AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS – UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS PROGRAMA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTÁ 2009 AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL GÉNERO Salmonella EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS – UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS TRABAJO DE GRADO Presentado como requisito parcial Para Optar el Título de Microbiólogo Agrícola y Veterinario PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA FACULTAD DE CIENCIAS BASICAS PROGRAMA PROFESIONAL DE MICROBÍOLOGIA AGRÍCOLA Y VETERINARIA BOGOTÁ D.C. 2009 2 NOTA DE ADVERTENCIA “La Universidad no se hace responsable por los conceptos emitidos por sus alumnos en sus trabajos de tesis. Solo velará porque no se publique nada contrario al dogma y a la moral católica y porque las tesis no contengan ataques personales contra persona alguna, antes bien se vea en ellas el anhelo de buscar la verdad y la justicia” Artículo 23 de la Resolución Nº 13 de Julio de 1946 3 AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL GÉNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS – UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META DIANA ALEXANDRA PACHON CUBILLOS APROBADO ______________________________ ______________________________ Bact. MS.c. Adriana Pulido Villamarín MV. Carlos Alfonso Moreno Torres Director. Revisor Consultor Pontificia Universidad Javeriana. Universidad Nacional de Colombia ______________________________ ______________________________ MV. MS.c. Rubiela Castañeda Salazar Biol. PhD. Julio Mario Hoyos Hoyos Jurado Jurado Pontificia Universidad Javeriana. Pontificia Universidad Javeriana. 4 AISLAMIENTO, IDENTIFICACIÓN Y SEROTIPIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS DEL GÉNERO Salmonella sp. EN UNA POBLACIÓN DE Crocodylus intermedius Y TESTUDINOS MANTENIDOS EN CAUTIVERIO EN LA ESTACIÓN DE BIOLOGIA TROPICAL ROBERTO FRANCO E.B.T.R.B DE LA FACULTAD DE CIENCIAS – UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA EN VILLAVICENCIO – META DIANA ALEXANDRA PACHÓN CUBILLOS APROBADO ______________________________ _____________________________ INGRID SCHULER., Ph.D Bact. M.SC., M Ed. Janeth Arias P. Decana Académica Directora Facultad de Ciencias Carreras de Microbiología 5 A Dios por llenarme de bendiciones cada día y llevarme de su mano por el camino que me permitirá alcanzar todos mis objetivos. A mi madre por ser el mayor ejemplo de fortaleza, constancia, dedicación y superación; por todo su esfuerzo para que juntas alcanzáramos esta meta, por su confianza y dedicación y por haberme hecho el ser humano que soy ahora. A mi padre por que desde el cielo me ha acompañado durante todos estos años, por su ejemplo de entereza, sabiduría y fortaleza. A mi hermano por su apoyo, confianza y compañía durante todos los años de mi vida, a mi abuelita por estar siempre a mi lado haciendo de mi un ser humano fuerte y perseverante, a mi sobrinito por ser la luz de mi vida. A Javier por acompañarme durante todo este proceso, brindándome apoyo en los momentos difíciles y por infundirme paciencia cuando creí que esto no sería posible. 6 AGRADECIMIENTOS A la Dra. Adriana Pulido Villamarín, por haberme dado la confianza para la realización de este proyecto, por su dedicación, compromiso y apoyo incondicional, aportando todos sus conocimientos para la realización de este trabajo. Al Dr. Carlos Moreno Torres por el aporte de sus conocimientos y constancia para concluir con éxito este trabajo. Al laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia, a su directora Dra. Judith Figueroa Ramírez y Dra. Derly Fierro Toscano por haberme dado la oportunidad de trabajar en sus instalaciones, ya que sin su colaboración esto no hubiera sido posible. Agradecimiento especial a Becton Dickinson LTDA por la dotación de medios de cultivo, kit de identificación y sensidiscos. A todo el personal de la Estación de Biología Tropical Roberto Franco por toda su colaboración y especialmente a su directora profesora María Cristina Ardila por sus aportes al trabajo. ENERO DE 2009 7 TABLA DE CONTENIDOS Página 1. INTRODUCCIÓN 17 2. MARCO TEÓRICO 19 2.1. FAMILIA ENTEROBACTERIACEAE 19 2.2. GÉNERO Salmonella 20 2.2.1. Caracterización morfológica y bioquímica 21 2.2.2. Clasificación taxonómica 22 2.2.3. Estructura Antigénica 22 2.2.4. Factores de virulencia 24 2.2.5. Patogénesis y patogenicidad 24 2.2.6. Salmonelosis 27 2.2.7. Diagnóstico 27 2.2.7.1. Métodos de aislamiento de Salmonella sp. 28 2.2.7.2. Identificación bioquímica 34 2.2.7.2.1. Diagnóstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp. 35 2.2.7.3. Serotipificación 37 2.2.7.3.1. Esquema de Kauffmann - White 38 2.2.8. 39 Sensibilidad Frente a agentes antimicrobianos 2.2.8.1. Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos 40 2.2.8.2. Pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos 41 2.2.8.2.1. Principios del método de difusión en agar (Kirby-Bauer) 41 2.2.8.2.2. Interpretación de pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión en agar. 42 2.2.8.2.3. Selección de los agentes antimicrobianos 42 2.3. EL GÉNERO Salmonella sp. ASOCIADO A LOS REPTILES 43 2.4. ESPECIES EN ESTUDIO 47 2.4.1. Caimán del Orinoco (Crocodylus intermedius) 47 2.4.2. Testudinos 48 2.4.3. Bacterias asociadas a enfermedades en reptiles 49 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACIÓN 51 3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 51 3.2 JUSTIFICACIÓN 52 4. OBJETIVOS 53 4.1 53 OBJETIVO GENERAL 8 viii Página 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS 53 5. MÉTODOLOGÍA 54 5.1. ÁREA DE ESTUDIO 54 5.2. POBLACIÓN MUESTRAL 54 5.3. TOMA DE MUESTRAS 54 5.3.1. Obtención de muestras por hisopado cloacal 56 5.3.2. Muestreo de agua y sedimento de los estanques 57 5.3.3. Muestreo de arena y materia fecal de los estanques 58 5.4. FASE ANALÍTICA 59 5.4.1. Aislamiento e identificación de Salmonella sp. 59 5.4.1.1. Pre enriquecimiento no selectivo 59 5.4.1.2. Enriquecimiento selectivo 59 5.4.1.3. Aislamiento primario en medio selectivo y diferencial 59 5.4.1.4. Identificación bioquímica 63 5.4.1.5. Serotipificación 63 5.4.1.6. Prueba de susceptibilidad a antibióticos 64 6. RESULTADOS Y DISCUSION 66 6.1. ANÁLISIS DE DATOS 66 6.2. IDENTIFICACIÓN DE MICROORGANISMOS DEL GÉNERO Salmonella sp. POR TÉCNICA BBL CRYSTAL 6.3. ® 66 POSITIVIDAD A Salmonella sp. EN ESTANQUES DE CROCODYLIA Y TESTUDINEA 67 6.4. PRESENCIA DE Salmonella sp. SEGÚN LA ESPECIE 69 6.5. AISLAMIENTOS DE Salmonella sp. SEGÚN EL TIPO DE MUESTRA PARA EJEMPLARES DE CROCODYLIA Y TESTUDINOS 6.5.1. 71 Aislamientos de Salmonella sp. en estanques de Crocodylia según grupos etáreos 74 6.6. SEROTIPIFICACIÓN 75 6.7. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIMICROBIANOS 77 6.8. MICROORGANISMOS DIFERENTES A Salmonella sp. AISLADOS EN LOS ESTANQUES DE LA ESTACIÓN 80 7. CONCLUSIONES 85 8. RECOMENDACIONES 86 9. REFERENCIAS 87 10. ANEXOS 106 9 ix ÍNDICE DE TABLAS Página Tabla Nº 1. Propiedades bioquímicas diferenciales de las subespecies de Salmonella sp. 34 Tabla Nº 2. Resultados de las pruebas bioquímicas clave para la identificación de microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. 37 Tabla Nº 3: Especies de Crocodylia y Testudines muestreadas y número de cepas de Salmonella sp. aisladas para cada especie según estanques muestreados 55 Tabla Nº 4: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Testudinata frente a los antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer 77 Tabla Nº 5: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer. 10x 78 INDICE DE FIGURAS Página Figura Nº 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia 46 Figura Nº 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudinos 46 Figura Nº 3. Caimán del Orinoco o Caimán Llanero (C. intermedius) 48 Figura Nº 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la E.B.T.R.F 49 Figura Nº 5. Toma de muestras: hisopados cloacales en Testudinos. 56 Figura Nº 6. Muestreo de ejemplares neonatos de Crocodylus intermedius mediante hisopado cloacal. 57 Figura Nº 7. Muestreo de agua y sedimento de los estanques. 58 Figura Nº 7A y 7B. Muestreo en los estanques de Crocodylia neonatos y Testudinos 58 Figura Nº 7C Muestreo en estanques de Crocodylia Adultos y Juveniles 58 Figura Nº 8. Muestreo de arena y materia fecal encontrada en los encierros de los animales en estudio. 59 Figura Nº 9. Identificación de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios de cultivo selectivos. 60 Figura Nº 9 A. CRHOMagar Orientación 60 Figura Nº 9 B. Agar MacConkey 60 Figura Nº 10. Características morfológicas de las enterobacterias del género Salmonella sp. aisladas en los medios de cultivo diferenciales. 61 Figura Nº 10 A. CHROMagar Salmonella. 61 Figura Nº 10 B. Agar Hektoen Entérico. 61 Figura Nº 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en las muestras. 62 Figura Nº 11 A. Figura Nº 11 B. Figura Nº 11 C. Figura Nº 11 D. Figura Nº 11 E. 62 62 62 62 62 Staphylococcus saprophyticus. Escherichia coli. Enterococcus sp. Klebsiella sp. Citrobacter sp. xi 11 Página ® Figura Nº 12. Lectura de pruebas de identificación Crystal para microorganismos entéricos/no fermentadores. 63 Figura Nº 12 A. Identificación a partir de agua y sedimento del estanque de Testudinos número 21. 63 Figura Nº 12 B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimán neonato en el estanque número 47 63 Figura Nº 13. Esquema de una lámina hemoclasificadora utilizada para la serotipificación de las cepas de Salmonella sp. y modo en que se empleó. 64 Figura Nº 14. Antibiograma 65 Figura Nº 15. Porcentaje de presentación de Salmonella sp. en los estanques de la E.B.T.R.F. 67 Figura Nº 16. Estanques de Tortugas positivos y negativos a Salmonella sp. 69 Figura Nº 17. Estanques de C. intermedius positivos y negativos a Salmonella sp. en la E.B.T.R.F. 70 Figura Nº 18. Aislamiento de Salmonella sp. según el origen de la muestra en Testudinea 72 Figura Nº 19. Aislamiento de Salmonella sp. según el origen de la muestra en estanques de C. intermedius 72 Figura Nº 20. Porcentaje de aislamientos positivos a Salmonella sp. en los estanques de Crocodylia según los grupos etáreos. 74 Figura Nº 21. Serotipificación de Salmonella sp. aislada en la E.B.T.R.F 76 Figura Nº 22. Pruebas de Sensibilidad a antimicrobianos 78 Figura Nº 23. Microorganismos diferentes a Salmonella sp aislados en los estanques de C. intermedius y Testudinos de la E.B.T.R.F 80 Figura Nº 24. Microorganismos aislados las muestras de agua y sedimento en los estanques de Testudinea muestreados 81 Figura Nº 25. Microorganismos aislados en las muestras de arena y materia fecal en los estanques de Testudinea muestreados 81 Figura Nº 26: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados cloacales de ejemplares de Testudinata muestreados 82 Figura Nº 27: Microorganismos aislados en las muestars de agua y sedimento de los estanques de C. intermedius muestreados 82 Figura Nº 28: Microorganismos aislados en las muestras de arena y materia fecal halladas en los estanques de C. intermedius muestreados 83 12 xii Figura Nº 29: Microorganismos aislados en las muestras de hisopados cloacales de ejemplares de C. intermedius muestreados. 13 xiii 83 ÍNDICE DE ANEXOS Página ANEXO N º 1. Plano de la E.B.T.R.F 106 ANEXO Nº 2. Apariencia de los microorganismos en CHROMagar Orientación 107 ANEXO Nº 3. Sistema de Identificación BBL Crystal para Entericos/No Fermentadores. 108 Anexo 3.1. Procedimiento para la identificación de los microorganismos por sistema BBL Crystal. 108 Anexo 3.2. Ficha técnica de reacciones de color para lectura de resultados. 109 Anexo 3.3. Calculo del número de perfil 109 ANEXO Nº 4. Esquema de Kauffmann – White 110 ANEXO Nº 5. Interpretación de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos 112 ANEXO Nº 6. Resultados obtenidos por estanque en cada muestreo. 114 14 xiv RESUMEN Durante mucho tiempo las enterobacterias pertenecientes al género Salmonella han sido reportadas como patógenos para humanos y animales tanto domésticos como silvestres; aunque también hacen parte de la flora normal intestinal de reptiles, especialmente de tortugas. La Estación de Biología Tropical Roberto Franco de la Universidad Nacional de Colombia, ubicada en la ciudad de Villavicencio, lidera el programa de recuperación del Caimán Llanero (Crocodylus intermedius) que se encuentra en inminente peligro de extinción y además cuenta con una colección viva de Testudinos de diferentes géneros. Con el fin de evidenciar la presencia del enteropatógeno en la Estación, se procedió a aislar microorganismos del género Salmonella a partir de muestras de origen ambiental y cloacal de las especies allí encontradas, utilizando la metodología microbiológica estándar; posteriormente se procedió a serotipificar los aislamientos por el método convencional de Kauffmann-White especialmente a nivel de antígeno somático y finalmente se realizó la prueba de sensibilidad a antimicrobianos para cada cepa encontrada en la Estación. Los resultados reportan una prevalencia del 52% de Salmonella sp. en el total de la población muestreada, con una mayor positividad a partir de muestras de agua/sedimento y las pruebas de sensibilidad a antimicrobianos determinaron que el 100% de los aislamientos fueron sensibles a la norfloxacina. Teniendo en cuenta que microorganismos del serogrupo C2 fueron los más prevalentes (41,4%) y conscientes del riesgo zoonótico se dio inicio a la implementación de un manual de bioseguridad para la estación y así prevenir todo riesgo para la población animal y humana. Los resultados obtenidos fortalecerán programas de sanidad animal que pretenden garantizar la salud de los ejemplares y realizar nuevas investigaciones de patogenia, nutrición, etología y genética. 15 ABSTRACT Salmonella sp. has been reported as pathogens for human and animals domestic as wild; in spite of being part of the normal intestinal flora of reptiles especially of turtles. The Estación de Biología Tropical Roberto Franco located in the city of Villavicencio is part of the Universidad Nacional de Colombia, and it leads the program of recovery of the Caiman Llanero (Crocodylus intermedius), which is in imminent extinction danger and also bill with an alive collection of Testudinos of different families. With the purpose of evidencing the presence of the enteropathogen, we proceeded to isolate microorganisms of the gender Salmonella sp. starting from samples of environmental and cloacae origin using the standard methodology; we proceeded to serotyping the isolations for the conventional method of Kaufmann-White and finally we did an antimicrobial susceptibility test for each strain found in the Estación. Results reports a prevalence of 52% of Salmonella sp in the population sampled with a bigger detection starting from samples of water/silt. Antimicrobial susceptibility test could determine than 100% of the isolates were sensible to norfloxacine. Knowing that microorganism of serogroup C2 were the most prevalent (41,4%) and aware of the zoonotic risk we begin to the implementation of a biosecurity manual for the Estacion and this way to prevent all risk for the animal and human population. Results going to strength programs of animal sanity that seek to guarantee the health of the animals and to carry out new in investigation in pathology, nutrition, etiology and genetics. 16 1. INTRODUCCIÓN Los miembros del género Salmonella están ampliamente distribuidos en la naturaleza, se encuentran como comensales y patógenos en el tracto gastrointestinal de mamíferos domésticos y salvajes, reptiles, aves e insectos, causando un amplio espectro de enfermedades en sus hospederos, considerándose como la principal enterobacteria de importancia en salud pública (Selbitz et al.,1995. Turnbull, 1979). Para el caso de Latinoamérica y especialmente para Colombia la investigación acerca de microorganismos pertenecientes al género Salmonella se ha centrado en relación con las enfermedades trasmitidas por agua y por alimentos (ETA) y es poco lo que se ha investigado con respecto a la transmisión por reptiles donde esta enterobacteria hace parte de la flora intestinal normal; a pesar que las autoridades reguladoras del medio ambiente reconocen el problema zoonótico que representan las especies silvestres frente a la población humana, las investigaciones en el área biológica y veterinaria son insuficientes (Hernández, 2004) Los reptiles frecuentemente son portadores asintomáticos de Salmonella sp. y por consiguiente, los casos clínicos de salmonelosis son reportados con menor frecuencia (Ramsay, et al, 2002). Sin embargo, numerosos estudios han asociado la bacteria con altos niveles de mortalidad en serpientes y tortugas, y a su vez, un gran porcentaje de investigaciones han implicado la herpetofauna en la transmisión de Salmonella sp. hacia los humanos, lo cual permite establecer la capacidad de generar procesos de infecciones zoonóticas y la importancia de la bacteria a nivel de salud pública (Saelinger y Lewbart, 2006). De manera natural los reptiles son susceptibles a enfermedades que contribuyen a la disminución de las poblaciones; aunque en la mayoría de los casos se desconoce la acción patógena de los microorganismos sobre estas especies silvestres, ignorándose el impacto que tienen las enfermedades bacterianas sobre las mismas, así como el tratamiento ideal para combatir los signos producidos (Mader, 1996). Sin embargo, es de vital importancia tener en cuenta que la presencia de éste tipo de endopatógenos no se asocia necesariamente con estados de enfermedad (Lax, et al., 1995). Desde el punto de vista profiláctico, la susceptibilidad a patologías causadas por enterobacterias en reptiles se relaciona con estados de depresión en el animal, que pueden producirce a causa del estrés por el cautiverio, alteración en temperaturas medioambientales, el número de microorganismos presentes, edad, estado nutricional del animal, entre otras (Mader, 1996). Los resultados asociados a este tipo de condiciones son la afección de tejidos y fluidos por generar un bloqueo de los vasos sanguíneos, edema, ulceraciones, necrosis, 17 disminución de actividad, pérdida de peso progresiva, anorexia, polifagia, regurgitación, diarrea, constipación y letargia. (Jertborn et al 1990). Estudios sobre Salmonella sp. en especies silvestres demuestran que su presencia es constante, pero se deben conocer las serovariedades implicadas y la sensibilidad que tienen tanto animales cautivos como salvajes para ser afectados por el microorganismo con el fin de minimizar los posibles inconvenientes que se pueden presentar en los programas de recuperación debido a enfermedades asociadas al enteropatógeno; además, parece ser que en los centros donde los reptiles están en condiciones de cautividad, hay más posibilidad de aislamiento de esta bacteria que en estado libre et al., 2002). (Ramsay La Estación de Biología Tropical Roberto Franco, es el centro de recuperación de especies silvestres en vía de extinción más importante en el país, ha demostrado una excelente gestión en el manejo de estas poblaciones logrando así minimizar los riegos de extinción de las especies; es una entidad encaminada al cuidado y recuperación de ejemplares de Crocodylus intermedius (Caimán Llanero) y Testudines llevando a cabo investigaciones en el ámbito de salud, nutrición y reproducción que permiten la repoblación de estos ejemplares; sin embargo, las condiciones ex situ de los animales producen estados de inmunosupresión donde microorganismos patógenos como Salmonella sp. pueden llegar a colonizar generando cuadros de enfermedad en los individuos; con base en ello, es necesario tener en cuenta que el conocimiento de la microbiología entérica de estas especies es fundamental para diagnosticar desórdenes en la flora digestiva así como para prevenir infecciones secundarias, todo ello dirigido a optimizar los respectivos programas de conservación de estas especies silvestres (Saelinger y Lewbart, 2006) Mediante la realización de este estudio se pretende llevar a cabo un análisis sobre la condición de los animales de Orden Crocodylia y Orden Testudinea cautivos en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco dependencia de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia, en la ciudad de Villavicencio, debido a que de acuerdo con las listas oficiales de especies amenazadas publicadas por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN), son las especies de vertebrados más amenazados en Colombia (Min. Medio Ambiente, 2002). Para tal fin, se llevará a cabo el aislamiento e identificación de enterobacterias del género Salmonella, estableciendo los serogrupos que predominan en dichas especies, identificados mediante pruebas serológicas, para posteriormente reconocer su valor zoonótico y finalmente lograr con la investigación hacer un aporte sustancial en cuanto a los riesgos biológicos y epidemiológicos de importancia en salud pública dentro de la Estación y asimismo, promover la preservación de la fauna nativa que se encuentra en peligro de extinción. 