farmacéutica, alimenticia y entre otros usos, son materia prima pivotal
en la aromaterápia atribuyéndoseles acciones antibacterianas;
antifúngicas; antivirales, etc.7 Cabe destacar que es también
importante el procedimiento que se emplea para la obtención de las
esencias de los vegetales, es así que existen varias técnicas, entre
Vol. VII - Diciembre de 1999
FLORES, VELASCO, FIGUEROA, GIMENEZ.
las más utilizadas están el método por arrastre de vapor
de agua, la extracción por fluidos en estado supercrítico,
la expresión en frío y otros métodos específicos que se
utilizaran de acuerdo al uso final que tendrán los aceites
esenciales. 8' 9
METODOLOGÍA
OBTENCION DE LOS ACEITES ESENCIALES POR
ARRASTRE DE VAPOR
Los aceites esenciales fueron obtenidos por el método
de arrastre de vapor de agua, utilizando un extractor de
aluminio de capacidad de 12 litros, para procesar aprox. 1
kilo de material vegetal. Consta del reservorio de agua
(3Lt) un trípode (18cm) y una rejilla milimétrica metálica
sobre la cual se deposita la muestra vegetal pesada (0.5
a 1.0Kg). El extractor cerrado herméticamente esta
conectado aun condensador de serpentín, que desemboca
en una bureta graduada. Cuando el volumen de aceite
destilado se mantiene constante, se considera punto final
de la extracción. El aceite extraído es secado con Na2SO4
anhidro y conservado a -20 °C en tubos tapa rosca. 70'17,72
ATCC 12022, Escherichia coli ATCC 8739.a una
población de 106 ufc/ml. La caja fue incubada 372C durante
24 hrs antes de leer el crecimiento o inhibición.14
Concentración Mínima Inhibitoria (CIM): Se realizó
la técnica de microdilución utilizando el medio caldo Mueller
Hinton (MHB-DIFCO), en el que se realizaron las diluciones
de los aceites en estudio a partir de 30mg/ml, adicionando
una población bacteriana a 3 x 106 ufc/ml de cada
microorganismo, colocando en la microplaca controles de
crecimiento bacteriano; control de esterilidad y control de
solvente. Una vez montada toda la microplaca, se incubo
a 372C por 16-18 hrs;, despues de este periodo las placas
se examinaron visualmente. 14
El punto final (Concentración Mínima Inhibitoria) se
considera la menor concentración de compuesto frente a
la cual el microorganismo ensayado no presenta desarrollo
visible. El criterio de desarrollo es una turbidez definida
como se presenta en el control de crecimiento; y la CIM
se observa cuando no hay turbidez, como el control de
esterilidad.
Concentración Mínima Bactericida (CMB):
PRUEBAS BIOLOGICAS
Todo el material de vidrio, medios de cultivo, y agua
destilada fueron esterilizados en autoclave (Al¡ American,
Mod-No 25X) a 120 °C, por 15 min a 1.5 atm. Los medios
de cultivo utilizados fueron Agar Saboraud, Caldo
Saboraud, Agar Muller Himton, Caldo Soya Tripticasa.
Como control en las pruebas antifúngicas, se utilizó
Ketoconazol (2.5 ug/ml) y en las pruebas antibacterianas,
Gentamicina(10ug/ml).
Evaluación antifúngica contra Neurospora crassa
1M70, ATCC 9279: En una microplaca de 24 pozos se
colocaron los aceites (a 1.0, 0.5 y 0.2mg/ml) mezclados
con el medio inoculado con esporas (106) de N. Crasssa.
La microplaca fue incubada a 289C en estufa por 24hr antes
de realizar la lectura del crecimiento o inhibición. 13
Evaluación antifúngica contra Candida albicans
ATCC 10231 En una microplaca de 24 pozos se colocaron
los aceites (a 1.0, 0.5 y 0.2mg/ml) mezclados con el medio,
una vez solidificado, se siembró C. albicans.(106 ufc/ml)
La microplaca fue incubada a 372C en estufa por 24hr antes
de realizar la lectura del crecimiento o inhibición.