18 2. MARCO TEÓRICO 2.1. Familia Enterobacteriaceae La familia Enterobacteriaceae (bacterias entéricas), pertenece al orden XIII Enterobacteriales. Según la segunda edición 2001 del Manual Bergey de Bacteriología Sistemática, está conformada por 41 géneros y más de 100 especies (Quinn et al., 2002), aunque menos de la mitad tienen interés desde el punto de vista veterinario (Stanchi, 2007). Su hábitat natural es el intestino y muchos de estos microorganismos provocan enfermedades tanto en los animales productores de alimentos (diarrea de los recién nacidos y salmonelosis), como en los animales de compañía (infecciones y abscesos del tracto urinario) y en el hombre (Biberstein, y Chung Zee, 1990). Esta familia incluye géneros de gran importancia a nivel epidemiológico como son Escherichia coli, Shigella sp., Salmonella sp, Enterobacter sp., Klebsiella sp., Serratia sp., Proteus sp., Citrobacter sp., Edwarsiella sp., Yesinia sp., Morganella sp., y Arizona sp. entre otras (Jawetz, et al, 2005). Los microorganismos de esta familia son parecidos en cuanto a su morfología y caracteres tintoriales por ser bacilos pleomórficos Gram negativos y asporógenos de un tamaño de 2 – 3 µm por 0,4 – 0,6 µm, catalasa positivos y oxidasa negativo, por carecer de citocromo c, lo cual es una propiedad bioquímica útil en el aspecto diagnóstico de la familia (Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990). Los representantes de este grupo de microorganismos son anaerobios facultativos; en condiciones anaerobias, su crecimiento depende de que en el medio existan carbohidratos como fuente de carbono; en aerobiosis, la gama de sustratos apropiados para su crecimiento incluye ácidos orgánicos, aminoácidos y carbohidratos (Biberstein y Chung Zee, 1990). Mediante observación microscópica resulta difícil diferenciar los representantes de un determinado género de los pertenecientes a los demás géneros. Son clave para el diagnóstico los productos resultantes de la fermentación de azúcares; casi todos los microorganismos de este grupo fermentan la glucosa a ácido pirúvico por la vía de Embden Meyerhoff (glicolisis); fermentan la D-glucosa a menudo con producción de gas, reducen los nitratos a nitritos y poseen un contenido de DNA del 39 al 59% de guanina mas citosina (G+C), algunos poseen cápsula (Stanchi, 2007; Biberstein y Chung Zee, 1990). Las propiedades que definen a la familia deben ponerse en evidencia para afirmar que la cepa es una enterobacteria. A partir de ahí se realiza la identificación, fundamentalmente por las características bioquímicas para estudiar el metabolismo proteico (presencia de ureasa, producción de indol, degradación del triptófano), el metabolismo glucosídico (fermentación de azúcares: glucosa, lactosa, sacarosa, etc.), la capacidad de utilizar el citrato como única fuente de carbono, la presencia de enzimas descarboxilasa y 19 desaminasas y la producción de hidrógeno sulfurado, entre las características más importantes (Biberstein y Chung Zee, 1990). Las Enterobacterias pueden comportarse como apatógenas, patógenas oportunistas y patógenas importantes. Las primeras, pueden encontrarse como contaminantes de muestras clínicas, siendo aisladas del ambiente y/o materia fecal, como es el caso de Hafnia; las enterobacterias patógenas oportunistas ocasionalmente producen enfermedad a nivel del tracto digestivo, mientras que las patógenas importantes pueden causar daños entéricos y sistémicos, por poseer una estructura antigénica compleja y producir varias toxinas y otros factores de virulencia (Baümler et al. 1998, Muñoz et al, 2002, Biberstein y Chung Zee, 1990). 2.2. El Género Salmonella El género Salmonella recibe su nombre en honor al microbiólogo americano Daniel Elmer Salmon (1850-1914), quien en 1876 fue reconocido como el primer doctor en medicina veterinaria graduado en una universidad de los Estados Unidos. Junto a Theobald Smith (1859-1934), conocido por su trabajo con anafilaxis, fueron quienes descubrieron los gérmenes designados como salmonelas, en 1885, aislándolos de cerdos con cólera (Stanchi, 2007) Salmonella sp. es la enterobacteria de mayor importancia a nivel de salud pública por producir trastornos del tracto gastrointestinal y septicemia no solo en el ser humano, sino en todas las especies animales (Selbitz et al; 1995; Turnbull, 1979, Lujan y Blas, 2007) Los microorganismos del género Salmonella están extensamente diseminados en la naturaleza como comensales y como patógenos del aparato digestivo de los mamíferos domésticos y silvestres, aves, reptiles e insectos, en los cuales pueden llegar a producir una amplia gama de enfermedades. Todas las salmonelas son potencialmente patógenas (Stanchi 2007; Smith et al. 1952; Mahajan et al. 2003) al ser parásitos intracelulares y por medio de los macrófagos en los que se encuentran, se diseminan por todo el organismo afectado aprovechando la vía linfática y sanguínea (Smith et al. 1952; Suter, 1956; Stanchi, 2007). En medicina humana están descritas diversas presentaciones de salmonelosis: fiebre entérica, septicemia, y finalmente gastroenteritis; mientras tanto, en medicina veterinaria se ha determinado que esta bacteria puede provocar septicemia, enteritis aguda, subaguda y crónica, y abortos en diferentes especies animales (Stanchi, 2007). Las diversas especies de salmonelas se transmiten por contacto tanto con enfermos como con portadores sanos, aunque por lo general la enfermedad producida por este agente microbiano tiene un origen alimentario debido a la ingesta de alimentos contaminados 20 con el patógeno, teniendo en cuenta que la fuente de contaminación ambiental es invariablemente la materia fecal (Stanchi 2007 ; Smith et al. 1952; CDC. 2007). 2.2.1 Caracterización morfológica y bioquímica Los miembros del género Salmonella son bacilos Gram-negativos, de 0,7-1,5 x 2,0-5µm, no fermentadores de lactosa, anaerobios facultativos, no esporulados (Terragno et al, 2003); generalmente móviles por flagelos perítricos con la excepción de Salmonella gallinarum y Salmonella pullorum, responsables de la tifoidea aviar y pullorosis respectivamente (Stanchi 2007, Terragno et al, 2003). Poseen metabolismo fermentativo y oxidativo; fermentan glucosa con producción de ácido y gas (excepto S. typhi), también fermentan L-arabinosa, maltosa, D-manitol, Dmanosa, L-ramnosa, Dsorbitol, trehalosa, D-xilosa y D-dulcitol (Terragno et al, 2003). Son oxidasa negativo, catalasa positivo, indol y Voges- Proskauer (VP) negativo, rojo de metilo y citrato de Simmons positivo, producen H 2S, son urea negativo, lisina ornitina y (Terragno et al, 2003). descarboxilasa positivo Entre otras características bioquímicas se encuentran la reducción de nitratos a nitritos, no desaminan la fenilalanina y son tetrationato reductasa (Jawetz, et al, 2005). Las salmonelas se multiplican bien en medios ordinarios, las colonias post incubación o por 18 a 24 horas a 32 C son de 2 a 3 mm de diámetro salvo algunos serotipos que producen colonias pequeñas; con algunas excepciones no presentan cápsula 1952; Suter 1956). (Smith et al. Los miembros del género Salmonella crecen en un amplio rango de o temperaturas (7 - 28 C), el rango de pH ideal para su crecimiento es entre 6,6 y 8,2; son incapaces de tolerar altas concentraciones de sal y sobreviven en agua congelada durante periodos prolongados (Jawetz et al. 2005). Los criterios para la identificación bioquímica de Salmonella sp. son relativamente estándar, sin embargo puede haber variaciones en los medios de cultivo y algunas pruebas bioquímicas, por lo cual como alternativa se están introduciendo cada vez más los métodos moleculares que permiten un diagnóstico más rápido y pueden ser más simples de realizar, pero tienen como desventaja que son de costo elevado 2003). 21 (Terragno et al, 2.2.2. Clasificación taxonómica La más reciente clasificación del género Salmonella está basada en estudios realizados sobre la base de técnicas de hibridación del DNA de la bacteria y se ha concluido que éste está conformado por dos especies: 1) Salmonella enterica, dividida en seis subespecies aisladas de: a. Subepecie I. S. enterica subsp. enterica: Humanos y Animales de sangre caliente b. Subespecie II. S. enterica subsp. salamae: Animales de sangre fría y del ambiente. c. Subsespecie III a. S. enterica subsp. arizonae: Animales de sangre fría y del ambiente. d. Subespecie III b: S. enterica subsp. diarizonae. Animales de sangre fría y del ambiente. e. Subespecie IV. S. enterica subsp. houtenae. Animales de sangre fría y del ambiente. f. Subespecie VI. S. enterica subsp. indica. Animales de sangre fría y del ambiente. 2) Salmonella bongori. Subespecie V: No constituye un patógeno para los humanos, pero si ha sido implicada en ciertas patologías en animales (Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y Weill; 2007; Stanchi 2007; Farmer 2003 y Terragno et al 2003) Es de suma importancia aclarar que, aunque existan solo dos especies de salmonelas según su hibridación de DNA, tanto las especies como las subespecies mencionadas se encuentran constituidas por más de 2400 variedades serológicas, determinadas según las distintas asociaciones de los antígenos somáticos O y flagelares H (Stanchi, 2007). También puede hacerse una clasificación de las salmonelas desde el punto de vista epidemiológico en tres grupos: 1) Sin ninguna afinidad por hospedador 2) Afectan únicamente al ser humano 3) Adaptadas a un hospedador animal únicamente (Stanchi 2007; Terragno et al 2003). 2.2.3. Estructura antigénica La estructura antigénica de Salmonella sp. es similar a la de otras enterobacterias, contando con la presencia de dos clases de antígenos principales: Antígenos O (somáticos) y Antígenos H (flagelares). En algunas cepas se encuentra un tercer tipo de Antígeno de superficie, análogo funcionalmente a los Antígenos K (capsulares) de otros 22 géneros. Al estar este antígeno relacionado con la virulencia de las cepas se le denomina Antígeno Vi (Koneman y Allen. 1999), que puede interferir con la aglutinación por antisueros O y que se relacionan con invasividad a. (Jawetz et al, 2005). Ag Somático (O de pared celular): Es un polisacárido, termostable, tipoespecifico, que se halla en todas las especies (Stanchi 2007). Se distinguen dos clases: mayores (determinantes del serogrupo) y menores (se hallan en algunas Salmonelas y serogrupos de éstas), son compartidos por diferentes serovares y no determinan los serogrupos (Stanchi 2007), aunque existen numerosos antígenos O, son los factores O principales los que sirven para caracterizar los diferentes tipos antigénicos. (Por ejemplo O4: se refiere al grupo B, O9: Grupo D, entre otros) al. 2002). (Muñoz et El complejo de antígenos O determina el subgrupo somático al que pertenecen los géneros de Salmonella, sp., Arizona sp., Citrobacter sp., Escherichia sp., Providencia spp. Serratia sp. entre otros (Bayley b. y Schott, 1982). Ag Flagelar (H): Es proteico y termolábil, constituido por flagelina, cuya composición en aminoácidos es constante para un tipo antigénico determinado y Schott, 1982). (Bayley Por lo general, los microorganismos que tienen este antígeno, poseen dos fases diferenciables por medio de aglutinación en tubo de ensayo Terragno et al, 2003); (Stanchi 2007; y esto depende de dos genes estructurales que corresponden a la fase 1 y a la fase 2 que hacen referencia a estados motiles y no motiles de la bacteria. En el primer caso (H1), lo más relevante es que se trata de un Ag específico de especie (según Kauffmann y White) y su síntesis reside en el gen hag1, que sólo se expresa durante las primeras 24 h del crecimiento, en lo que se refiere al H2, es compartido por varias especies de Salmonella y el gen que codifica para su producción es el Hag2, el cmismo que se manifiesta a partir de las 24 h posteriores al inicio del desarrollo. La mayoría de las cepas del género Salmonella pueden expresar las dos especificidades de su antígeno H (difásicos), sin embargo existen algunas que logran expresar solamente uno (monofásicos) (Parra et al. 2002). Cada Salmonella sp. expresa alternativamente estos dos tipos de antígenos mediante un mecanismo denominado “cambio de fase” (Quinn et al., 2002, Smith et al., 1952). c. Ag capsular (K): Es un antígeno termolábil aunque existen pocas excepciones (Bayley y Schott, 1982); es llamado en Salmonella el Ag (Vi), que protege a la bacteria dándole resistencia antifagocìtica. La presencia de este antígeno hace imposible la aglutinación de sueros anti O, debido a que recubre toda la bacteria; en este caso, o la cepa en estudio debe ser sometida a un calentamiento a 100 C durante 30 23 minutos, a fin de desnaturalizar dicha cubierta y luego poder realizar la prueba de aglutinación con el Ag somático correspondiente (Stanchi 2007; Terragno et al, 2003). De allí que la expresión de este factor depende de al menos dos genes (ViA + ViB), siendo necesario que existan los dos en la bacteria para que la expresión tenga lugar (Parra et al. 2002). 2.2.4. Factores de virulencia Para Salmonella sp. se conocen varios factores de virulencia, uno de ellos es la producción de al menos tres toxinas: las enterotoxinas que son sustancias liberadas al intestino y que ocasionan síntomas gastrointestinales como cólico y diarrea, las endotoxinas que hacen parte de la membrana externa de la bacteria y cuya actividad biológica está asociada con los lipopolisacáridos (LPS) y por último, las citotoxinas que están asociadas con la superficie celular, las cuales inhiben la síntesis proteica en la célula hospedadora y pueden estar implicadas en la adherencia a las células epiteliales, constituyendo esta última un segundo factor de virulencia de Salmonella sp.(Madigan et al 1997; Salyers y Whitt 2002). También se ha descrito en algunas subespecies de Salmonella (S. typhimurium) la formación de pseudópodos en la célula hospedera, lo que trae como resultado la internalización de la bacteria en vesículas endocíticas; adicionalmente, la producción de adhesinas que incluyen fimbrias codificadas por el plásmido de virulencia pSLT, permiten la unión de la bacteria a las microvellosidades de los enterocitos, fimbrias polares largas que se encargan de la unión de la bacteria a las placas de Peyer, y las fimbrias agregativas delgadas llamadas curli que también pueden estar implicadas en la unión a las vellosidades de los enterocitos (Madigan et al 1997, Salyers y Whitt 2002). Otros factores relacionados con la adherencia son los polisacáridos de superficie celular (O) y el antígeno Vi, un polisacárido capsular compuesto de ácido N-acetilglucosaminurónico el cual ayuda a prevenir la fagocitosis y puede proteger la bacteria de las formas reactivas de oxígeno al interior de los fagocitos, las cepas negativas para el antígeno Vi son menos infecciosas y virulentas que las positivas para este antígeno (Parry et al. 2002). La respuesta de tolerancia al ácido, es otro aspecto importante de la virulencia de Salmonella sp. lo que le permite a la bacteria atravesar el ambiente ácido del estómago, requisito necesario para la infección (Salyers y Whitt 2002). 2.2.5. Patogénesis y patogenicidad Todos los serotipos de Salmonella sp. conocidos son patogénicos para el hombre y los animales (Parker y Collier, 1990). La virulencia de la bacteria se relaciona con su capacidad de invadir las células hospedadoras, replicarse en su interior y resistir tanto la digestión por 24 los fagocitos como la destrucción por la acción del complemento, lo cual facilita la difusión de las salmonelas en el organismo del hospedador (Henrici 1999, Quinn et al. 2002; Smith et al., 1952). El complejo proceso de invasión es mediado por los productos de la expresión de varios genes cromosómicos, mientras que la capacidad de crecer en el interior de las células hospedadoras depende de la presencia de plásmidos de virulencia 1952. y Quinn et al, 2002). (Vadillo et al 2002, Smith et al Algunos factores que determinan el carácter patógeno de ciertas especies del género Salmonella se conocen, al menos parcialmente, y se encuadran en las que se denominan genéricamente Islas de Patogenicidad (o grupos de genes relacionados con la virulencia) que se encuentran en organismos patógenos pero que están ausentes o solo presentes de forma esporádica en las especies saprófitas (Vadillo et al 2002; Terragno et al 2003). La Salmonella sp. cuenta con 5 islas de patogenicicidad, tres de ellas conteniendo genes de virulencia (Salyers y Whitt, 2002): § Isla SPI1: Contiene genes inv responsables de la internalización de las células, estos genes así como otros de la misma isla de patogenicidad (spa, prg y org) codifican para un sistema de secreción tipo III; también contienen genes que codifican proteínas que son inyectadas en la célula eucariótica por este tipo de sistema de secreción, como por ejemplo el gen sptP que codifica para una tirosina fosfatasa que altera las señales de transducción en células de la mucosa, produciendo diarrea. De igual forma posee genes involucrados en la regulación de genes de virulencia (hila, invF, sira y phoPQ), algunos de los cuales controlan la expresión de genes localizados en otras partes del cromosoma de la bacteria. Los genes contenidos en esta isla parecen ser importantes en las etapas iniciales de la infección en la cual las bacterias invaden las células de la mucosa. § Isla SPI2: Codifica un sistema de secreción tipo III, diferente al codificado por la isla SPI1, usado por la bacteria al interior del fagosoma para evitar la fusión fagosoma-lisosoma; también codifica las proteínas que inyecta a la célula eucariótica. Esta isla de patogenicidad parece tener mayor importancia en la fase sistémica de la infección. § Isla SPI3: Codifica un trasportador de Mg 2+ de alta afinidad, el cual puede ser de importancia en la supervivencia de la célula al interior de fagosomas. No codifica sistema de secreción. § Islas SPI4 y SPI5: No se conoce su función, no codifican sistemas de secreción. 25 Las células blanco revisten el último tramo del intestino delgado y el primer tramo del intestino grueso; si la célula blanco está “libre” con respecto al número de salmonelas, es posible que se produzca una enfermedad. Los microorganismos del género Salmonella segregan exotoxinas, las cuales una vez ha tenido lugar la adherencia, determinan que la enfermedad generada sea diarreica o septicémica. Las cepas que producen diarrea se multiplican, segregan una toxina semejante a la toxina LT (termolábil) que altera la síntesis de los nucleótidos cíclicos, haciendo que el microorganismo invada la célula, ya en el interior, las Salmonelas segregan la citotoxina que provoca la muerte celular y su desprendimiento de la mucosa intestinal, desencadenando un flujo de iones y líquido hacia la luz intestinal, lo que a su vez ocasiona diarrea. (Hirsh 2006, Biberstein y Chung Zee, 1990) gravedad de la enfermedad depende del número de células blanco afectadas Newman 1982, y Biberstein y Chung Zee 1990). Aproximadamente 10 7 La (Blaser y organismos viables son requeridos normalmente para el inicio de una gastroenteritis en humanos; en animales, se desconoce la dosis infectiva pero depende de la especie (Blaser y Newman 1982); en animales, los síntomas de la enfermedad son dolor abdominal y diarrea acompañada de señales de muerte celular (sangre, restos de células y células inflamatorias) (Biberstein y Chung Zee 1990). Adicionalmente, es posible que las cepas que producen septicemia provoquen o no diarrea, destrucción de las células blanco, o ambas cosas. La acción de la enterotoxina se basa en la interrupción de la síntesis de proteínas provocando la muerte celular (Biberstein y Chung Zee 1990). Los síntomas que se presentan, aunque no siempre, suelen ser septicemia y shock; las cepas que producen esta forma clínica de enfermedad eluden la destrucción por parte del hospedador y se multiplican en el interior de los macrófagos del hígado, bazo y también en el interior de los vasos sanguíneos (Hinton, 1971). Su destrucción en la corriente sanguínea se encuentra obstaculizada en parte por las unidades repetitivas del antígeno O del LPS, posiblemente porque se impide la unión entre el complejo de ataque a la membrana del sistema del complemento y la membrana externa de la bacteria (Barrow y Lovely 1991). Las cepas de Salmonella sp. son relativamente hidrófilas, debido en parte a la fracción de carbohidratos del LPS que provoca su repulsión de la membrana de las células fagocitarias, la cual es relativamente hidrófoba; las salmonelas que son fagocitadas no son destruidas fácilmente porque en el animal el contenido de los lisosomas del macrófago no atacará con facilidad a las salmonelas que se encuentran en el interior del fagosoma, debido a que las bacterias sintetizan enzimas que tienen la capacidad de 26 neutralizar las que son producidas por el fagosoma Quinn et al (Blaser y Newman 1982, Biberstein y Chung Zee 1990 y 2002). La multiplicación del microorganismo origina una endotoxemia, la cual explica la mayoría de los síntomas y el curso de la enfermedad (Stanchi, 2007). 2.2.6. Salmonelosis Constituye un grupo de infecciones producidas por microorganismos del género Salmonella sp. adquiridas por la ingestión de alimentos o bebidas contaminadas y caracterizadas por presentar síndromes febriles gastrointestinales sistémicas, con frecuencia severas asociados (Saravia 2008). a manifestaciones Las manifestaciones clínicas de las salmonelosis en humanos y animales se presentan básicamente bajo tres modalidades las denominadas fiebres entéricas, entre las cuales la más común es la fiebre tifoidea producida por la S. typhi, las gastroenteritis producidas por varias subespecies y la forma septicémica, caracterizada por la bacteremia asociada a lesiones focales (Saravia 2008). Dentro de las manifestaciones clínicas comunes está la fiebre acompañada de dolor abdominal, evacuaciones intestinales líquidas frecuentes, de aspecto verdoso, fétidas, mucoides y en ocasiones con estrías de sangre (Saravia 2008, Report, 1989,1993). 2.2.7. Diagnóstico Existe un gran número de métodos diagnósticos diferentes que pueden realizarse para la determinación de Salmonella sp., sin embargo, según la mayor parte de estudios realizados, el cultivo microbiológico es la prueba más comúnmente empleada para el aislamiento de la bacteria a partir de tejidos y excrementos. El método ideal debe tener una alta sensibilidad y especificidad, y ser al mismo tiempo simple, rápido y económico. Ningún método cumple con todos los criterios y ninguno es óptimo para todas las condiciones, dado que pueden presentarse alteraciones en los medios de cultivo y algunas pruebas bioquímicas; por lo tanto es aconsejable apoyarse también en los nuevos métodos de diagnóstico que están innovando para el aislamiento de Salmonella sp. mediante el uso de pruebas serológicas y moleculares como ELISA y PCR respectivamente; esta última tiene la capacidad de detectar un pequeño número de 2 organismos del género Salmonella (10 4 a 10 ). Estos métodos arrojan resultados favorables y confiables en menos tiempo, pero tienen la desventaja de ser costosos (Ward et al 2005 y Terragno et al 2003). Ante la sospecha de salmonelosis, el material que debe remitirse al laboratorio es variado: se enviará en caso de infección intestinal, muestra de heces; en enfermedad sistémica, se recoge una muestra de sangre para realizar un cultivo estándar Chung Zee, 1990 y Stanchi 2007). (Biberstein y Además, es posible determinar la contaminación de alimentos y 27 agua con esta enterobacteria, para lo cual se requiere la remisión de una muestra al laboratorio para ser analizada convenientemente (Stanchi 2007); el diagnóstico incluye aislamiento, identificación bioquímica y serotipificación de las cepas aisladas (Stanchi 2007, Luna 1991). 2.2.7.1. Métodos para el aislamiento de Salmonella sp. Los métodos para el aislamiento de la bacteria están divididos en tres etapas sucesivas las cuales son: (1) Enriquecimiento No Selectivo, (2) Enriquecimiento Selectivo, (3) Siembra en Placa con medios sólidos selectivos y diferenciales. Posteriormente se lleva a cabo el estudio de las características Bioquímicas de las colonias sospechosas en los medios adecuados para su identificación, y finalmente el Análisis Antigénico (Luna, 1991). 1) Preenriquecimiento en medio no selectivo: Se utiliza cuando la muestra en estudio ha sufrido un proceso de desecación o irradiación, cuando ha estado congelada por mucho tiempo o si el pH del medio es muy bajo, este tratamiento puede determinar que las bacterias presentes en la muestra se encuentren en un estado semilatente y tiene como finalidad la revitalización de los microorganismos afectados por las diferentes condiciones de tratamientos industriales o de almacenamiento, permitiendo que las células bacterianas comiencen el proceso de multiplicación normal sin estar expuestas a sustancias inhibidoras o selectivas que puedan llegar a ser tóxicas para estas bacterias “debilitadas”, sustancias que si están presentes en los medios selectivos de enriquecimiento. Se realiza en caldo peptonado bufferado o lactosado al 0,2%, para incrementar la recuperación de especies de salmonelas deterioradas por técnicas de elaboración, preservación, preservantes, presión osmótica alta, cambios bruscos de pH, etc. (Luna 1991; Hurtado 2001). 2) Medios de enriquecimiento selectivo: Se realiza en caldos de enriquecimiento, los cuales estimulan el crecimiento de formas compatibles con Salmonella sp, e inhiben el desarrollo de bacterias intestinales y coliformes. Entre los caldos mayormente usados para el enriquecimiento selectivo de Salmonella sp. se encuentran: · Caldo selenito: En el medio de cultivo, la peptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable y el mecanismo de acción del selenito, es inhibir el crecimiento de bacterias intestinales, coliformes y Enterococos, principalmente en las primeras 6 a 12 horas de incubación. Salmonella sp., Proteus sp., y Pseudomona sp., no son inhibidos 1994). 28 (Merck, · Caldo Rappaport - Vassiliadis: Medio para el enriquecimiento selectivo de salmonelas con excepción de S. typhi y S. paratyphi A, en alimentos y otros materiales. Mediante la utilización de este caldo, es posible obtener algunas ventajas sobre otros medios nutritivos de enriquecimiento, obteniéndose un o rendimiento de alrededor del 100%, especialmente a una temperatura de 43 C y previo enriquecimiento (Van Schothorst et al, 2004). El medio cuenta con una baja concentración de verde de malaquita, cloruro de magnesio, y harina de soya para así obtener un mayor porcentaje de recuperación de Salmonella sp. Además la reducción del pH a 5,2 mejora la selectividad (Trichopoulos 1972; Iveson 1964). · Caldo tetrationato: Medio que junto con el tiosulfato excedente, inhibe de igual forma coliformes y otras bacterias acompañantes, sin alterar las bacterias reductoras de tetrationato como Salmonella sp. y Proteus sp. Adicionalmente, las sales biliares que contiene inhiben considerablemente a todos los microorganismos de presencia obligatoria en el intestino (Palumbo y Alford, 1970) · Caldo de enriquecimiento Gram negativos (GN) según Hajna: Favorece la recuperación de los organismos Gram negativos, especialmente Shigella y Salmonella sp., pues en su composición tiene triptona que actúa como nutriente en el medio, citrato y desoxicolato de sodio, con acción bactericida para organismos Gram positivos, especialmente Estreptococos fecales, todo tipo de bacilos esporulantes e inhiben el desarrollo de coliformes. Los fosfatos sirven de buffer, evitando la acidificación precoz del medio de cultivo a cargo de productos metabólicos ácidos. Adicionalmente, la elevada concentración de manitol sobre la dextrosa ayuda a limitar el crecimiento de Proteus y acelera el de Shigella y Salmonella sp. (Hurtado, 2001) Es necesario tener en cuenta que el caldo de enriquecimiento usado puede afectar la recuperación de algunos serotipos de Salmonella sp., por ejemplo, ciertos serotipos pueden ser inhibidos por el tetrationato si el inóculo es pequeño (S. paratyphi A, S. houten, S. uccle, S. luton, S. gallinarum, S. meleagridis y S. treforest, entre otras)(Van Schothorst, et al, 1977). 3) Medios de cultivo selectivos y diferenciales § Medios de cultivo selectivos: Son aquellos que permiten seleccionar ciertos microorganismos deteniendo el desarrollo de otros; esto se logra con el agregado de sustancias inhibidoras como antibióticos, ciertos colorantes, sales biliares, etc. Los medios EMB (a), MacConkey (b), desoxicolato (c) o CHROMagar Orientación (d), permiten detectar con rapidez los microorganismos No fermentadores de 29 lactosa como Salmonella sp. y Shigella sp. El agente inhibidor en estos medios son sales biliares (Stanchi, 2007). a. Agar eosina azul de metileno (EMB), permite demostrar la presencia de enterobacterias patógenas y propiciar su aislamiento, sin embargo, no es confirmativo, solo permite una orientación al diagnóstico. El modo de acción del medio se basa en que sus componentes lactosa y sacarosa permiten diferenciar las enterobacterias de acuerdo con su capacidad de fermentarlos y por el aspecto y el color de sus colonias. Los colorantes empleados inhiben notablemente el desarrollo de gérmenes Gram Positivos. Las colonias de Salmonella sp. se observan en el medio incoloras o con tonalidad ambar (Bonnie, 2001). b. Agar MacConkey (McK), las sales biliares y el cristal violeta ejercen una inhibición significativa sobre las bacterias Gram Positivas. La lactosa y el indicador rojo neutro permiten comprobar la degradación de ese disacárido; las colonias lactosa positivas (Escherichia coli) aparecen rojas con halo turbio; las lactosa negativas (Salmonella spp.) son incoloras (Stanchi, 2007). c. Agar desoxicolato, es un medio altamente selectivo por ser el desoxicolato sódico supresor del crecimiento de coliformes y Gram positivos. Las colonias típicas de la Salmonella sp. son pequeñas, incoloras, elevadas y opacas; algunas cepas producen precipitado negro en el centro (Stanchi, 2007). d. TM BD BBL CHROMagar TM ® Orientacion : Medio de cultivo para el aislamiento e identificación de patógenos del tracto urinario. Pemite la identificación de Escherichia coli, Enterococcus, grupos KES (Klebsiella - Enterobacter . Serratia) y PMP (Proteus – Morganella - Providencia), Staphylococcus saprophyticus y Streptococcus agalactiae aunque requiere de pruebas confirmatorias. Algunos de estos microorganismos producen enzimas para el metabolismo de lactosa, glucósidos o ambos. Otros organismos no producen ningún tipo de enzima, por ejemplo E. coli contiene enzimas para el metabolismo de lactosa pero es β glucosidasa negativo; algunos miembros de la familia Enterobacteriacea, como Salmonella sp. y algunos cocos Gram positivos son β glucosidasa positivo pero no poseen las enzimas para la fermentación de la lactosa. Adicionalmente, la enzima triptófano deaminasa es típicamente encontrada en el grupo PMP. El medio contiene sustratos cromógenos que pemiten la diferenciación de los microorganismos mediante la degradación de enzimas especificas de cada uno (Bonnie, 2001; ISO, 2002) (Anexo Nº 2). 30 § Medios de cultivo diferenciales: Permiten diferenciar bioquímicamente las bacterias por su actividad metabólica. Poseen un sustrato, sobre el cual actúa o no la bacteria, y esa actividad se revela por variación del pH del medio o por alguna actividad enzimática que modifica su aspecto. En el proceso de recuperación de Salmonella sp., los aislamientos sospechosos por ser No fermentadores de lactosa en el Medio Selectivo, son sembrados en medios diferenciales que permiten la observación de colonias características y propias de la bacteria (Stanchi, 2007). Los medios más reconocidos para el aislamiento de Salmonella sp. son: a. Agar Hektoen entérico: Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para la demostración y aislamiento de bacterias intestinales patógenas, a partir de los más diversos materiales tales como heces y alimentos entre otros (Merck, 1994). Las colonias del género Salmonella se desarrollan con producción de ácido sulfhídrico (H2S) y un halo trasparente alrededor dando características de un “ojo de pescado” Murray y Shea 2004). (Merck,1994 , Frente a otros medios de cultivo selectivos, el agar para enterobacterias Hektoen aún cuando posee suficiente efecto supresor de la flora acompañante, ejerce escasa inhibición de Salmonella sp. y Shigella sp. y por lo tanto, permite la obtención de altos rendimientos en estos gérmenes (King y Meztger 1968, Taylor y Schelhart 1971). Debido a los dos indicadores, Azul de bromotimol y Fucsina ácida, las colonias lactosa-positivas muestran una expresiva diferencia cromática frente a las colonias lactosa negativas; de igual forma ocurre en el caso de colonias que fermentan lentamente la lactosa y más fácilmente la sacarosa y la salicina, sustancias reaccionantes fácilmente fermentables, lo que impide hallazgos de patógenos falsamente positivos. La combinación de tiosulfato, como sustancia reaccionante y una sal de hierro como indicador, da una coloración negra a las colonias H 2S positivas. Una mezcla de sales biliares inhibe la flora acompañante (Merck,1994, Murray y Shea 2004). b. Agar xilosa lisina desoxicolato (XLD): Medio para el aislamiento y diferenciación de enterobacteriáceas patógenas, especialmente especies de Shigella sp. y Salmonella sp. El efecto inhibidor de este medio de cultivo es débil; el desoxicolato genera la inhibición de bacterias coliformes y permite la dispersión de cepas de Proteus que puede llegar a confundirse con las colonias producidas por Salmonella; adicionalmente, la diferenciación entre Salmonella sp. y Shigella sp. se da porque la primera produce fermentación de Xilosa, descarboxilación de Lisina y genera ácido sulfhídrico (Hurtado, 2001). La forma de acción del medio se basa en que la degradación a ácido de la xilosa, lactosa y sacarosa produce un viraje del medio a amarillo, por 31 el indicador rojo de fenol. El tiosulfato y la sal de hierro, revelan la formación de ácido sulfhídrico por la precipitación de sulfuro de hierro (negro) en las colonias. Las bacterias que descarboxilan la lisina, se reconocen por la presencia de un color rojo – purpúreo, debido al aumento del pH alrededor de sus colonias 2004). (Merck,1994, Murray y Shea Varias de estas reacciones pueden presentarse simultáneamente o suscesivamente, lo que puede dar lugar a diversos matices de color del indicador de pH, ó a un viraje de amarillo a rojo en el transcurso de una incubación más prolongada. Las colonias de Salmonella sp. se observan con pigmentación rosa o roja, algunas veces transparentes con o sin centro negro y/o completamente negras (Murray y Shea 2004). Las colonias sospechosas de Shigella son transparentes y del mismo color que el medio de cultivo. Este género bacteriano al no fermentar la xilosa, la lactosa ni la sacarosa, no da lugar a que vire a amarillo el rojo fenol; como tampoco decarboxilan la lisina, no se produce color rojo púrpura alrededor de las colonias, al no haberse producido cadaverina c. (Murray y Shea 2004). Agar Salmonella – Shigella (SS): Es un medio selectivo y diferencial. La selectividad está dada por las sales biliares y el verde brillante, que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas, de la mayoría de coliformes y el desarrollo invasor del Proteus sp. Es diferencial debido a la fermentación de la lactosa y la formación de ácido sulfhídrico a partir del tiosulfato de sodio. Salmonella sp, desarrolla colonias traslúcidas ocasionalmente opacas, algunas con centro negro a causa de la producción de ácido sulfhídrico (Meljem, 1995, Murray y Shea 2004). ). Las colonias sospechosas de Shigella son transparentes, translúcidas u opacas y suelen ser lisas (Murray y Shea 2004). d. Agar verde brillante: Medio de enriquecimiento altamente selectivo y diferencial para el aislamiento de enterobacterias patógenas como Salmonella sp. a excepción de S. enterica serovar typhi y paratyphi A. En el medio la pluripeptona y el extracto de levadura, constituyen la fuente de nitrógeno, vitaminas y minerales. La lactosa y la sacarosa son los hidratos de carbono fermentables, el rojo de fenol es el indicador de pH, que vira a amarillo cuando hay producción de acido a partir de la fermentación de azúcares; el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico y el verde brillante actúa como agente selectivo. Las colonias de Salmonella sp. se observan con coloración rosa, blanca o transparente sobre un fondo rojo (Murray y Shea, 2004) e. Agar bismuto sulfito: Es un medio diferencial y selectivo, usado para el aislamiento e identificación de Salmonella enterica serovar typhi y otras bacterias entéricas. El medio contiene peptona y tejidos animales, extracto de carne, glucosa, sulfato férrico y sulfito bismuto que actúa como inhibidor de la mayoría de organismos 32 comensales. Las colonias típicas de Salmonella sp. pueden ser café, gris o negras con o sin brillo metálico, generalmente el medio circundante (halo) es café que posteriormente se torna negro; algunas cepas producen colonias verdes sin la formación del halo oscuro (Murray y Shea 2004). f. AGAR XLT4 ® tm (DIFCO ): Medio de cultivo selectivo y diferencial empleado para el aislamiento e identificación de microorganismos del género Salmonella excepto S. enterica serovar typhi (Dush y Altwegg, 1955). El medio contiene peptona como fuente de nitrógeno, extracto de levadura como fuente de vitaminas y otros cofactores; la diferenciación de Salmonella sp. de otros microorganismos se basa en la fermentación de la xilosa, lactosa y sucrosa; decarboxilación de la lisina y la producción de sulfuro de hidrógeno, la cual es detectada por la adición de iones férricos. Por su parte, el tiosulfato de sodio es adicionado al medio como fuente de sulfuro inorgánico, el cloruro de sodio mantiene el balance osmótico del medio y el rojo fenol es adicionado como indicador de los cambios de pH resultantes de las reacciones de fermentación y decarboxilación. Al medio base, es adicionado suplemento de agar XLT4, con el fin de inhibir el crecimiento de organismos diferentes a la Salmonella sp. Las colonias típicas de la bacteria (H2S positivas), aparecen negras o con tonalidad amarilla con centro negro después de 18 – 24 horas de incubación. A medida que pasa el tiempo, las colonias se recubren de pigmento negro por completo o toman una tonalidad rosada hacia la periferia, con centro negro; las colonias de Salmonella sp. de las cepas H2S negativas, aparecen de color Rosado amarillento. Por su parte, la mayoría de las colonias de Citrobacter sp. que crecen en este medio son amarillas sin evidencia de ennegrecimiento. El crecimiento de Enterobacter aerogenes, Escherichia coli, Proteus, Pseudomona, Providencia, Alteromonas putrefaciens, Yersinia enterocolitica y Acinetobacter calcoaceticus está completamente inhibido, mientras que las especies de Shigella son parcialmente inhibidas; las colonias que aparecen son de tonalidad roja (Becton Dickinson). g. TM BD BBL CHROMagar TM ® Salmonella : Es un medio selectivo y diferencial para el aislamiento e identificación presuntiva de especies de Salmonella sp, permitiendo la diferenciación de la enterobacteria de la flora acompañante dada la presencia de sustratos cromógenos en el medio. Los organismos Gram positivos son inhibidos como resultado de un medio base selectivo; adicionalmente cuenta con un agente antifúngico que previene el crecimiento de especies de Candida; otros agentes antimicrobianos presentes en el medio de cultivo inhiben el crecimiento de Gram negativos, microorganismos no fermentadores de lactosa y especies de Proteus. Debido a diferencias metabólicas en la presencia de cromógenos seleccionados, las 33 colonias de Salmonella sp. se observan de color rosa – púrpura, mientras que los microorganismos pertenecientes a otros géneros se observan con pigmento verde – azulado, ó son completamente inhibidos 2.2.7.2. (Gaillot, et al; 1999) Identificación bioquímica Los microorganismos para crecer requieren de polimerización de proteínas, ácidos nucléicos, polisacáridos y lípidos; estos elementos deben encontrarse preformados en el medio donde se encuentra el microorganismo o deben ser sintetizados por la propia célula. Para realizar el metabolismo se requiere además la maquinaria biosintética para transformar los substratos en materiales básicos o compuestos utilizables para la célula, y la energía para realizar las reacciones químicas (Escobar, 2004). En la identificación final de Salmonella sp. las colonias sospechosas observadas en el medio de cultivo diferencial se someten a pruebas de reacción bioquímica con el fin confirmar la presencia de la bacteria. En general a Salmonella sp. se le realiza un conjunto de pruebas que incluyen producción de indol, rojo de metilo, Voges- Proskauer, Citrato, TSI, hidrólisis de la urea, deaminación de la fenilalanina, decarboxilación de lisina, arginina y ornitina, motilidad, hidrólisis de gelatina, utilización de malonato, fermentación de glucosa con producción de acido y gas, fermentación de lactosa, sacarosa, manitol, dulcitol, salicina, adonitol, inositol, sorbitol, arabinosa, rafinosa, maltosa, xilosa, trehalosa, celobiosa, eritritol, hidrolisis de esculina, fermentación de melibiosa, de arabitol, de glicerol, utilización de acetato, lipasa, ADNasa, transformación nitrato-nitrito, oxidasa y fermentación de manosa (Farmer, 2003, Forbes et al, 1998). (Tabla 1). Tabla Nº 1. Propiedades Bioquímicas Diferenciales de las Subespecies de Salmonella sp. Fuente: Instituto Nacional de Salud. 