Evaluación antibacteriana contra Bacterias: El
grado de inhibición de crecimiento mediante fue
determinado mediante la técnica de Mitcher, utilizando caja
Petri y mezclando el aceite (1 mg/ml) con el medio de cultivo
(MHA) sobre el cual se sembraron las bacterias en estudio:
Staphylococcus aureus ATCC 6538 Shigella flexneri
La CMI mide la capacidad del agente antimicrobiano
para inhibir la multiplicación del microorganismo. En
consecuencia los microorganismos presentes en el inóculo
pueden ser "sólo inhibidos" por el compuesto
antibacteriano, estos reinician su crecimiento si se elimina
la acción del compuesto, en este caso se dice que es
Bacteriostático . En caso de ser Bactericida los
microorganismos no podrán volver a multiplicarse aunque
sean separados del compuesto antibacteriano.
Estas pruebas se basan en la anterior técnica de
microdilución. Se realiza diluciones de la suspensión
bacteriana inicial de 1x106 ufc/ml, para determinar el
número real de unidades formadoras de colonias del
inóculo.
Después de realizar la lectura de la CIM, se sembraron
100 ul de todos los pocillos que no tuvieron desarrollo (no
turbios) en cajas Petri con agar Nutritivo,se incubaron las
cajas, a 372C por 16-18 hrs.14
Después del tiempo de incubación, realizar el recuento
de colonias desarrolladas y se compara con el inóculo
inicial (105ufc/ml). Dado que las substancias bactericidas
no siempre esterilizan totalmente una población bacteriana,
la mínima concentración del agente antibacteriano que
permita sobrevivir a menos de 0,1% del inóculo original
se denomina CONCENTRACION BACTERICIDA MINIMA
O CONCENTRACION LETAL MINIMA.15
JARABE 15 MG
AMBROLITIC CAPSULAS 30 MG
C♦1 Chiesi Wassermann
Ambroxol
España
Monosustancia de doble dimensión
t Iva
enso ac'
M uco l ltlva - T
* Fabricado bajo licencia por: Laboratorios Alfa Ltda.
Vol. VII- Diciembre de 1999
ACEITES ESENCIALES CON PROPIEDADES ANTIMICROBIANAS
Biológicos
RESULTADOS
Químicos
La Tabla No 1, detalla el nombre científico, nombre
común y porcentaje de rendimiento del aceite esencial
destilado de cada una de las 9 plantas estudiadas. Este
gráfico, representa el rendimiento relativo de los aceite
obtenidos durante nuestros estudios. Puede observarse
que la especie de mayor rendimiento es el Molle, dentro
de las especies de los cítricos, la Naranja produce más
aceite que la Toronja, la Mandarina, y la Lima, mientras
que la esencia de perejil es la menos abundante.
Todos los aceites esenciales fueron evaluados
mediante pruebas in vitro contra bacterias Gram (+) y Gram
(-), así como contra mohos y levaduras para definir su
actividad antíbacteriana y antifúngica. Los resultados de
las pruebas antibacterianas se detallan en la Tabla No. 2 y
los resultados de las pruebas antifúngicas se presentan
en la Tabla No. 4.
TABLA No 2.- RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD
ANTIBACTERIANA DE LOS ACEITES ESENCIALES A
1 MG/ML
TABLA No 1.- NOMBRE CIENTIFICO , NOMBRE
COMUN Y RENDIMIENTO DE LAS ESPECIES
VEGETALES.