2003. d d d 34 2.2.7.2.1. A. Diagnóstico presuntivo de la presencia de Salmonella sp. Pruebas bioquímicas: En la tabla Nº 2 es posible observar las reacciones producidas en la batería de bioquímicas utilizada normalmente para la identificación de enterobacterias pertenecientes al género Salmonella (Koneman y Allen, 1999), la cual consta de las pruebas descritas a continuación: TSI (triple azúcar hierro): es un agar diferencial basado en la fermentación de azúcares y la producción de H2S y gas. Contiene glucosa, sacarosa y lactosa; estas últimas en una concentración 10 veces mayor a la glucosa. El indicador de pH es el rojo de fenol, el cual vira a amarillo por formación de ácido a partir del carbohidrato, el sulfato ferroso es un detector de la producción de ácido sulfhídrico. Por lo general Salmonella sp. da como resultado de esta prueba una reacción alcalina/acido con producción de H 2S que se ++ evidencia por el fondo negro del tubo (K/A H2S ); en ocasiones, como resultado de la fermentación de glucosa también hay producción de gas (Instituto Nacional de Salud, 2003, MacFaddin, 2000). LIA (agar lisina hierro): El fundamento de esta prueba es que los procesos de decarboxilación y deaminación en el medio de cultivo tienen lugar con la previa fermentación del carbohidrato que contiene el medio (glucosa) y la acidez producida por esta reacción, si el microorganismo posee las descarboxilasas necesarias, se produce la decarboxilación liberándose como producto final las aminas que alcalinizan el medio de cultivo, por otro lado si el microorganismo posee las deaminasas se efectúa la deaminación y el producto final son ácidos orgánicos que acidifican el medio de cultivo. Salmonella sp. por lo general da como resultado tendido púrpura y fondo púrpura, (K/K), con producción de H2S y gas, es decir, posee la enzima lisina-decarboxilasa (Instituto Nacional de Salud, 2003). Utilización del citrato: El principio de esta prueba es determinar la capacidad de los organismos para usar el citrato de sodio como fuente de carbono para el metabolismo y el crecimiento. El medio contiene fosfato sódico de amonio, fosfato de monopotasio, sulfato de magnesio, citrato de sodio y azul de bromotimol como indicador de pH. Si el carbono del citrato de sodio es utilizado, el nitrógeno también es extraído del fosfato de amonio contenido en el medio, liberando amonio, lo cual alcaliniza el medio que vira de verde a azul. Salmonella sp. por lo general utiliza el citrato como fuente de carbono, por lo cual se produce una variación en el color del medio 35 (Koneman et al, 1997; Farmer, 2003). Producción de indol: Esta prueba se desarrolla para determinar si la bacteria en estudio está en capacidad de desdoblar el indol de la molécula de triptófano; el indol es uno de los componentes de la degradación metabólica del aminoácido triptófano. Las bacterias que poseen la triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptófano con producción de indol, ácido pirúvico y amoniaco. La prueba se basa en la formación de un complejo rojo cuando el indol reacciona con el grupo aldehído del p- dimetilaminobenzaldehido. Este es el principio activo de los reactivos de Kovacs y Ehrlich, utilizados para la identificación de producción de indol por parte de los microorganismos. Salmonella sp. no tiene la capacidad de generar el indol por lo cual no se presenta ninguna reacción en el medio (MacFaddin 2000). Prueba de motilidad: Sirve para determinar si un organismo es móvil o inmóvil. La movilidad de las bacterias es consecuencia de la presencia de flagelos que se encuentran principalmente entre los bacilos, aunque algunas formas de cocos son móviles. Esta prueba es llevada a cabo en un medio de cultivo semisólido (SIM), donde a su vez es evaluada la producción de indol y de ácido sulfhídrico por los microorganismos. Las bacterias móviles producirán un enturbiamiento homogéneo del medio debido a la distribución aleatoria de los microorganismos. Por el contrario las bacterias inmóviles permanecerán en la misma picadura donde se sembraron 2000). (MacFaddin, La mayoría de las salmonelas son motiles a excepción de S. pullorum y S. gallinarum, huéspedes específicas de aves, responsables además de las enfermedades pulorosis y tifoidea aviar respectivamente (Infante et al, 1991). Hidrólisis de urea: La urea es un compuesto orgánico nitrogenado que es transformado por algunos microorganismos, los cuales producen la enzima ureasa. Como resultado de esta actividad microbiana, el nitrógeno es liberado en forma inorgánica como moléculas de amoniaco. Cuando esta reacción ocurre, el medio de cultivo se alcaliniza y el indicador de pH permite percibir visualmente el cambio de coloración en el medio debido a la acidificación producida en el mismo. Salmonella sp.no tiene la capacidad de hidrolizar la urea, por lo tanto la prueba es negativa. Esta prueba se considera vital en la diferenciación bioquímica entre Salmonella sp. y Proteus sp. (MacFaddin, 2000). 36 Tabla Nº 2. Resultados de las pruebas bioquímicas clave para la identificación de microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. Fuente: Manual de pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica PRUEBA BIOQUIMICA B. (MacFaddin 2000) RESULTADO PARA Salmonella sp. ++ TSI K/A H2S LIA K/K H2S ++ UREA - MOTILIDAD + INDOL - CITRATO + ® Sistemas BBL Crystal de identificación (Patógenos entéricos/No fermentantes) : El sistema de identificación BBL Crystal de bacterias entéricas/no fermentadoras (E/NF) ® sirve para lel reconocimiento de bacterias gram negativas que pertenecen a la familia Enterobacteriaceae así como también de los bacilos Gram negativos fermentadores y no fermentadores de glucosa aislados con más frecuencia (Muytjens et al, 1984). ® Los análisis utilizados en el sistema BBL Crystal E/NF están basados en la utilización y degradación de sustratos específicos por parte de los microorganismos detectados por distintos sistemas indicadores. Las reacciones de fermentación detectan la capacidad de un aislado para metabolizar los carbohidratos en ausencia de oxígeno atmosférico, y las reacciones de oxidación están basadas en la capacidad de un organismo para metabolizar el sustrato siendo el oxígeno el aceptor final de electrones, ambas reacciones se detectan normalmente mediante el uso de un indicador de pH en el sustrato del análisis (Murray et al, 1999). Los sustratos cromógenos al sufrir hidrólisis producen cambios de color que pueden ser detectados visualmente. Además, existen otros análisis que detectan la capacidad de un organismo para hidrolizar, degradar, reducir o utilizar de otro modo un sustrato en el sistema BBL Crystal 2.2.7.3. ® (Manafi et al, 1991). (Anexo Nº 3) Serotipificación La serotipificación constituye un importante complemento de la identificación bioquímica y desde el punto de vista epidemiológico permite determinar la prevalencia de una serovariedad en distintas zonas geográficas, también es de utilidad para el estudio de brotes y para conocer la fuente de infección y las vías de transmisión (Terragno et al, 2003). Desde el punto de vista genético, el género Salmonella sp. constituye una sola especie siendo el grupo más complejo de la familia Enterobacteriaceae Crawford et al, 1971) (Biberstein y Chung Zee, 1990; dado que los representantes del género Salmonella sp. han sido objeto de 37 sucesivas modificaciones, a través de los años, en lo que respecta a su nomenclatura y taxonomía. Sin embargo, todavía siguen vigentes las ideas desarrolladas por Edwards y Ewing, en la década del 40, cuando definieron e identificaron las primeras cepas del género Salmonella y de otros miembros de la familia Enterobacteriaceae (Stanchi, 2007). Las técnicas serológicas son comúnmente empleadas para identificar cultivos desconocidos con sueros conocidos (Smith et al.1952); Salmonella sp. está serotipificada de acuerdo a sus antígenos somáticos de superficie (LPS, antígenos O), antígenos flagelares (proteínas, antígenos H) y antígeno capsular (Vi) (Terragno et al, 2003). Los antígenos se identifican con anticuerpos monovalentes y polivalentes disponibles comercialmente, mediante pruebas de aglutinación en lámina. Para identificar los antígenos O, se hace una prueba con antisueros contra los grupos del O1 (A) al O67, luego se prueba el antisuero Vi para antígeno capsular, y por último se incluyen los antisueros contra los antígenos flagelares H (Farmer 2003, Brooks et al., 2000, Forbes et al., 1998, Jawetz et al .2005, Smith et al.1952). En el género Salmonella existe un solo tipo capsular, el tipo Vi (de virulencia), aunque la mayoría de las salmonelas no producen cápsula (Hirsh 2006). La constitución antigénica de la fracción polisacarídica del lipopolisacarido (LPS) define en gran parte la especie; asímismo, la clase y el número de azúcares junto con los enlaces existentes entre los mismos, definen los determinantes antigénicos que contienen los antígenos O de un determinado aislamiento; dichos antígenos O, junto con los determinantes antigénicos existentes en la superficie de los flagelos (antígenos H), que poseen la mayoría de las salmonelas, contribuyen, desde el punto de vista serológico, a definir como especie un determinado aislamiento. Este esquema de clasificación se le denomina de KauffmannWhite (Biberstein y Chung Zee, 1990) 2.2.7.3.1. Esquema de Kauffmann – White La identificación de los serotipos sobre la combinación antigénica está dada en el “Esquema de Kauffmann-White”, publicado por el Centro Colaborador de la Organización Mundial de la Salud (OMS) de Referencia e Investigación de Salmonella del Instituto Pasteur en Paris el cual agrupa todas las serovariedades de Salmonella sp. conocidas (Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y Weill; 2007) (Anexo Nº 4). Ambos investigadores diseñaron su clasificación considerando ciertas determinantes antigénicas presentes en el AgO, que determinan la existencia de grupos o serogrupos -de la A a la I- y a los antígenos flagelares en fase 1, que hoy en día establecen el serotipo 2007). 38 (Popoff y Le Minor, 1992; Grimont y Weill; Este esquema plantea las diferencias mediante la identificación de los antígenos de superficie que se producen en la bacteria. La especificidad del factor “O” (somático) de Salmonella sp. se determina por la composición y la estructura de la cadena polisacárida O del lipopolisacárido. Al antígeno O, se lo designa con números; Salmonella sp. se clasifica en serogrupos que surgen del antígeno somático O; a estos grupos se los designa con letras mayúsculas, por ejemplo, A, B, C 1, C2, D1, D2, E1, E2, etc. al.,1996). (Basualdo et El antígeno flagelar representado por letras minúsculas y números, caracteriza a los serotipos dentro de cada grupo, rara vez se hace referencia al antígeno Vi que es asociado a la cápsula bacteriana. 2.2.8. Sensibilidad frente a agentes antimicrobianos Los agentes antimicrobianos evalúan las diferencias de estructura o de función bioquímica existentes entre el hospedador y el parásito (Biberstein y Chung Zee, 1990). Durante los últimos 25 años, la investigación quimioterapéutica se ha centrado fundamentalmente alrededor de las sustancias antibacteriales de origen microbiano llamadas antibióticos (Jawetz et al., 2005); los cuales son compuestos químicos producidos por microorganismos, que inhiben o matan otros microorganismos (Escobar, 2004). Sin embargo, es de tener presente que ningún agente químico antimicrobiano tiene la capacidad para actuar eficazmente sobre todo tipo de microorganismos, debido a la diferente actividad del químico y las variadas características de sensibilidad y resistencia que presenta cada bacteria, ante la sustancia (Escobar, 2004). La selectividad se explica por las diferencias estructurales y bioquímicas entre las células eucariotas y procariotas (Gentilini 2007); lo cual ofrece mayor oportunidad para que, en comparación con los agentes antifúngicos, los agentes antibacterianos manifiesten su toxicidad selectiva ya que las células fúngicas, al igual que en mamíferos, son eucariotas (Prescott 1988). Los mecanismos de acción de los agentes antimicrobianos se encuadran en cuatro tipos; (1) Inhibición de la Síntesis de Pared, (2) Alteración de la función de la Membrana celular, (3) Inhibición de la Síntesis o de la Función del Ácido Nucléico y (4), Inhibición de la Síntesis de Proteínas (Prescott, 1988). Sin embargo, el antibiótico ideal empleado con fin terapéuticos, debe reunir una serie de condiciones. a. Tener una toxicidad selectiva para el agente infeccioso, lo que implica escasa o nula toxicidad para las células del huésped y alta para el patógeno. b. Penetrar en los tejidos y las células del organismo para ejercer su acción sobre el agente infeccioso. 39 c. Alcanzar la concentración adecuada para ejercer su efecto en el foco de la infección y que se excrete lentamente. d. Poseer una acción más bactericida que bacteriostática. Los agentes bactericidas matan a los microorganismos, y los bacteriostáticos inhiben el desarrollo, interviniendo los mecanismos de defensa del huésped en la erradicación final de la infección. e. No alterar los mecanismos de defensa naturales del hospedador (fagocitosis, producción de anticuerpos, entre otros). f. No generar aparición rápida de resistencia. g. Poseer un amplio espectro de acción sobre los microorganismos que con mayor frecuencia se aíslan. h. Permanecer activo en presencia de plasma, líquidos corporales, exudados. i. Poseer actividad antibacteriana in vitro. j. Ser estable para garantizar un periodo razonable de almacenamiento. k. Ser económicamente accesibles. l. No producir efectos colaterales indeseables en el huésped (Stanchi, 2007). 2.2.8.1. Resistencia de los microorganismos a los antimicrobianos. El desarrollo de cepas resistentes hace necesaria la determinación de la susceptibilidad a los antimicrobianos de aislamientos provenientes de muestras biológicas. Esta se lleva a cabo mediante pruebas in vitro de susceptibilidad, que permiten seleccionar los quimioterapéuticos según la sensibilidad demostrada por el microorganismo causal (Gentinili et al, 2002). Los métodos empleados, son entre otros, la difusión con monodiscos de antibióticos, método estandarizado por Kirby-Bauer, en el cual se emplea el agar Mueller Hinton, único medio validado por el NCCLS (Comité Nacional para la Normatización de Laboratorios Clínicos) para la prueba de susceptibilidad antimicrobiana, dado que existen suficientes datos recopilados que avalan la experiencia de las pruebas de sensibilidad realizadas en este medio (NCCLS, 1996). Otro método realizado en laboratorio es la determinación de la concentración mínima inhibitoria del antibiótico (CMI), el cual se realiza mediante la técnica de dilución en tubo, donde se preparan una serie de tubos con medio de cultivo, cada uno a una concentración diferente de antibióticos sembrados con el microorganismo. Después de la incubación, se observa la mínima concentración de antibiótico que inhibe el crecimiento del microorganismo (Escobar 2004 y Stanchi 2007). Estas pruebas están cuidadosamente estandarizadas con el objeto de mejorar el valor predictivo clínico de los resultados. Desde 1958, el Comité Nacional de Estandarización de Laboratorios Clínicos (NCCLS) estableció 40 un Subcomité de Pruebas de Susceptibilidad Antimicrobiana Veterinaria (VAST). Gracias al desarrollo de NCCLSVAST, se están generando los criterios interpretativos de los agentes antimicrobianos veterinarios específicos con el empleo de aislamientos animales (Stanchi 2007, Gentilini 2007). 2.2.8.2. Prueba de sensibilidad a los antimicrobianos Las pruebas de sensibilidad deben realizarse sobre microorganismos asociados a infecciones cuando su sensibilidad no se pueda predecir a partir de su identificación. La determinación de la sensibilidad está indicada en los casos en que el microorganismo causal de la infección pertenezca a una especie capaz de exhibir resistencia a los antibióticos de uso clínico. Los mecanismos de resistencia a los agentes antimicrobianos incluyen: producción de enzimas inactivantes, alteraciones en el sitio de acción y modificaciones en el ingreso o el eflujo de las drogas (Pasteran et al.,2003). Para realizar pruebas de sensibilidad e identificación se debe partir de un cultivo primario en medio sólido y se debe procesar colonias aisladas de cada tipo de microorganismo que pueda tener rol patógeno. No es aconsejable la realización de pruebas de sensibilidad cuando no es clara la naturaleza de la infección y la muestra contiene flora normal o polimicrobiana, en la cual el o los microorganismos aislados probablemente tengan poca relación con el proceso infeccioso, ya que en estos casos los resultados obtenidos pueden conducir a errores en el tratamiento (Pasteran et al.,2003). 2.2.8.2.1. Principios del método de difusión en agar (Kirby – Bauer) El principio del método involucra la aplicación de una cantidad determinada de antimicrobiano en un reservorio (disco de papel, pastillas con drogas en estado cristalino, etc.) en la superficie del agar sobre la cual se ha distribuido un inoculo del microorganismo en cuestión; se formará así, por difusión, un gradiente de concentración de antimicrobiano alrededor del reservorio y la sensibilidad del microorganismo estará indicada por el tamaño de la zona de inhibición del crecimiento bacteriano. El diámetro obtenido dependerá no sólo de la sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino también del espesor de la capa de agar Mueller Hinton, su pH y composición, de la capacidad de difusión de la droga en ese medio, de la temperatura y atmósfera de incubación, de la velocidad de duplicación bacteriana, del tamaño del inoculo y la fase de crecimiento de la bacteria, etc, todas estas son las variables más importantes que afectan el resultado del antibiograma (Pasteran, et al. 2003). Una vez colocado el disco en la superficie del agar, la difusión del antibiótico que contiene comienza instantáneamente y sigue hasta alcanzarse un gradiente continuo de concentraciones alrededor del reservorio. Este gradiente se alcanza aproximadamente a las 6 hs. El tamaño de la zona de inhibición dependerá del equilibrio entre la difusión del 41 antibiótico y la velocidad de crecimiento del microorganismo. Las recomendaciones del NCCLS son: colocar los discos dentro de los 15 minutos de inoculada la placa y proceder a la incubación de la misma dentro de los 15 minutos posteriores a la colocación de los discos. Cualquier variación en estos tiempos ocasionará un desplazamiento del equilibrio antes mencionado que se traduce en errores en el tamaño de la zona de inhibición. Como la difusión del disco comienza instantáneamente después de apoyado sobre el agar, estos nunca deben levantarse para cambiarlos de lugar en el antibiograma porque seguramente ya no tendrán la carga de antibiótico original (Pasteran et al.,2003). 2.2.8.2.2. Interpretación de las pruebas de sensibilidad a los antimicrobianos por el método de difusión en agar Para cada antimicrobiano se establecen "concentraciones críticas" o "puntos de corte" que permiten separar a los microorganismos en tres categorías, sensibles, resistentes o de sensibilidad intermedia (Anexo Nº 5). Estas categorías se establecen para cada bacteria frente a cada antibiótico comparando la CMI en cada caso con los puntos de corte establecidos (Pasteran et al.,2003). § Sensible: Un microorganismo se considera "sensible" a un antibiótico cuando se puede esperar que una infección causada por el mismo responda al tratamiento con dicho fármaco a la dosis recomendada. § Resistente: este término indica que no es probable que la infección causada por el microorganismo responda al antibiótico en cuestión, cualesquiera que sean la dosis y la localización de la infección. § Sensibilidad Intermedia: Esta categoría se aplica a dos situaciones. Por un lado, se incluyen en ella las cepas con sensibilidad disminuida a un antibiótico que puede utilizarse con éxito, para el tratamiento en dosis más altas, por ser poco tóxico o porque se concentra en el foco de infección (por ejemplo, antibióticos ßlactámicos o quinolonas en la orina). En esta categoría se incluyen asimismo las cepas de "sensibilidad intermedia" a antibióticos que, por ser más tóxicos, no puede usarse en dosis más altas. En este caso, la categoría intermedia sirve como una zona de transición entre las cepas sensibles y las resistentes y previene pequeños errores causados por factores técnicos. Muchas veces un resultado intermedio requiere la definición de la sensibilidad mediante el uso de un método cuantitativo como la CMI (Escobar, 2004). 2.2.8.2.3. Selección de los agentes antimicrobianos Para la selección de los antimicrobianos a ensayar en las pruebas de sensibilidad se deben tener en cuenta las siguientes consideraciones: eficacia clínica, prevalencia de 42 resistencia, costo, indicaciones del FDA (Administración de alimentos y Fármacos), recomendaciones consenso para drogas de primera elección y alternativos al.,2003). (Pasteran et Entre los antibióticos con actividad frente a Salmonella sp. se encuentran: § Aminopenicilinas (Ampicilina). § Cloranfenicol (sólo para aislamientos de infección sistémica). § Tetraciclinas (Tetraciclina) § Trimetoprim/sulfametoxazol § Fosfomicina § Nitrofuranos § Quinolonas fluoradas (ciprofloxacina o norfloxacina) § Cefalosporinas de tercera generación (cefotaxima/ceftriaxona solo para aislamientos de infección sistémica) 2.3. El género Salmonella asociado a los reptiles En general, la clase Reptilia, consta de más de 6000 especies que incluyen serpientes, lagartos, tortugas y cocodrilos, muchos están clasificados por la UICN (Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza) dentro de las categorías de amenaza, por enfrentar un alto riesgo de extinción, principalmente a causa de actividades antrópicas, y hoy en día se están viendo afectados por microorganismos patógenos que los han llevado a un estado máximo de riesgo (Chatfield, et al 2007). La herpetofauna (particularmente reptiles), ha estado frecuentemente relacionada con casos de enfermedades asociadas a salmonelosis, por lo cual se reconoce que estas especies son una vía directa de transmisión de Salmonella sp. a los seres humanos (Center for Disease Control and Prevention -CDC- 1999); esta bacteria se considera de carácter zoonótico, por generar cuadros patológicos de gran importancia en salud pública 1979) (Selbitz et al, 1995; Turnbull de esta manera, los reservorios animales tienen un importante papel en la determinación de los factores epidemiológicos de la infección (Turnbull 1979). Numerosos investigadores han reportado el aislamiento de Salmonella sp. a partir de los excrementos de reptiles tales como las tortugas y cocodrilos en varias partes del mundo (Bovre y Sandbu, 1959, Cohen et al, 1980, Chiodini y Sundberg, 1981, Shane et al, 1990. Woodward et al, 1997. Passmans et al, 2000) y se ha establecido que el hábitat natural de los miembros del género Salmonella es el intestino de vertebrados de sangre caliente y sangre fría; siendo posteriormente dispersados en el ambiente, donde a su vez pueden sobrevivir y multiplicarse 1980). (Cohen, et al En los reptiles, Salmonella sp. es un microorganismo natural de la flora intestinal, 43 sin embargo, estos animales son catalogados como portadores asintomáticos de la bacteria (Chiodini y Sulberg, 1981; Millan et al, 1997,; Mitchel y Shane, 2000; Corrente et al, 2004; Mermin et al, 2004), Abalem de Sá y Sorari, 2001; Geue y Löschner, 2002; ya que según estudios realizados, ésta se ha encontrado en 90% o más de la población de reptiles evaluada (Chiodini y Suldberg, 1981, Woodward et al, 1997), pero son relativamente pocos los reportes de cuadros patológicos en estas especies silvestres (Boever y Williams, 1975; Isaza et al, 2000; Oros et al, 1996; Oros et al, 1997). El primer reporte de aislamiento de Salmonella sp. en reptiles aparece en 1930 en Indiana County, a partir del excremento de iguanas y desde este momento, se han realizado numerosos estudios que determinan la presencia de la enterobacteria Salmonella sp. en estas especies, además del hallazgo de microorganismos como Arizona sp. Citrobacter sp., y Edwarsiella sp. a partir de animales silvestres y en cautiverio Nasasai (Jackson, et al, 1969; Jackson y Jackson, 1971., Kennedy, 1973., Mann y Bjotvedt, 1967, McNeil y Hinshaw, 1946, et al, 2005., Vadillo, et al, 2002), lo cual ha aumentado el interés de investigación, por representar grandes relaciones con la enfermedad diarreica aguda (EDA), puesto que según las estadísticas, para el año 2000 (de acuerdo con un estudio realizado a partir de muestras de aves y humanos) se presentó en el país una tasa superior a los 1500 casos de EDA por cada 100.000 habitantes, siendo aproximadamente el 50% de los casos, relacionados con enterobacterias de los géneros Salmonella sp. y Shigella sp. (Jimenez y Mayorga, 2000). Dado que la bacteria se encuentra en el tracto digestivo de los animales, la ruta de infección puede ser por contacto directo con las heces del animal o indirectamente con la piel contaminada con el excremento (Mahajan et al., 2003 y Minette 1984). En los reptiles, la transmisión puede darse perinatalmente, por ingestión de presas contaminadas o por contacto directo con la materia fecal de otros reptiles; las altas tasas de ejemplares portadores de Salmonella sp. se relacionan con el comportamiento de coprofagia por parte de las crias, lo que asegura la transmisión prematura de dichos microorganismos (Mader 1996; Schröter et al. 2004). El primer riesgo real de contraer la enfermedad es para niños menores de 5 años y personas inmunosuprimidas donde las septicemias por especies prevalentes de Salmonella sp. se observan cada vez con mayor frecuencia. En segunda instancia, sólo de 3 a 5% de los casos de salmonelosis son a causa de los reptiles; sin embargo, el 95% de estos casos están asociados con animales mantenidos en cautiverio como mascotas, lo cual hace que desde 1975 se consideren los reptiles como importante vía 44 de transmisión de Salmonella sp. dado el gran incremento de la adopción de estos animales como mascotas (CDC, 1999: Schröter et al, 2004). Los caimanes (Orden Crocodylia) y tortugas (Orden Testudinata) son reservorios de enterobacterias como Salmonella sp. y son ampliamente reconocidos como fuentes de transmisión del microorganismo hacia los humanos demostrando su papel zoonótico (Ebani et al, 2005) En todas sus fases de desarrollo, las tortugas, como consecuencia de su amplia distribución geográfica, sus hábitos y características biológicas, son altamente vulnerables a la depredación natural, captura comercial, saqueo de nidos, matanza de hembras anidadoras, comercio ilícito de subproductos de tortugas y pérdida del hábitat entre otras, lo que ha disminuido la población de manera crítica Hernandez, 2004) (Bayley y Scott,1882; Boede y . Adicionalmente, existen otros factores que afectan de manera negativa las especies silvestres anteriormente mencionadas al estar implicados en la disminución de la población a causa de alteraciones físicas y/o patológicas que se pueden presentar. Centros de cría, protección y preservación de la fauna silvestre (como la Estación de Biología Tropical Roberto Franco) han dado a conocer las principales afecciones que pueden presentarse en este tipo de animales siendo entre otras: daño renal por exceso en la ingesta de proteínas; fracturas de huesos mandibulares y maxilares por golpes en peleas territoriales, mordeduras cuando toman el alimento y errores en la manipulación al ser capturados, alteraciones a nivel ocular, posiblemente por aguas contaminadas con desinfectantes como hipoclorito, entre otras (Rodríguez y Ramírez 2000). Existen numerosos reportes de infecciones por Salmonella sp. en animales poiquilotermos, y las condiciones para que se presente enfermedad en estas especies, están sujetas a la inmunosupresión debida al estrés por cautiverio, variación en las temperaturas medioambientales, número de microorganismos presentes, edad y estado nutricional del animal (Pasmans et al, 2002; Bäumler et al, 1998; Blanc et al, 1960; Cambre et al.1980, Dimow, 1996.) Generalmente se presentan cuadros en el tracto gastrointestinal, aunque las condiciones asociadas a salmonelosis en los reptiles incluyen gastroenteritis, osteomielitis, peritonitis, pleuritis (Figura Nº1) y bacteremia (Figura Nº 2) Minette 1984); meningitis, (Mahajan et al., 2003 y se ha reportado que en reptiles, la invasión de las células del epitelio intestinal y subsecuente colonización de los órganos internos parece no ser necesaria para el establecimiento de una infección por Salmonella sp. 45 (Pasmans et al, 2002). Aunque los reptiles son portadores asintomáticos y por consiguiente los casos clínicos de salmonelosis son reportados con menor frecuencia, numerosos estudios han asociado la bacteria con altos niveles de mortalidad en serpientes y tortugas (CDC 1999, Chatfield et al, 2007; Durango et al, 2004; Muñoz et al, 2000; Muñoz et al, 2002, Ramsay et al, 2002). Figura Nº 1. Septicemia por Salmonella sp. en Crocodylia. Fuente: Shotts, (2001) Figura Nº 2. Septicemia por Salmonella sp. en Testudines. Fuente: Shotts, (2001) Las infecciones por Salmonella sp. son comunes tanto en animales homotérmicos como en poiquilotermos entre los cuales existen diferencias significativas en el curso de la infección. Mientras que en aves y mamíferos las patologías son causadas por serotipos de Salmonella entérica subespecie entérica, un gran número de serotipos de Salmonella sp. han sido reportados asociados a los reptiles; entre ellos se incluye S. enterica subsp. enterica, S. bongori, S. enterica subsp. salamae, S. enterica subsp. arizonae, S. enterica subsp. diarizonae, S. enterica subsp. houtenae, S. enterica subsp. Indica al, 1998); (Pignato et siendo todas las especies causantes de infecciones persistentes pero sin producir signos de salmonelosis clínica en la mayoría de los casos (Zwart et al, 1970; Greenberd y Sechter, 1992). Sin embargo, en Colombia no se han desarrollado investigaciones específicas de aislamiento e identificación de salmonelas en reptiles y tan solo se ha reportado su 46 importancia zoonótica con respecto al mantenimiento como especies silvestres en cautiverio en calidad de mascotas o por medio de su comercialización 2.4. (Hernandez 2004). ESPECIES EN ESTUDIO 2.4.1. Caimán del Orinoco El caimán llanero, cocodrilo del Orinoco ó Crocodylus intermedius (Figura Nº 3), es nativo de la región Orinoquía Colombo-Venezolana, es uno de los cocodrilos de mayor tamaño de América y actualmente se encuentra catalogado como una de las principales especies de reptiles en peligro de extinción en el mundo, debido a que la sobreexplotación para el comercio de las pieles entre los años 1930 a 1960, diezmó las poblaciones silvestres y su recuperación no ha sido evidente desde ese tiempo (Ross, 1998). En Colombia, según Medem (1981), el cocodrilo del Orinoco ocupaba un área de 2 253.530 Km , entre los ríos Arauca al Oriente y Guayabero – Guaviare al occidente, el límite occidental lo forma el rio Duda, tributario del Alto Guayabero. Censos realizados por diferentes investigadores (Ardila et al, 1998, Ardila et al, 1999, Barahona et al., 1996a, Barahona et al., 1996b) reportan que existen menos de 100 individuos distribuidos de forma natural. Todas estas investigaciones le permitieron al gobierno nacional declararla en peligro de extinción; actualmente la especie se encuentra protegida por un marco normativo a nivel nacional e internacional. Rodríguez y Ramírez (2002) en el Libro Rojo de Reptiles de Colombia, catalogan la especie en categoría global CR (peligro crítico), como una población pequeña y en disminución con menos de 250 individuos maduros, con una rápida reducción en su tamaño poblacional en extensión de presencia o área de ocupación (Bejarano, 2001; Ramírez y Burbano, 2002). Tras la veda de la caza comercial las principales amenazas para C. intermedius las constituyen: la fragmentación de las poblaciones, la pérdida de hábitat, la caza que para protegerse de los animales ejercen los lugareños y, finalmente, el asalto de los nidos para consumo humano de los huevos o para el comercio ilegal de las crías (Ardila et al, 1999, Lugo, 1995). Además, según Boede y Sogbe (2000), la especie es afectada por las siguientes enfermedades en individuos mantenidos en cautiverio en zoocriaderos: anomalías congénitas e intoxicaciones en neonatos, avitaminosis por deficiencias nutricionales, escoliosis, osteodistrofia, infecciones bacterianas, micóticas, virales, parasitismo, traumatismos y estados de shock en crías y juveniles, traumatismos e hiperparasitoidismo nutricional secundario en adultos. En ocasiones se ha visto que por ingesta de trozos de caucho y telas, se han producido muertes por ahogamiento. 47 Figura Nº 3. Caiman del Orinoco o Caiman Llanero (C. intermedius) 2.4.2. Testudinos Colombia con sus 25 especies de tortugas continentales, dentro de las que se encuentran las tortugas acuáticas, semiacuáticas y terrestres (Figura Nº 4), constituye uno de los países más ricos en Testudinata de la Región Neotropical, ya que posee casi la mitad de las 53 especies de tortugas de la región (Ceballos, 2000). Sin embargo, la situación de estas tortugas es altamente preocupante dado que al menos 14 especies enfrentan un alto riesgo de extinción y se encuentran incluidas dentro de las categorías de amenaza de la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (2000) debido a la sobreexplotación de manera intensiva, degradación de hábitats a tal punto que muchas de ellas han desaparecido en vastos sectores de distribución natural o se hallan confinadas en hábitats incapaces de sustentar poblaciones saludables (Boyer y Boyer, 1996). Durante muchos años las especies de tortugas continentales han sufrido una fuerte disminución en sus poblaciones por varias causas, principalmente antrópicas: consumo de huevos y carne, uso del caparazón para la fabricación de artesanías, captura accidental en redes de pesca y palangres, contaminación y destrucción del hábitat de alimentación y de desove (National Research Council, 1990). Poco se conoce sobre el impacto de las enfermedades infecciosas bacterianas en las poblaciones de tortugas en estado natural y sobre el papel que varios microorganismos puedan desarrollar como agentes patógenos (Glazebrook y Campbell 1990b). 48 Figura Nº 4. Ejemplares de Orden Testudinata encontrados en la E.B.T.R.F (Morroco Amar – Geochelone denticulata) 2.4.3. Bacterias asociadas a enfermedades en reptiles Muchas bacterias han sido identificadas como las causantes de enfermedades en reptiles mantenidos en cautiverio Glazebrook et al. 1993). (Keymer 1978, Glazebrook y Campbell 1990a, Glazebrook y Campbell 1990b, Sin embargo, se conoce que muchos microorganismos pueden ser causa de elevada mortalidad en otras especies de animales acuáticos de vida libre 1980, Ghittino et al. 1984, Gulland 1999). (Medway Además, muchas de estas bacterias son patógenas para los humanos. Según Santoro et al (2006); Aeromonas sp. es el microorganismo más frecuentemente aislado, seguido de Citrobacter freundi, Salmonella sp, Acinetobacter sp. y Pseudomona aeruginosa . Aeromonas sp., Pseudomona aeruginosa, Staphylococcus aureus, Proteus sp., Acinetobacter sp., Citrobacter sp., son bacterias potencialmente patógenas, que pueden portarse como oportunistas, ingresar en los tejidos dañados por traumas o aprovechar las condiciones de estrés causando enfermedades graves. Estas bacterias en reptiles en cautividad, han sido asociadas a enfermedad cutánea septicémica ulcerativa, dermatitis papilar, dermatitis focal erosiva, dermatitis ulcerosa traumática, dermatitis necrosante, estomatitis ulcerosa, rinitis obstructiva, queratoconjuntivitis, septicemia, bronconeumonía y osteomielitis (Draper et al, 1981, Lauckner, 1985; Glazebrook y Campbell 1990a, Glazebrook et al.1993, Dickinson et al, 2001). Por su parte, existen más de 2300 serotipos de Salmonella sp. , muchos de los cuales fueron encontrados en reptiles silvestres y en cautiverio en quelonios marinos Krause 1999). (Mermin et al. 1997), y algunos de estos (Keymer et al. 1968; Keymer 1978; Glazebrook y Campbell 1990a; Raidal et al. 1998; O’Grady y Estos microorganismos son conocidos como oportunistas principalmente por 49 generar cuadros de enfermedad cuando los hospederos están debilitados y ocasionalmente son identificados como agentes causales de gastroenteritis en los seres humanos por consumo de carne de los animales portadores o contacto directo con heces de los mismos (O’Grady y Krause 1999). Se considera actualmente que los reptiles son fuente de transmisión de Salmonella sp. (Johnson-Delaney 1996). En reptiles terrestres, coliformes y Enterobacter sp. son asociados a enfermedades locales y generales Campbell 1990a). (Hoff et al. 1984; Glazebrook y Proteus mirabilis y Bacillus sp. son considerados saprófitas y parte de la flora normal que se encuentra sobre la piel de los reptiles (Glazebrook y Campbell 1990a, Shotts, 2001). Los estudios de la flora bacteriana en animales de vida libre son de fundamental importancia pues permiten conocer el papel que tienen estos microorganismos en las enfermedades infecciosas y como afectan la supervivencia de las poblaciones de tortugas en condiciones naturales dentro del equilibrio biológico de estos vertebrados. Considerando que el número de los microorganismos resulta mayor en reptiles con inestable estado de salud, este aspecto puede ser utilizado como un importante índice para identificar grupos de animales inmunosuprimidos o enfermos, evaluando la flora bacteriana de una población durante varios años. En fin, el conocimiento de la flora normal de animales silvestres es importante para entender los riesgos potenciales de la zoonosis (Santoro et al., 2006). 50 3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION 3.1 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA En los reptiles, Salmonella sp. hace parte de la flora intestinal normal, por lo cual estos animales son catalogados como portadores asintomáticos del microorganismo. Sin embargo, la enterobacteria al tener un comportamiento de parásito intracelular, es oportunista y puede llegar a causar afecciones en los ejemplares donde se presentan altos niveles de inmunosupresión debido a las condiciones del cautiverio, situación que es aprovechada por el microorganismo para la colonización de órganos internos causando serias patologías en los animales incluso bajo ciertas condiciones llegando a producir la muerte de los mismos. (Chiodini y Sulberg 1981; Millan et al. 1997; Mitchel y Shane 2000; Boever y Williams 1975; Isaza et al. 2000; Oros et al. 1997). Teniendo en cuenta lo anterior es indispensable conocer la implicación que puede tener esta bacteria en los cuadros patológicos presentados por estos animales y además reconocer el potencial riesgo zoonótico para las personas que trabajan en la E.B.T.R.F y que están en contacto directo con los ejemplares de C. intermedius y Testudinos que son preservados allí. Para tal fin, es necesario conocer la carga de Salmonella sp. que se presente en la población animal, para poder involucrarla directamente con procesos de enfermedad en los individuos y en el personal. Esto es de vital importancia, dado que en el país no se ha realizado ninguna investigación que abarque todos los objetivos propuestos para este estudio, relacionando la presencia de Salmonella sp. en la predisposición de los animales a presentar patologías asociadas al microorganismo. Teniendo en cuenta que todos los ejemplares muestreados se encuentran “ex situ” y el objetivo de la Estación es la reintroducción de los mismos a su hábitat natural, el proyecto sirve de guía hacia la preservación y disminución de los riesgos para las poblaciones de éstas especies silvestres encontradas “in situ”, garantizando que los ejemplares que salen de la Estación se encuentren completamente sanos, todo en búsqueda de implementar estrategias que a su vez permitan conservar la integridad de los últimos ejemplares que habitan el planeta en condiciones in situ. 51 3.2. JUSTIFICACIÓN El caimán llanero (Crocodylus intermedius) es una especie declarada en peligro de extinción; a partir de la resolución 0676 del 21 de julio de 1.997 emitida por el Ministerio del Medio Ambiente, las acciones se han dirigido a la elaboración de un programa general de conservación producto de la concertación de todas las Instituciones públicas o mixtas con incidencia directa y/o indirecta tanto en los relictos poblacionales existentes como en los territorios señalados como hábitats tradicionales de la especie. Por su parte, las tortugas constituyen el segundo grupo de vertebrados tetrápodos más amenazados en Colombia, ya que de acuerdo con las listas oficiales de especies amenazadas publicadas por la UICN, mas de la mitad de las especies registradas en nuestro país (19 de 32 (taxones), poseen algún riesgo de desaparecer en un futuro cercano, si no se adoptan medidas efectivas para su protección, manejo y conservación. Es por ello que esta investigación pretende en primer lugar y con una visión conservacionista, establecer científicamente si la Salmonella sp. puede estar afectando a los últimos ejemplares en cautiverio que existen en Colombia y que son el soporte genético con el que cuenta nuestro país para evitar su extinción; en segundo lugar y dada la implicación que tiene esta bacteria en la salud pública, se busca establecer con precisión la presencia de este enteropatógeno en tortugas que también se investigan en la Estación Roberto Franco, ejemplares donde la literatura reporta que esta bacteria puede hacer parte de la flora normal, constituyéndose en una fuente potencial de contagio para los caimanes y el personal que labora en la Estación. Una vez conocida la situación real de la presencia de este patógeno en los reptiles será posible establecer medidas de control más pertinentes, enfocadas al establecimiento de la buena salud animal y humana. La salmonelosis permanece como un importante problema de salud pública alrededor del mundo y pese a los grandes esfuerzos en investigación, muchos detalles de su patogénesis son aún desconocidos (Lax, et al 1995) en los seres humanos. y continúa siendo la principal enfermedad gastrointestinal En Colombia, las investigaciones acerca de la enterobacteria Salmonella sp. se han centrado en la implicación de la misma en las enfermedades transmitidas por agua y alimentos (ETA) y son escasos los estudios llevados a cabo acerca de los posibles contagios producidos por especies de reptiles, aunque se reconoce su gran poder zoonótico; no se ha tenido muy en cuenta el porcentaje de casos de la enfermedad que pueden ser generados a partir del contacto con especies cautivas, aunque, según datos estadísticos, el aumento de la popularidad de esos animales como mascotas, coincide con el número de casos de salmonelosis en humanos asociadas a reptiles, por lo cual este problema ha sido en los últimos años de gran importancia a nivel de salud pública. 