Nombre científico
Nombre común
Rendimiento
Nombre científico
1
2
3
Petroselium sativum
(-)
(+)
(-)
Citrus limetta
(-)
(-)
(-)
Citrus paradisii
(+)
(-)
(-)
Citrus nobilis
(+)
(-)
(-)
Petroselium sativum
Perejil
0.09%
Citrus limetta
Lima
0.10%
Citrus paradisii
Toronja
0.20%
Citrus nobilis
Mandarina
0.27%
Citrus aurantium
(+)
(-)
(-)
Citrus aurantium
Naranja
0.33%
Cymbopgon citratus
(+)
(-)
(-)
Cymbopgon citratus
Paja Cedrón
0.40%
Satureja boliviana
(-)
(+)
(-)
Satureja boliviana
Khoa
0.45%
Rosmarinus oficinalis
Romero
0.55%
Rosmarinus oficinalis
(+)
(-)
(-)
Schinus molla
Molle
0.72%
Schinus molle
(+)
(+)
(-)
1 Staphylococcus aureus: 2 Shigella flexneri: 3 Escherichia coli
GRAFICO No 1
(V/P)*100
0.80% 070%
0.60%-1--0-50 %------
El Pelroseoum salivum
^'Olms limalla
110 lrus paradisii
El Olmo nobilis
Olma aurantium
^mlwpgan cilratus
-Solurele boliviana
Rosmarinus oficinalis
1 Scbinus molla
0.40%-1--0.30 %
0.20%
0.00%-I,
Rendimiento
Especies vegetales
CREMA
GRAMON BOLIVIA
LTDA
Av. Ecuador 2387 esq. Waldo Ballivián (Sopocachi)
Teléfonos: 410215 - 411762 Fax: 411762 Casilla 1998
La Paz - Bolivia
Vol.
VII
-
Diciembre
de
1999
,,:.
FLORES, VELASCO, FIGUEROA, GIMENEZ.
TABLA No 3.- RESULTADOS DE CIM Y CBM DE LOS ACEITES ESENCIALES
1
Nombre científico
2
Petroselium sativum
CIM 3,7 mg/ml
CMB 3,7 mg/ml
Satureja boliviana
CIM 7,5 mg/ml
CMB 30 mg/ml
Schinus molle
1 Staphylococcus aureus
CIM 15 mg/mI
CIB 3,7 mg/ml
CMB 15 mg/ml
CMB 15 mg/ml
2 Shigella flexneri
TABLA NO 4.- RESULTADOS DE LA ACTIVIDAD ANTIFÚNGICA DE LOS ACEITES.
Neurospora crassa
C. albicans
Nombre científico
1,0 mg/mI
0,5 mg/mI
0,25 mg/ml
1,0 mg/mI
Petroselium sativum
()
(+)
()
()
Citrus limetta
+
Citrus paradisii
(+)
O
O
()
Citrus nobilis
(+}
{)
O
{)
Citrus aurantium
(+)
{)
()
()
Cymbopgon citratus
(+)
()
()
()
Satureja boliviana
(+)
(+)
()
()
Rosmarinus oficinalis
(}
()
()
()
Schinus molle
{+)
(+)
{}
(}
BIBLIOGRAFÍA
1.- FERNAROLI, Giovanni."Sostance Aromatiche
Natturali", Ed. Ulrico Hoepli; Milan 1963
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Universidad San Marcos; Lima, 1984
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sobre Extracción Supercríticas de Productos Naturales,
UNICAMP-CAMPINAS, Brasil, 1994.
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Normalización de Esencias", Programa Agroquímico
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Aceites Esenciales Extraídos de Especies Vegetales
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11.- RETAMAR, Juan. "Curso Sobre Aceites Esenciales"
Primera Parte, FCPN-UMSA, 1993.
5.- LOCK DE UGAZ, Olga."Investigación Fitoquímica",
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Segunda Parte, FCPN-UMSA, 1993.
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Antifúngicas para Productos Naturales" IIFB-UMSA, 1998.
15.- KONEMAN W. Elmer. "Diagnóstico Microbiológico"
3ra. Ed. Panamericana, 1992.
GRANULADOS
FOSCAL TABLETAS
El recalcificante de 1 ra. elección
LABORATORIOS ALFA Ltda.
ELTRIANGULO DE LA CALIDAD
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