52 4. OBJETIVOS 4.1 OBJETIVO GENERAL Evaluar e identificar mediante diversos análisis microbiológicos, la presencia de enterobacterias del género Salmonella en ejemplares de caimán llanero (Crocodylus intermedius) y tortugas de diferentes géneros (Orden Testudinata); animales mantenidos en cautiverio en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco (EBTRF), determinando las serovariedades de mayor prevalencia en estos animales. 4.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS: · Determinar mediante pruebas microbiológicas, la presencia de enterobacterias del género Salmonella aisladas a partir de muestras de hisopado cloacal, de diferentes especies de tortugas de Orden Testudinata y Crocodylus intermedius neonatos. · Establecer las especies del Orden Testudinata en las que hay mayor prevalencia de la enterobacteria en estudio. · Realizar un análisis indirecto de los ejemplares pertenecientes a la especie Crocodylus intermedius, estableciendo la presencia de la enterobacteria Salmonella sp. en el agua y sedimento de los estanques donde permanecen los animales. · Aislar enteropatógenos del género Salmonella en las muestras de materia fecal encontrada en los encierros de los ejemplares de caimán llanero en estudio. · Realizar un análisis antigénico de todas las cepas compatibles con Salmonella sp. para determinar el/los grupos predominantes en las especies en estudio. · Establecer mediante pruebas estadísticas descriptivas, el porcentaje de presentación de la bacteria tanto en Tortugas como en Crocodylia, para así mismo reportar el grado de infestación en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco. · Realizar los primeros aportes en Colombia acerca de la descripción de los serotipos de Salmonella sp. encontrados en diferentes especies de tortugas y la presencia de la bacteria en el caimán llanero (Crocodylus intermedius). 53 5. METODOLOGÍA 5.1 ÁREA DE ESTUDIO Esta investigación se llevó a cabo en La Estación de Biología Tropical Roberto Franco (E.B.T.R.F.) ubicada en la ciudad de Villavicencio - Meta, centro de investigación de la Facultad de Ciencias de la Universidad Nacional de Colombia. Las condiciones climáticas muestran un régimen de lluvias unimodal con una o precipitación media anual de 4085mm; temperatura promedio de 27 C y una humedad relativa de 77,8% (Rodríguez y Ramírez, 2000). La E.B.T.R.F, cuenta actualmente con una colección viva que supera los 300 ejemplares de tortugas terrestres nativas del país, distribuidas en más de 20 especies y, adicionalmente un número mayor a 200 ejemplares de Crocodylus intermedius distribuidos en diferentes grupos etáreos entre los que se encuentra una gran cantidad de neonatos y juveniles (80%), producto de investigaciones en el área reproductiva. El estudio de esta colección permite el desarrollo de un sinnúmero de investigaciones y proyectos que contribuyen a la conservación de estos individuos y asimismo avanzar en el conocimiento de estas especies que constituyen el grupo de vertebrados tetrápodos más amenazado de Colombia, de acuerdo con las listas oficiales de especies amenazadas publicadas por la Unión Internacional para la Conservación de la Naturaleza (UICN) 5.2 POBLACIÓN MUESTRAL: El muestreo fue realizado sobre la totalidad de los ejemplares encontrados en la Estación distribuidos en 52 estanques (Anexo Nº 1) así: 29 caimanes adultos (4 años en adelante) ubicados en 8 estanques, 118 animales juveniles (3 – 4 años) encontrados en 8 estanques y 80 neonatos (1 – 2 años) distribuidos en 9 estanques; los ejemplares del Orden Testudines se encontraban distribuidos en 27 estanques en cada uno de los cuales se encuentran animales de diferentes especies en peligro de extinción (Tabla Nº 3). 5.3 TOMA DE MUESTRAS Se realizaron tres muestreos seriados con un intervalo de 15 días entre cada uno. Se obtuvieron muestras de arena encontrada alrededor de los estanques donde están alojados los ejemplares en estudio procurando que en la muestra se incluyera materia fecal; simultáneamente se muestreó el agua y sedimento de cada uno de estos encierros. Adicionalmente, en cada uno de los estanques se obtuvo hisopado cloacal del 54 Tabla Nº 3: Especies de Testudines y Crocodylia muestreadas y número estanques y ejemplares muestreados para cada caso Nº Nº Especies Estanques Ejemplares Nombre Cientifico Nombre común Muestreados Muestreados Caimanes 25 227 Crocodylus intermedius Caiman del Orinoco / Caiman Llanero 24 226 Caiman crocodilus Babilla 1 2 27 342 Tortugas Rhinoclemmys melanosterna Palmera 2 72 Rhinoclemmys diademata Inguensa 2 32 Rhinoclemmys nasuta Sabaletera 1 2 Híbrido Rhinoclemmys Híbrido 2 115 Geochelone denticulata Morroco Amar 1 4 Geochelone carbonaria Morroco Negro 1 15 1 1 Rhinoclemmys funerea Phrynos gibbus Hedionda 1 4 Kinosternon sp Tapaculo 1 3 Phrynos geoffroanus Bachala 1 1 Peltocephalus dumerilianus Cabezon 1 1 Chekus fimbriatus Mata Mata 1 2 Podochnemis unifilis Terecay 1 20 Podochnemis expansa Charapa 1 8 Podochnemis vogli Sabanera 1 26 Podochnemis lewyana Lewyana 1 2 Trachemys scripta ornata Pecho carey 1 3 Trachemys scripta callirostris Icotea 1 31 25% de los ejemplares de la colección de Crocodylia neonatos y Testudines de todas las edades presentes en la E.B.T.R.F y las muestras se trabajaron como un grupo por cada estanque.Teniendo en cuenta que la obtención de muestras se realizó de forma aleatoria, cabe aclarar que en cada muestreo las muestras remitidas eran diferentes a las procesadas en el muestreo anterior. 55 5.3.1. Obtención de muestras por hisopado cloacal Testudines: Se muestreó el 25% de la población total encontrada en cada estanque, para lo cual se introdujo a través de la cloaca un hisopo estéril, haciendo movimientos de rotación contra las paredes cloacales se garantizó la obtención de suficiente muestra (Figura Nº 5); inmediatamente el hisopo se depositó en una bolsa de cierre hermético que contenía caldo lactosado esteril (2%), con el fin de evitar la deshidratación y contaminación (Saelinger y Lewbart 2006, Crawford et al,1971; Chambers y Hulse, 2006) Las bolsas que contenían las muestras se remitieron al laboratorio debidamente etiquetadas con el número de estanque y tipo de muestra; fueron transportadas en refrigeración por un periodo menor de 6 horas (Luna, 1991) para inmediatamente ser procesadas en el laboratorio de microbiología veterinaria de la Facultad de Medicina Veterinaria y de Zootecnia de la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá. Figura Nº 5. Toma de muestra: Hisopado cloacal en Testudines. Caimanes neonatos: Se muestreó el 25% de la totalidad de los ejemplares neonatos (menores de 1 año) encontrados en cada estanque (Figura Nº 6). De igual forma que en los individuos de tortugas, las muestras se transportaron en bolsas de cierre hermético que contenían caldo lactosado en un lapso menor de 6 horas (Luna, 1991) hasta su procesamiento en el laboratorio de microbiología veterinaria de la Universidad Nacional de Colombia. 56 Figura Nº 6. Toma de muestra: Hisopado cloacal en Crocodylus intermedius neonatos. 5.3.2. Muestreo de agua y sedimento de los estanques: Tortugas y Caimanes Neonatos: Una vez se homogenizaba el agua contenida en los estanques, se introdujo una jeringa de 20cc a la cual previamente se le había colocado una sonda estéril de 50 cm de longitud y se realizaba aspirado del fondo del estanque hasta obtener una muestra de 250 ml de agua y sedimento; ésta se depositó en bolsas de cierre hermético (Figura Nº 7 A y B). Se empleó una jeringa y una sonda por cada estanque. Caimanes adultos y juveniles: La toma de muestras se realizó a partir de los canales de desagüe, se hizo apertura de los sistemas de evacuación y se tomaron aproximadamente 250 ml de agua junto con sedimento directamente en la bolsa de cierre hermético (Figura Nº 7 C). Todas las muestras fueron transportadas en condiciones de refrigeración, debidamente identificadas (Rodriguez, et al,1980) para posteriormente ser procesadas en el laboratorio de microbiología veterinaria en la Universidad Nacional de Colombia Sede Bogotá en un periodo menor de 6 horas desde el momento de la toma. 57 A. B. C. FIGURA Nº 7. Muestreo de Agua y Sedimento de los Estanques. A y B. Muestreo en los estanques de Tortugas y Crocodylia neonatos. C. Muestreo en estanques de Crocodylia Adultos y Juveniles 5.3.3. Muestreo de arena y materia fecal de los estanques: Se abarcó la totalidad de la playa de cada estanque, llevando a cabo un muestreo significativo en 5 puntos del terreno conformando la letra Z (Petersen y Calvin, 2006), se realizó una excavación hasta aproximadamente 10 cm de profundidad y a partir de este punto se obtuvo una muestra de 250g de arena, se procuró que el sitio de toma de la misma se encontrara contaminado con restos de materia fecal; la muestras se depositaron en bolsas de cierre hermético y se transportaron a la ciudad de Bogotá igualmente en un lapso menor a 6 horas (Figura Nº 8). 58 Figura Nº 8. Toma de muestra: Arena y materia fecal encontrada en los encierros de los ejemplares en estudio. 5.4. FASE ANALÍTICA 5.4.1. Aislamiento e identificación de Salmonella sp. El cultivo de la bacteria fue realizado de acuerdo con la norma ISO 6579: 2002, con adición de algunos medios de cultivo que han demostrado buenos resultados en la recuperación del microorganismo (Chambers, y Hulse, 2006; Gaillot et al, 1999 Bonnie, 2001) 5.4.1.1. Pre enriquecimiento no selectivo Las muestras de hisopado cloacal fueron enriquecidas con 20 ml de caldo lactosado estéril, a las muestras de agua/sedimento y materia fecal/arena, se les adicionaron 250 ml de caldo lactosado esteril. Se llevaron a incubar a 37ºC, durante un periodo de 24 horas (Mann y Bjotvedt, 1967; Luna, 1991; Corrente et al 2004). 5.4.1.2. Enriquecimiento selectivo Se recuperaron 10 ml del caldo de preenriquecimiento y se adicionaron a un tubo de ensayo con 10 ml de caldo tetrationato BD® , el cual se incubó en baño serológico a o 43±0,5 C por 24 horas (Luna, 1991) 5.4.1.3. Aislamiento primario en medios selectivos y diferenciales Las muestras enriquecidas en caldo tetrationato, fueron inoculadas en medios de cultivo selectivos como Agar BD® MacConkey (Mck) y CHROMagar Orientación BD® respectivamente mediante técnica de aislamiento o agotamiento con una incubación a 0 37 C durante 24 - 48 horas. (Gaillot et al;1999) y a partir de los aislamientos realizados en los 59 medios de cultivo selectivos, se llevó a cabo la identificación de las colonias BD® “sospechosas” de Salmonella sp; el CHROMagar Orientación permite la identificación de microorganismos mediante reacciones de sustratos cromógenos artificiales y Salmonella sp. no tiene la capacidad de reaccionar con ningún sustrato cromógeno del medio, por lo cual las colonias sospechosas se identifican por no producir ningún tipo de coloración; son de bordes definidos y tamaño regular (2 - 5µ) 1997) (Figura Nº 9 A); en agar MacConkey BD® (Hengstler et al, Salmonella sp. no tiene la capacidad de degradar la lactosa presente en el medio, por lo cual las colonias se consideraban sospechosas cuando no presentaban ninguna coloración y se identificaban como colonias Lactosa Negativas (Figura Nº 9 B) (Aguilar y Escolástica, 2001) A B Figura Nº 9. Identificación de colonias compatibles con Salmonella sp. en medios de cultivo selectivos. A. CRHOMagar Orientación, B. Agar MacConkey Una vez detectadas las “colonias sospechosas” de Salmonella sp., fueron recuperadas y aisladas en los medios de cultivo diferenciales CHROMagar Salmonella BD® y Agar Hektoen Entérico, trabajados en el estudio para confirmar la pureza del cultivo y determinar si la morfología y característica de las colonias eran efectivamente pertenecientes a Salmonella sp.. En Agar Hektoen Entérico la identificación de microorganismos del género Salmonella está determinada por el crecimiento de colonias con una coloración negra en su parte central debida a la producción y precipitación de ácido sulfhídrico y presentan un halo transparente alrededor que ha permitido en el dialecto común definir que los microorganismos del género Salmonella en agar Hektoen crecen con apariencia de “ojo de pescado” (Figura Nº 10 A) Monnery et al, 1994). (Luna, 1991; Richards, et al, 2004; Gaillot et al, 1999; Dusch y Altwegg, 1993; 1995; Adicionalmente, en CHROMagar Salmonella BD® las colonias pertenecientes a este género crecen con una coloración rosa – púrpura (Figura Nº 10 B), 60 mientras que los microorganismos no deseados son inhibidos o aparecen como colonias con pigmento verde – azul (Bonnie, 2001; ISO, 2002; Dusch y Altwegg, 1993; 1995; Monnery, et al , 1994; Poisson et al, 1993; Ruiz et al, 1996). A B Figura Nº 10. Características morfológicas de las enterobacterias del género Salmonella aisladas en los medios de cultivo diferenciales. A. Agar Hektoen. B. CHROMagar Salmonella. Los medios cromogénicos permitieron el hallazgo de otros microorganismos aunque no era un objetivo propuesto para el trabajo, lo cual es de gran importancia, dado que permite conocer la microbiología cloacal de las especies y de esta forma identificar si existe alguna alteración a nivel de la flora gastrointestinal normal. En CHROMagar Orientacion BD® se observaron colonias de coloración púrpura y opacas características de Staphylococcus saprophyticus (Figura Nº 11 A), Escherichia coli se reconoce por crecer con apariencia rosa – transparente de tamaño medio con o sin halos alrededor (Figura Nº 11 B); Enterococcus sp. crece con pigmentación verde azulada y colonias de tamaño pequeño (Figura Nº 11 C),. Simultáneamente fue posible identificar enterobacterias del género Klebsiella sp. por presentar un tamaño medio y coloración azul oscuro; (Figura Nº 11 D), Proteus presentó morfología asimétrica en las colonias con una pigmentación crema rodeada de halos marrón. Finalmente, Citrobacter sp. produce colonias azul – violeta en el medio (Figura Nº 11 E). 61 A B C D E Figura Nº 11. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en las muestras. A: Staphylococcus saprophyticus. B: Escherichia coli. C. Enterococcus sp. D. Klebsiella sp. E. Citrobacter sp. 62 5.4.1.4. El Identificación Bioquímica reconocimiento de acuerdo con el metabolismo de los microorganismos pertenecientes al género Salmonella sp. se llevó a cabo mediante el sistema de identificación BBL cristal BD® para bacterias entéricas/no fermentadoras realizando el montaje y lectura de las placas según las indicaciones, recomendaciones e instrucciones del productor (Figura Nº 12) (Anexo Nº 3). A B ® Figura Nº 12. Lectura de pruebas de identificación Crystal para microorganismos entéricos/no fermentadores. A. Identificación a partir de agua y sedimento del estanque de Testudines número 21. B. Lectura en muestra de hisopado cloacal de caimán neonato en el estanque número 47 Para la lectura del perfil del microorganismo por parte del Software fue necesario realizar a las colonias “sospechosas” en los medios de cultivo diferenciales, un nuevo aislamiento en agar tripticasa soya BD® una incubación por 24 horas a 37ºC enriquecido con 5% de sangre ovina y luego de (Murray, 1999) se realizó prueba de indol en medio SIM y simultáneamente se llevó a cabo prueba de oxidasa, Salmonella muestra un comportamiento negativo para las dos pruebas. 5.4.1.5. Serotipificación Una vez los aislamientos fueron identificados como Salmonella sp. por el método de Crystal BD® , las cepas fueron recuperadas nuevamente a partir de Agar TSA con Sangre. Los aislamientos de Salmonella sp. fueron expuestos a antisueros mono y polivalentes específicos como lo indica la metodología de Kauffmann White (Grimont y Weill, 2007). En una lámina hemoclasificadora se rotuló el primer cuadrante de forma vertical con el antisuero a evaluar y cada recuadro horizontal con la identificación de la cepa a serotipificar (Figura Nº 13). En la primera sección de la lámina (Grupo B/2 A+S) se depositaron 50µl 63 de solución salina 0,85% y se tomó una asada de la colonia a evaluar a partir del TSA con sangre, se homogenizó la solución y posteriormente se adicionó una gota de 50µl del antisuero correspondiente y se mezcló; se esperó la formación macroscópica de agregados finos o grandes aglutinados que indicaba la positividad de la reacción; en caso de no haber evidencia de aglutinación, se procedía a evaluar el antisuero siguiente (Grupo D) y así sucesivamente hasta establecer el serogrupo del aislamiento (Anexo Nº 4). Para cada reacción positiva se realizaba un control positivo y negativo con el fin de garantizar la inexistencia de falsos positivos (Bayley y Scott, 1982, Chatfield, et al., 2007. Luna, 1991, Winkle y Rhode, 1961) Cepa Antisuero Grupo B 2 A+S 7A+S 14 HC 24 A+S 31 A+S + + 38 A+S 44 HC 49 A + S Grupo D1 + Grupo C1 Grupo C2 + + + Poli B + Poli C + Figura Nº 13. Esquema de una lámina hemoclasificadora utilizada para la serotipificación de las cepas de Salmonella sp. (+: Reacción positiva de aglutinación). Para la serotipificación se emplearon los antisueros comerciales Polivalentes B DIFCO ® ® (grupos C1,C2, F, G y H) y Polivalente C DIFCO (Grupos I, J, K, M, N, O) y antisueros ® ® monovalentes para Grupo B DIFCO (Factor 1, 4, 5, 12), Grupo C1 DIFCO (Factor 6,7), Grupo C2 DIFCO ® ® (Factor 6,8), y Grupo D1 DIFCO (factor 1,9, 12). 5.4.1.6. Prueba de susceptibilidad a antibióticos La prueba de sensibilidad a antimicrobianos se realizó (mediante el método de Kirby – Bauer o prueba de difusión por disco) a las cepas de Salmonella sp. identificadas por el sistema de identificación BBL Crystal BD® . A partir de los aislamientos en el medio de cultivo agar TSA + Sangre BD® se tomaron aproximadamente 2 o 3 colonias y se inocularon en un tubo con solución salina esteril, garantizando una total dilución de las colonias hasta alcanzar una turbidez correspondiente al patrón 0,5 de McFarland, con una concentración aproximada de 1,5 8 x 10 UFC/ml. (Chambers y Hulse, 2006 y Smith et al, 1952). La suspensión anterior, se depositó sobre una caja de agar Mueller Hinton cultivo validado por la NCCLS (Chambers y Hulse, 2006); BD® , medio de se garantizó que toda la suspensión entró en contacto directo con el agar y pasado un lapso de 2 minutos aproximadamente, 64 el exceso de solución se descartó e inmediatamente se ubicaron los discos comerciales BD® impregnados con el agente antimicrobiano a enfrentar con la bacteria haciendo una leve presión sobre el agar; las placas se llevaron a incubación durante un o lapso de 16 – 18 horas a una temperatura de 37 C. Los antibióticos evaluados fueron Sulfatrimetoprim (25µg), Norfloxacina (10µg), Ampicilina (10µg), Cloranfenicol (20µg), Cefoxitin (20µg), y Tetraciclina (30µg) BD® (Passmans, et al, 2005). Posterior a la incubación, los halos inhibitorios fueron medidos en milímetros (Figura Nº 14) y de esta forma se clasificó el tipo de respuesta según las tablas de interpretación provistas por la NCCLS. donde se evalúa la acción de antimicrobianos frente a microorganismos pertenecientes a la familia Enterobacteriaceae, estableciendo, la sensibilidad total, sensibilidad moderada y/o resistencia a este tipo de agentes (Anexo Nº 5) . Figura Nº 14. Antibiograma 65 6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 6.1. Análisis de datos Todos los datos obtenidos durante el proyecto fueron analizados mediante estadística descriptiva y se representaron con tablas, histogramas, gráficos circulares, entre otros. 6.2. Identificación de microorganismos del género Salmonella por técnica BBL Crystal® Mediante esta técnica de identificación fue posible confirmar los aislamientos que se habían identificado como “sospechosos” de Salmonella en los medios de cultivo diferenciales. Se obtuvieron en total 36 aislamientos sospechosos, de los cuales 31 ® fueron identificados por el software (Libro electrónico de códigos BBL Crystal ) como Salmonella sp. con un nivel de confianza promedio de 0.9908. De los 5 aislamientos restantes, en tres se descartó la presencia de Salmonella sp. puesto que en uno se obtuvo Escherichia coli con un nivel de confianza de 0,9029; en otro se aisló Flavimonas oryzihabitans antes clasificada como Pseudomonas oryzihabitans la cual según reportes bibliográficos es frecuentemente recuperada de ambientes tales como plantaciones de arroz, suelos y agua estancada; y no tiene ninguna significancia clínica (Treviño, et al 2001); finalmente, se aisló Providencia rustigianii, con un nivel de confianza de 0,7766. Dos de los aislamientos no pudieron ser identificados por el kit para la evaluación de microorganismos Entéricos/No Fermentadores, por lo cual se reportaron como negativos para Salmonella sp. Adicionalmente, es necesario tener en cuenta que el sistema identificó dos de los aislamientos como Salmonella cholerae suis subsp. arizonae, serovariedad encontrada a partir de una muestra de origen ambiental la cual no ha sido reportada en especies de reptiles, hecho que permitió plantear una hipótesis sobre la posible contaminación de la arena en el encierro mediante fómites (botas, herramientas) que hubiesen sido utilizados previamente en alguna granja donde se mantienen cerdos puesto que la serovariedad aislada ha sido reconocida como agente causal de salmonelosis porcina Caughey et al, 2005). (Thomas, 1997; Mc Sin embargo, mediante las indagaciones realizadas acerca del manejo en la E.B.T.R.F. y las medidas de bioseguridad establecidas allí, esta hipótesis fue descartada. 66 6.3. Positividad a Salmonella sp. en estanques de Crocodylia y Testudinea Entre los ejemplares de Crocodylia se encuentran especies de Crocodylus intermedius en su mayoría, distribuidos en 24 estanques, en 15 de éstos se encontró la bacteria; el estanque restante es ocupado por ejemplares de Caiman crocodylus (Babillas) donde igualmente se encontró el microorganismo, lo cual permite concluir que el 64% de los estanques de caimán se encontraban positivos a la bacteria. Por otro lado, de los 27 estanques de tortugas evaluados, 12 (44,4%) son positivos para Salmonella sp; encontrándose la presencia del microorganismo en 7 de las 18 especies que conforman la colección viva de la E.B.T.R.F; estos resultados son de gran preocupación puesto que de acuerdo a los resultados obtenidos y haciendo un análisis general que reúne los datos globales colectados en la Estación, para las dos especies evaluadas, se pudo establecer que en 27 de los estanques (52%) fue posible recuperar microorganismos del género Salmonella; mientras que los 25 (48%) restantes se encuentran negativos para la bacteria (Figura Nº 14). Según el volumen de muestras remitidas al laboratorio, de un total de 129 muestras, 30 fueron positivas para el microorganismo, lo cual equivale a un 24% . Es necesario aclarar que en el primer muestreo se remitieron al laboratorio 129 muestras, en el segundo muestreo 96 y en el tercero 73; debido a que si en alguno de los estanques evaluados se reportaba el hallazgo de Salmonella en cualquiera de las muestras procesadas, no era relevante muestrear nuevamente dicho estanque ya que el proyecto estaba condicionado a la evaluación de la presencia/ausencia de la bacteria. N = 52 Figura Nº 15. Es de vital importancia tener en cuenta que es muy poco lo que se ha investigado a nivel mundial y mucho menos Nacional, con respecto a la presencia de la enterobacteria en este tipo de reptiles, ya que por muchos años se han encaminado los estudios a las 67 especies que son criadas como mascotas, tales como iguanas, lagartos, tortugas y serpientes (Hidalgo et al, 2008; Corrente, et al, 2004; Kourany y Telford, 1982; Ebani et al; 2005; Mitchell y Shane, 2001), pero en animales que se encuentran en via de extinción y que son el objetivo principal de los centros de conservación y recuperación de las especies mediante programas de reproducción, los ensayos acerca de la presencia de Salmonella sp. tanto en los animales como en su hábitat natural son insuficientes. Adicionalmente, si bien es cierto que el microorganismo hace parte de la flora comensal de los reptiles y que su aislamiento en tortugas de diferentes familias ha sido reportado con mayor frecuencia (Hidalgo, et al 2007,2008; Siebeling et al, 1975; Passmans et al, 2002; Saelinger y Lewbart 2006), no se puede ignorar el hecho de que para todos los individuos evaluados, las condiciones de cautiverio donde son mantenidos crean cuadros de inmunosupresión marcada donde la enterobacteria es excretada de manera intermitente (Chiodini y Sundberg, 1981; Bradley et al, 2001; Ebani et al 2005) y puede llegar a producir estados patológicos caracterizados por letargia, anorexia, septicemia, pneumonia, celomitis, abscesos, shock hipovolémico y, bajo circunstancias extremas, la muerte del ejemplar (Onderka and Finlayson, 1985; Frye, 1991). Aunque todos los reptiles son considerados portadores naturales de Salmonella sp., lagartos, serpientes y tortugas en particular, son reservorios de dicha bacteria 1998) (Baümler et al, y no es claro cómo frecuentemente las especies de reptiles son colonizadas por serovariedades de Salmonella; en algunos estudios realizados se ha evaluado la capacidad de colonización de la bacteria en útero, contaminación perinatal, por ingestión de presas contaminadas y/o contacto con heces de otros reptiles (Schöter, et al , 2004). Según Kourany y Telford (1982), la predisposición a condiciones de estrés y escases de alimento hacen que la bacteria atraviese la barrera sanguínea y linfática, llegando a oviducto, causando la contaminación de los huevos; aunque Mitchell y Shane (2000), sugieren que la contaminación de los huevos se da por abrasión del mismo cuando entra en contacto con el suelo y cáscaras remanentes, en su ensayo descartan la transmisión vertical puesto que no lograron el aislamiento del microorganismo a partir de ovarios, oviducto y saco embrionario. Sin embargo, la mayor parte de investigaciones en esta área concluyen que la ingestión de agua contaminada con heces es la principal vía de infección considerándose el medio acuático favorable para la transmisión (Hidalgo, et al, 2007) sin llegar a subestimar que el alimento y el contacto con otros reptiles también son una importante vía de contaminación; además las altas tasas de ejemplares portadores de Salmonella se relacionan con el comportamiento de coprofagia por parte de las crías, lo que a su vez asegura la transmisión prematura de dichos microorganismos importancia de las infecciones por Salmonella sp. (Mader, 1996) La es su potencial zoonótico y los aislamientos de la bacteria a partir de reptiles se han considerado como patógenos para humanos, ya que poseen factores de virulencia cruciales 68 para el desarrollo de una gastroenteritis (Pasmans et al., 2005). Estos factores demuestran la importancia en la obtención de los resultados ya que se ha informado a la Estación de Biología Tropical Roberto Franco acerca de la presencia de la enterobacteria Salmonella sp. tanto en los animales como en su hábitat natural, con el fin de concientizar al personal que labora en sus instalaciones y que se encuentra en un potencial riesgo de contraer salmonelosis asociada a reptiles. 6.4. Presencia de Salmonella sp. según la especie En la Estación de Biología Tropical Roberto Franco se encuentra una colección que supera los 400 ejemplares de tortugas distribuidos en más de 18 especies y más de 200 ejemplares de Crocodylus intermedius. Es una población que se encuentra en buenas condiciones de salud, a pesar de haberse obtenido aislamientos de Salmonella sp. en un 46% de los estanques de tortugas (Figura Nº 16) y 60% de C. intermedius (Figura Nº 17). Cabe resaltar que ninguno de los animales presentaba sintomatología asociada con Salmonelosis, lo cual puede ser compatible con varias investigaciones que se han realizado en este tipo de ejemplares estableciéndose de esta forma que son portadores aisntomáticos de la enterobacteria (Chambers y Hulse, 2006; Mitchell y Shane, 2000; Pasmans, et al 2005; Geue y Lôschner, 2002; Chiodini y Sundberg, 1981; Millán et al, 1997; Abadem de Sá y Solari; 2001) N = 27 Figura Nº 16. 69 N = 25 Figura Nº 17. Saelinger y Lewbart (2006) plantearon dos hipótesis de acuerdo con los resultados que obtuvieron en el aislamiento de Salmonella sp. en ejemplares de tortugas silvestres; ellos postulan que no lograron recuperar ningúna cepa, posiblemente porque las tortugas excretan Salmonella sp. únicamente bajo condiciones de estrés como el cautiverio y/o porque las tortugas silvestres no son portadores naturales de Salmonella sp. sino que la adquieren cuando son incluidas en ambientes “ex situ”; de esta forma proponen que las tortugas “salvajes” no pueden ser portadores de los organismos antes de la captura; sin embargo tanto el análisis experimental llevado a cabo en la Estación Roberto Franco, como el realizado por Chambers and Hulse (2006), contradice por completo el hallazgo de dichos investigadores quienes a partir de ejemplares silvestres, reportaron que el 85% de la muestras procesadas eran positivas para Salmonella sp. Nuestra investigación en la Estación, soporta la primera hipótesis planteada por Saelinger y Lewbart (2006) puesto que el porcentaje de recuperación de Salmonella sp. en los Testudines cautivos en la E.B.T.R.F (Figura Nº 16), fue de 46% y se plantea que los resultados inesperados obtenidos por dichos autores posiblemente se dieron por una errada metodología de muestreo al haber empleado únicamente hisopado cloacal en la toma de las muestras dado que la cantidad que se obtiene de esta manera es insuficiente y se conoce que la concentración de Salmonella sp. frente a la flora acompañante es muy baja, lo cual hace que su recuperación sea más difícil ó posiblemente al igual que Richards et al (2004), no obtuvieron resultados favorables seguramente por no realizar previo enriquecimiento de la muestra. Por otra parte, el porcentaje de aislamiento de Salmonella sp. en C. intermedius observado en la Figura Nº 17 fue mayor que el obtenido para ejemplares de Orden Testudinata, lo cual concuerda con lo reportado por Geue y Löschner (2002) quienes 70 obtuvieron un porcentaje de recuperación de la bacteria solo de 2,6% (una muestra) en Testudines, mientras que en lagartos obtuvieron un porcentaje de aislamiento de 47,4 %; (36 muestras); de igual manera en un estudio realizado por Corrente et al (2004) se obtuvo 50% de recuperación en lagartos y 10,3% en tortugas. Los resultados obtenidos en la estación fueron mayores a lo esperado puesto que existen muchos más reportes de aislamientos a partir de muestras provenientes de tortugas que de caimanes (Richards. et. al 2004; Mitchell and Shane. 2001; Pasmans, et al 2005; Hidalgo, et al 2007, Lane, 1996). Es importante destacar que estos resultados apoyarán bibliográficamente a muchos investigadores en esta área pues no se conocen datos acerca del comportamiento de la bacteria en ejemplares de Caimán y como se puede deducir, es de vital importancia determinar la presencia de Salmonella en este tipo de animales puesto que la prevalencia en los individuos ex situ es altísima y teniendo en cuenta que generalmente se encuentran incluidos en programas de recuperación y repoblación de la especie es necesaria la implementación de medidas que eviten la predisposición de los animales a inmunosupresión extrema y adicionalmente mantener las medidas de bioseguridad apropiadas que garanticen condiciones sanitarias ideales para los animales y el personal que labora con los mismos. Cabe resaltar que para animales mantenidos en cautiverio, es de vital importancia conocer que Salmonella sp. es altamente resistente fuera de su hospedero y permanece viable después de 89 días en suelo y/o agua y 30 meses en Materia Fecal, lo que permite asegurar que todo el ambiente del encierro puede ser fuente para aislamientos positivos para Salmonella sp. (Warwick, et al 2001). Adicionalmente, teniendo en cuenta que la excreción de la bacteria no es constante y que el muestreo por hisopado cloacal no es lo suficientemente sensible, se optó por llevar a cabo un muestreo mucho más amplio que permitiera aumentar las probabilidades de recuperación del microorganismo a partir de muestras de origen ambiental puesto que según reportes bibliográficos, han generado resultados satisfactorios en el aislamiento del microorganismo (Hidalgo, et al 2007) siempre y cuando el muestreo sea continuo y repetitivo (Woodward et al., 1997; Mermin et al., 2004). 6.5. Aislamientos de Salmonella sp. según el tipo de muestra para ejemplares de Crocodylia y Testudinos Las muestras de tipo ambiental obtenidas para el aislamiento de Salmonella sp. en este ensayo han permitido una buena recuperación de la bacteria, consiguiéndose un mayor índice de recuperación de la bacteria a partir de muestras de agua y sedimento de los estanques donde se aisló el microorganismo en 7 (50%) de las 14 muestras positivas en 71 Testudines y 10 (71,4%) de 14 muestras igualmente positivas en Crocodylia; a diferencia de los hisopados cloacales donde la recuperación del microorganismo fue menor. Las figuras Nº 18 y 19 muestran claramente los resultados obtenidos de acuerdo al tipo de muestras procesadas para el aislamiento de Salmonella en los ejemplares evaluados y analizando los datos es posible afirmar que cualquier metodología que se emplee para el aislamiento de la bacteria no es lo suficientemente sensible y específica por si sola; deben emplearse diferentes muestras para garantizar la recuperación del microorganismo; es así como es posible corroborar los resultados de ensayos previos donde el aislamiento del enteropatógeno a partir de hisopado cloacal en muchos casos no ha permitido la obtención de la bacteria Saelinger y Lewbart, 2006) (Geue y Löschner, 2002; Richards. et al .2004; Pasmans et al. 2002; y refutar aquellos donde se ha obtenido un altísimo porcentaje de aislamiento tal como Schröter et al (2004) quienes mediante hisopado cloacal obtuvieron Figura Nº 18. Figura Nº 19. 72 81% de recuperación de Salmonella sp. en serpientes y Pasmans et al (2005), con 25 aislamientos positivos para Salmonella sp. (75,8%) de 33 muestras obtenidas a partir de hisopados cloacales en lagartos, aunque igual establecen que el muestreo único por hisopado cloacal no es altamente sensible. Según los resultados obtenidos en este trabajo, no es recomendable realizar hisopados cloacales en los animales porque el estrés generado durante el procedimiento es muy alto y el porcentaje de recuperación de la bacteria muy bajo; además, conociendo que la excreción de la bacteria es intermitente, el aislamiento del microorganismo mediante hisopado cloacal va a depender no solo de llevar a cabo una buena metodología diagnóstica, sino del factor “azar” que garantice que en el momento del muestreo la bacteria este siendo excretada por el animal (Hidalgo, et al 2007; Saelinger y Lewbart 2006; Pfleger,. et al, 2003; Warwick, et al 2001; Woodward et al, 1997; Mermin et al. 2004). Los datos sugieren que el agua, junto con el sedimento, es una fuente de transmisión importante para los ejemplares que se encuentran alojados en cada estanque; a diferencia de Mitchell y Shane (2000), quienes no obtuvieron resultados en las muestras de agua procesadas, en su trabajo de investigación, al igual que en este lograron aislar el microorganismo en la arena de los estanques contaminada con heces de los animales, la cual según los resultados obtenidos, también puede ser tomada como una muestra apropiada para el aislamiento de la bacteria aunque debe estar acompañada de otra metodología de aislamiento. En nuestra investigación se realizaba una excavación aproximada de 15 cm de profundidad y a partir de allí se obtenía la muestra, lográndose un porcentaje de recuperación de 12,5% en Testudinea y 8% en Crocodylia aunque se debe aclarar que el lugar de elección para la toma de la muestra era aquel contaminado con excremento del animal en los estanques de Testudinea puesto que en ninguno de los 3 muestreos realizados se encontró materia fecal sobre la arena de los encierros en Crocodylia. Algunos reportes soportan la metodología empleada en este estudio; han establecido que a profundidades de 5 – 50 cm hay una mayor supervivencia de Salmonella sp. en la arena en comparación con la superficie (Platz, 1980; Purvis, et al, 2002), pesar de ser un ambiente más inestable expuesto a temperaturas extremas a (Mitscherlich y Marth. 1984; Bicudo y Goyal, 2003), desecación (Purvis, et al, 2002; Zibilske y Weaver, 1978) y rayos Ultra Violeta (Schlundt, 1984). Aunque se expone que la persistencia de Salmonella sp. en la profundidad puede verse afectada por el grado de infiltración de la columna de arena, lo cual a su vez depende de las propiedades físico químicas del suelo tal como la textura, porcentaje de arena, limo y arcilla que la compone, porcentaje de materia orgánica en la superficie, pH, el movimiento y dirección del agua (Winfield y Groisman, 2003) . 73 Es claro que tanto para tortugas como para caimanes, la frecuencia de aislamiento de Salmonella sp. en el ambiente de la Estación (19,2% n =10 en tortugas y 24 % n = 12 en caimanes) indica la habilidad del microorganismo para sobrevivir fuera del hospedero, lo cual favorece la contaminación de los otros animales que permanecen en contacto constante con el estanque infectado (Winfield y Groisman, 2003); sin embargo, las propiedades físico químicas del ambiente externo influyen fuertemente en la supervivencia de Salmonella sp. y por consiguiente en el riesgo de infección asociado para los otros ejemplares. Según Jensen et al (2006) es posible disminuir la carga bacteriana en el suelo realizando tratamientos sobre la arena, como lo es el arado; sugirieron que el hecho de recoger el excremento periódicamente podrá reducir la concentración del microorganismo. 6.5.1. Aislamientos de Salmonella sp. en estanques de Crocodylia según grupos etáreos En la figura Nº 20 se observa el porcentaje de aislamiento de Salmonella en cada uno de los grupos, es notable que en caimanes adultos y juveniles el aislamiento de esta bacteria en los estanques no varió de manera significativa puesto que se obtuvieron porcentajes de 29% (n = 4) y 21% (n = 9) respectivamente. Estos resultados concuerdan con los obtenidos por Geüe y Löschner (2002), donde la prevalencia de Salmonella sp. fue calculada como 63,3% (12 de 19 muestras) en lagartos juveniles y 63,6% (14 de 22 muestras) en lagartos adultos aunque los resultados que obtuvieron en lagartos neonatos difieren los obtenidos en este estudio ya que en este grupo encontraron el menor porcentaje de prevalencia de Salmonella sp. (17,4%) a diferencia del 50%de presentación de la bacteria en este experimento. Figura Nº 20. 74 El hecho de que en caimanes neonatos se halla encontrado el mayor porcentaje de aislamiento permite el planteamiento de varias hipótesis teniendo conocimiento de la posible transmisión vertical del microorganismo que ha sido evaluada en varios estudios reportados previamente. En esta instancia es posible citar a Kourany y Telford (1982), quienes evaluaron la presencia de Salmonella sp. en oviducto y huevos a partir de lagartos hembras, encontrando Salmonella rubislaw y S. sandiego en todas las muestras a pesar de que los animales procedían de diferentes sitios; ellos plantearon que en animales saludables la enterobacteria permanece en el tracto gastrointestinal pero bajo condiciones adversas como estrés y/o escases de alimento atraviesa la barrera linfoide y coloniza el contenido interno de los huevos y el oviducto. Por el hecho de haber aislado los mismos serotipos en muestras de diferente orígen, sugirieron que la bacteria estaba presente en oviducto y que los huevos son infectados en estadíos tempranos de formación en el mismo. Por otra parte, también existen reportes en que los caimanes neonatos pueden adquirir Salmonella sp. cuando se encuentran en estadío de huevo y este se encuentra enterrado en arena o suelo húmedo contaminado con la bacteria o también puede contaminarse con el microorganismo durante el pasaje a través de la cloaca. Se ha reportado que Salmonella sp. está en capacidad de contaminar el contenido interno de los huevos dentro de una hora post exposición (Austin y Wilkins, 1998). Como medida de prevención, Mitchell and Shane (2001) plantean que el uso de oxitetraciclina y cloranfenicol puede eliminar la Salmonella en huevos eclosionados antes de 24 horas por metodología de inmersión; en huevos con 48 horas después de la oviposición ya no surge ningún efecto el empleo de los antibióticos (Siebeling et al, 1975) . 6.6. Serotipificación De los 31 aislamientos identificados mediante método de Crystal BD® como Salmonella sp. 29 se lograron clasificar con los antisueros comerciales DIFCO ® empleados, identificando 6 serogrupos prevalentes en la Estación. En la figura Nº 21 se observa que el 40% de las cepas de Salmonella sp. halladas en la Estación pertenecen al serogrupo C2; mientras que la prevalencia de bacterias clasificadas como pertenecientes al Grupo B y Grupo C1 fue la misma, obteniendose un porcentaje de 20% para cada caso. En esta instancia, se debe mencionar que hubo correlación entre las cepas de Salmonella cholerae suis identificadas por el sistema BBL crystal y la serotipificación ya que las cepas “sospechosas” son pertenecientes al serogrupo C1 donde se encuentra incluida S. cholerae suis según el esquema de Kauffmann White (Anexo Nº 4). El 20% restante de las cepas pertenecen a serotipos incluidos en los Grupos que abarca el antisuero polivalente B (14%), Grupo D1 y serogrupos pertenecientes al Polivalente C. 75 Figura Nº 21. Los serogrupos de Salmonella sp. que se han identificado en la E.B.T.R.F. mediante antígeno somático han sido frecuentemente reportados en reptiles; teniendo en cuenta que el grupo C2 fue el de mayor ocurrencia, según Grimont y Weill (2007) y Popoff y Le Minor (1992); en este se encuentran incluidas serovariedades como S. newport y S. muenchen; las cuales son agente causal de salmonelosis en humanos, reptiles y caprinos entre otras especies (Passman, et al 2002; Simmons, 2002). Adicionalmente, los antisueros polivalentes B y C, incluyen serovariedades de Salmonella sp. que han sido aisladas constantemente a partir de muestras de reptiles; entre estas se encuentran S. oranienburg, S. berta, S. panama, S. rubislaw entre otras, muchas de las cuales se han reportado como agentes causales de patologías gastrointestinales en los reptiles y algunas veces asociadas a salmonelosis en humanos producida por contacto directo con el animal asintomático (Kourany y Telford, 1982; Ebani, et al 2005; Geue y Löschner, 2002; Saelinger, et al; 2006). S. cholerae suis nunca ha sido reportada para reptiles, por lo cual es necesario realizar una investigación profunda en la E.B.T.R.F. que permita determinar la causa o el origen del hallazgo de esta serovariedad “específica” de porcinos, teniendo en cuenta que este tipo de alimento no es suministrado a los animales y que las personas que manejan los ejemplares aseguran no estar en contacto con porcinos, es probable que los individuos introducidos recientemente a la Estación, hayan traido consigo el microorganismo y que éste se encuentre establecido en el hábitat. El hecho de que en la Estación se encontraran cepas de Salmonella sp. incluidas en los Grupos B (20%) y Grupo D1 (3 %) permite inferir en la posibilidad de encontrar serovariedades con alto potencial de transmisión a los humanos puesto que en estos serogrupos se encuentran incluidas cepas como Salmonella typhimurium y S. enterididis, dos de los serovares más comunes en Estados Unidos, implicados en aproximadamente 76 el 50% de los casos de Salmonelosis en humanos (Mermin et al, 2004), lo cual permite plantear que el personal de la Estación se encuentra en riesgo de contraer el microorganismo debido a su comportamiento zoonótico. Cabe resaltar que sin una serotipificación completa de todos los microorganismos recuperados en la Estación Roberto Franco, no es pertinente asegurar que el personal que labora allí se encuentre en inminente riesgo de contraer salmonelosis, antes se debe evaluar su estado inmunológico pues, de la misma manera que en reptiles, si los humanos se encuentran inmunosuprimidos podrían desarrollar un cuadro clínico severo. Como método de prevención es necesario el seguimiento de las normas de bioseguridad establecidas en la Estación para el manejo de las poblaciones allí mantenidas. 6.7. Pruebas de sensibilidad a antimicrobianos Los resultados obtenidos en las pruebas de sensibilidad a antibióticos a partir de los aislamientos obtenidos en la E.B.T.R.F. se encuentran consignados en las tablas Nº 5 y Nº 6 donde se puede analizar el comportamiento de las cepas frente a los diferentes antibióticos a los cuales se enfrentaron los aislamientos recuperados tanto a partir de tortugas como de Crocodylia. Existen diferencias notables para cada una de las especies puesto que las cepas aisladas de muestras provenientes de caimán son mucho mas sensibles a los antimicrobianos que las de tortugas, donde varios de los aislamientos eran resistentes a los antibióticos utilizados; por ejemplo, para cloranfenicol todas las cepas provenientes de caimán fueron sensibles mientras que en tortugas 6 generaron resistencia al antibiótico. Tabla Nº 4: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Testudinata frente a los antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS EN TESTUDINES Ampicilina Cefoxitin Cloranfenicol Norfloxacina Sulfatrimetoprim Tetraciclina Sensibles (n) Moderados (n) Resistentes(n) 8 7 7 13 8 1 1 10 5 5 6 77 6 2 Tabla Nº 5: Comportamiento de los microorganismos del género Salmonella sp. aislados a partir de muestras de ejemplares de Orden Crocodylia frente a los antibióticos utilizados mediante el método de Kirby – Bauer. PRUEBAS DE SENSIBILIDAD A ANTIBIÓTICOS EN CROCODYLIA Ampicilina Cefoxitin Cloranfenicol Norfloxacina Sulfatrimetoprim Tetraciclina Sensibles (n) Moderados (n) Resistentes(n) 10 11 13 13 11 - 1 1 - 1 1 2 4 9 Simultáneamente se puede asegurar que el antibiótico de elección para emplear en la estación Roberto Franco es Norfloxacina debido a que todas las cepas de Salmonella enfrentadas a este antimicrobiano tienen un alto grado de sensibilidad, de igual manera, se establece que Tetraciclina tiene un comportamiento de sensibilidad intermedia para todos los aislamientos. Cloranfenicol es un antimicrobiano que tendría alto rendimiento contra los microorganismos del género Salmonella aislados a partir de ejemplares de caimán; sin embargo, es un antibiótico que tiene restricciones para ser suministrado por generar alteraciones y degeneraciones a nivel de médula ósea (Ebani. et al. 2005) Figura Nº 22. La resistencia a antimicrobianos en aislamientos de Salmonella sp. a partir de muestras de origen animal es un problema emergente; estas cepas pueden ser una fuente de plásmidos de resistencia para otras bacterias y producir alteraciones en el tratamiento antimicrobiano clave para combatir enfermedades en medicina humana y veterinaria (Ebani et al 2001). 78 El porcentaje de sensibilidad, resistencia y sensibilidad moderada para todas las cepas aisladas en las muestras de la E.B.T.R.F se observa en la figura Nº 22. Como ya se habia mencionado, el 100% de las cepas fueron sensibles a la Norfloxacina; resultado que se puede extrapolar para ser soportado por Mitchell et al (1999) quienes obtuvieron 100% (N = 20) de sensibilidad frente a cepas de Salmonella sp. aisladas a partir de muestras de hisopados cloacales en tortugas a las cuales se les administró durante un periodo de 14 días Enrofloxacina [10 mg/Kg] lapso en el cual se realizó un nuevo aislamiento del microorganismo, obteniendo una totalidad de negativos a la bacteria. Norfloxacina y Enrofloxacina son antibióticos pertenecientes a la familia de Fluoroquinolonas que tienen actividad bactericida, propiedad que es indispensable en un antibiótico ideal (Gentilini, 2007) De igual forma, en la figura Nº 22 es posible observar que en general todos los antibióticos empleados en los antibiogramas tienen un buen porcentaje de efectividad a excepción de tetraciclina, antibiótico que para la mayoría de aislamientos producen grados de sensibilidad intermedia a diferencia de varios reportes donde las cepas exhiben un alto porcentaje de resistencia a este antimicrobiano Shane, 2001; CDC,1999); (Corrente, et al, 2004; Mitchell y adicionalmente se debe aclarar que la elección de los antibióticos a utilizar en este ensayo se basó en los resultados obtenidos en antibiogramas realizados a distintos ejemplares de reptiles con patologías asociadas a algunas bacterias diferentes a Salmonella sp.; casos que eran remitidos al laboratorio de Microbiología de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia en la Universidad Nacional de Colombia, los datos se colectaron mediante un estudio retrospectivo realizado a los archivos de resultados obtenidos durante el año 2003 a 2007. Es necesario tener presente que cuando el tratamiento antibiótico es incapaz de eliminar las bacterias del intestino de los reptiles y en cambio promueve la persistencia de cepas resistentes a antibióticos, el tratamiento de los portadores del Salmonella sp. debe evitarse y se recomendarían las buenas prácticas de higiene a los propietarios del reptil o al personal que labora en el centro de recuperación para minimizar el riesgo de infección (Bradley et al 1998). Adicionalmente no se puede olvidar que el uso de antibióticos de amplio espectro como las quinolonas (Norfloxacina) que mostraron un 100% de efectividad para combatir las cepas aisladas en la estación (Figura 22), son ampliamente utilizados en medicina herpetológica y pueden ser causa de alteración momentánea grave de la flora tan rica de Gram Negativos y Gram Positivos que se encuentra en el tracto gastrointestinal de estas especies. Existen datos bibliográficos que demuestran 79 una cierta tendencia a la anorexia o a alteraciones digestivas en reptiles herbívoros tras terapias prolongadas de antibióticos (Jacobson, 1980;1999; Kaufman, 1998) 6.8. Microorganismos diferentes a Salmonella sp. aislados en los estanques de la Estación Aunque la identificación de los microorganismos diferentes a Salmonella sp. no era un objetivo propuesto para el trabajo, el medio de cultivo utilizado CHROMagar Orientación BD® , permitió la identificación de los otros microorganismos presentes en cada una de las muestras trabajadas de acuerdo a las reacciones de cada bacteria con los sustratos cromógenos presentes en el medio (Anexo Nº 2). Figura Nº 23. De acuerdo con la Figura Nº 23, se puede establecer que en este estudio hay un predominio de flora Gram negativa, lo que concuerda con lo reportado por Sunderland y Veal (2001), sin embargo, Enterococcus sp. microorganismo Gram Positivo, fue el que estuvo en un mayor porcentaje (33%) en todas las muestras trabajadas sin importar el origen de las mismas. Por su parte; en las figura Nº 24 y 25 es posible observar el porcentaje de presentación de los microorganismos diferentes a Salmonella sp. en las muestras de agua y sedimento y arena junto con materia fecal respectivamente en los estanques de Testudines muestreados y se puede notar que en los dos tipos de muestra evaluados hubo una mayor prevalencia de microorganismos del género Enterococcus sp; Eschericha coli y Klebsiella sp. Sin embargo se observa que en las muestras de agua y sedimento se recuperaron más microorganismos que en las de arena y materia fecal 80 aunque los porcentajes de presentación no variaron significativamente entre las muestras. Figura Nº 24. Figura 25. Adicionalmente, se tuvieron en cuenta los microorganismos encontrados a partir de muestras de hisopados cloacales de animales de Orden Testudinata, datos que se pueden observar en la figura Nº 26; donde a su vez puede establecerse que la recuperación de microorganismos fue menor para este tipo de muestra. 81 Figura 26. Para los ejemplares de Crocodylus intermedius la prevalencia de los microorganismos diferentes a Salmonella sp. fue muy similar a los aislamientos obtenidos en tortugas; sin embargo, tal como se puede observar en la figura Nº 27 existe una marcada variación en los porcentajes de microorganismos aislados a partir de agua y sedimento con respecto al comportamiento presentado en las muestras de tortugas evaluadas previamente y los resultados obtenidos en arena y materia fecal (Figura Nº 28) e hisopado cloacal (Figura Nº 29) en ejemplares de caimán. Es así como en las muestras de agua y sedimento obtenidas a partir de estanques de caimán, hubo una mayor prevalencia de microorganismos del género Klebsiella sp. (31%) y contrario a lo encontrado en el resto de las muestras se obtuvo 23% de aislamientos de Enterococcus sp. Figura Nº 27. Proc. Alligator Production Conference, La composición y diversidad de especies de enterococos en las heces de animales silvestres parece depender sobre todo de la 82 alimentación y condiciones del ambiente en el que se desarrolla el ciclo vital del hospedador. Así, los animales en cautiverio o de hábitats periurbanos o que tienen una dieta oportunista son los que presentan una mayor diversidad de enterococcos, lo cual explica los hallazgos del presente experimento. Por el contrario, cuando existe una especialización en un alimento y/o habitan en ambientes con menor influencia de la actividad humana se encuentra una menor diversidad del microorganismo (Ballesteros, 2003). Figura Nº 28. Figura 29. De igual forma, en un estudio realizado por Mundt (1963), se obtuvo un 85,7% de recuperación de Enterococcus sp. a partir de muestras fecales de reptiles, el alto porcentaje de recuperación de estos microorganismos es interesante debido a la marcada diferencia en temperatura corporal entre reptiles y mamíferos, y en consecuencia se puede decir que las bacterias aisladas a pesar de ser mesófilas; 83 pueden tener una adaptación a la temperatura llegando a desarrollarse a temperaturas inferiores de lo esperado (Boyer, 1992) Se han aislado también, Citrobacter, Klebsiella, y Proteus, las cuales aunque son flora normal, bajo ciertas condiciones pueden llegar a producir septicemias, enterocolitis y diarreas; Escherichia coli puede producir dolor abdominal, diarrea, vómito y fiebre; Klebsiella produce enfermedades respiratorias y Citrobacter alteraciones a nivel del colon (Martínez, et al, 2003). Es necesario conocer la particular población saprofita en los reptiles debido a que cualquier causa que altere este equilibrio puede desencadenar diarrea u otras patologías digestivas (Martínez, et al, 2003). Adicionalmente, hasta el momento se han realizado análisis como este en otras especies de reptiles, como serpientes y tortugas; sin embargo, la información que se ofrece en este trabajo es la primera descripción microbiológica realizada hasta la fecha en las especies de Crocodylus intermedius manejadas en Colombia. La población bacteriana estudiada refleja, por tanto, la normalidad de la flora digestiva en este grupo de reptiles y no pueden establecerse conclusiones evolutivas o adaptativas sin la realización de estudios adicionales. Por lo tanto, el conocimiento de la microbiología cloacal de estas especies es fundamental para diagnosticar desordenes de la flora digestiva así como prevenir procesos secundarios a estrés e inmunosupresión, todo ello dirigido a optimizar programas de conservación como los implementados a diario en la Estación de Biología Tropical Roberto Franco. 84 7. CONCLUSIONES § Se logró aislar e identificar mediante análisis microbiológicos la presencia de enterobacterias del género Salmonella en ejemplares de tortugas y Crocodylus intermedius mantenidos en cautiverio en la Estación de Biología Tropical Roberto en la Ciudad de Villavicencio; estableciendo su ocurrencia en el 52% de los estanques § Se comprueba que ninguna metodología para el aislamiento de Salmonella es por sí sola suficientemente efectiva para la recuperación del microorganismo; se debe emplear más de un tipo de muestra para obtener mayor porcentaje de resultados positivos. § Los ejemplares de la E.B.T.R.F son portadores asintomáticos de Salmonella sp. , sin embargo, se deben implementar medidas de prevención que minimicen su potencial como patógeno oportunista, desencadenando cuadros clínicos de salmonelosis. § La Norfloxacina es el antibiótico ideal para tratar los ejemplares de la Estación Roberto Franco que puedan presentar sintomatología asociada a salmonelosis, aunque su administración debe ser cuidadosa con el fin de evitar alteraciones en la flora digestiva natural de los reptiles. § Las muestras obtenidas a partir del hábitat (agua, lodos y sedimento) proporcionan mayor sensibilidad en la búsqueda de Salmonella sp que el hisopado cloacal. § La mayor presencia de Salmonella sp. se obtuvo a partir de la población neonatal de caimán, aspecto que puede deberse a una transmisión vertical. § Teniendo en cuenta la presencia de aislamientos de Salmonella sp. pertenecientes a los serogrupos B, C1, C2, D1 y otros atípicos, se hace necesario implementar medidas de bioseguridad que disminuyan su riesgo zoonótico. § Este documento es el primer reporte sobre microbiología entérica en ejemplares de Crocodylus intermedius en Colombia, siendo un aporte básico para los programas de conservación, reproducción y repoblamiento de la especie. 85 8. RECOMENDACIONES § Realizar muchas más investigaciones acerca de la microbiología cloacal de animales de la Clase Reptilia puesto que muchos se encuentran en peligro de extinción y estos microorganismos bajo ciertas condiciones pueden llegar a causar serios cuadros patológicos e incluso la muerte de los ejemplares § Se recomienda realizar los aislamientos de Salmonella en reptiles a partir de muestras de origen ambiental puesto que se obtiene mayor porcentaje de aislamientos en relación a hisopado cloacal y no se genera estrés en los animales § Se plantea el uso de quinolonas como terapia antimicrobiana al encontrarse 100% de senbilidad a norfloxacina § Los medios de cultivo CHROMagar Orientación Salmonella BD® BD® y CHROMagar son altamente selectivos y diferenciales para el aislamiento e identificación de los microorganismos. § Se recomienda la implementación de medidas de bioseguridad en la estación que disminuyan los factores de riesgo zoonótico; incluso recoger periódicamente el excremento de los animales y realizar prácticas de arado en los encierros puede reducir la concentración del microorganismo. 86 9. 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Colonias pequeñas color Disco de purpura opacas con o sin halos novobiocina Colonias sin pigmento, color Identificación crema bioquímica serologíca. 107 5 µg y ANEXO Nº 3. Sistema de Identificación BBL Crystal para Entericos/NoFermentadores. Anexo 3.1. Procedimiento para la identificación de los microorganismos por sistema BBL Crystal. A. Sacar las tapas de la bolsa B. Tomar un tubo de inoculo y etiquetarlo con el número de muestra. Asépticamente con un asa estéril tomar una colonia grande bien aislada o 4 – 5 colonias pequeñas a partir de una placa de agar Tripticasa soya con 5% de sangre de cordero. Suspender las colonias en un tubo de fluido de inoculo BBL Crystal, taparlo y agitarlo en un vortex durante 10 – 15 segundos. Posteriormente, marcar la base con el número de muestra y verter todo el contenido del tubo fluido en el área objetivo de la base C. Sostener la base con las dos manos y mover el inoculo de un lado a otro a lo largo de las pistas hasta que se hallan llenado todos los pocillos. Descartar el sobrenadante. D. Alinear la tapa de forma que el extremo marcado de la tapa esté en la parte superior del objetivo de la base. E. Apretar hasta percibir una ligera resistencia. Colocar el pulgar en el borde de la tapa hacia la parte media del panel y hacer presión simultáneamente hasta que la tapa encaje. F. Colocar los paneles en las bandejas y llevar a incubación por 18 – 20 horas. 108 Anexo 3.2. Ficha técnica de reacciones de color para Lectura de Resultados. Anexo 3.3. Calculo del Número de Perfil 109 ANEXO Nº 4. Esquema de Kauffmann - White Simplificación del Esquema de Kauffmann – White para identificación de antígenos somáticos y flagelares, y, serogrupos de los serotipos de Salmonella sp. ORGANISMO GRUPO ANTÍGENO SOMÁTICO ANTIGENO FLAGELAR FASE 1 FASE 2 A B B B B B B B B B B B B B B B 1,2,12 1,3,5,12 1,4,12 1,4,5,12 4,5,12 1,4,12,27 1,4, [5],12 4,5,12 4,5,12 4,5,12 1,4,5,12 4,5,12 1,4,5,12 1,4,12 1,4,12,27 [1],4,[5],12 a b b b d d e, h e, h e, h e, h f, g m, t i i i,v r 1,2 1,2 [1,2] 1,2 1,7 1,2 1,5 e, n, x e, n, z [1,2] 1,2 1,2 1,7 1,2 C1 C1 6,7 6,7 c [c] 1,5 1,5 S. enteritidis ser Braenderup ser Montevideo ser Oranienburg ser Thompson ser Infantis * ser Othmarseenn ser Tennessee ser Muenchen ser Manhattan * ser Newport ser Blockley ser Litchfield ser Tallahassee ser Kentucky bioser Miami C1 C1 C1 C1 C1 C1 C1 C2 C2 C2 C2 C2 C2 C3 D1 6,7 6,7 6,7 6,7 [14] 6,7 [14] 6,7 [14] 6,7 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 6,8 (8), 20 1,9,12 e, h g, m, s m, t k r y z29 d d e, h k l, v z4, z32 i a e, n, z15 S. typhi D1 9,12, Vi d S. enteritidis bioser Paratyphi A ser Paratyphi B variante Odense bioser Java ser Stanley ser Schwarzengrund ser Saintpaul ser Reading ser Chester * ser Sandiego ser Derby ser California ser Typhimurium variante Copenhagen ser Bredaney ser Heilderberg S. choleraesuis bioser Kunzendorf 110 - 1,5 1,5 1,5 1,2 1,5 1,2 1,5 1,2 Z6 1,5 Cont. Simplificación del Esquema de Kauffmann – White para identificación de antígenos somáticos y flagelares, y, serogrupos de los serotipos de Salmonella sp ORGANISMO GRUPO ANTÍGENO SOMÁTICO ANTÍGENO FLAGELAR FASE 1 FASE 2 S. enteritidis ser Berta * ser Enteritidis ser Dublin ser Panama ser Javiana bioser Pullorum ser Anatum ser Meleagridis ser Give ser Newington ser Illinois ser Senftenberg ser Simsbury ser Rubislaw ser Poona ser Worthington ser Cubana ser Florida ser Madelia * ser Nottingham ser Cerro ser Siegburg ser Minnesota ser Urbana D1 D1 D1 D1 D1 D1 E1 E1 E1 E2 E3 E4 E4 F G1 G2 G2 H H I K K L N 9,12 1,9,12 1,9,12 1,9,12 1,9,12 9,12 3,10 3,10 3,10 3,15 (3), (15), 34 1,3,19 1,3,19 11 [1], 13,22, [36] 1,13,23 1,13,23 1,6,14,25 1,6,14,25 16 18 6,14,18 21 30 f, g, t g, m g, p l,v l, z28 e, h e, h l,v e, h z10 g, s, t z27 [d], r z z z29 d y d z4, z23 z4, z23 b b 1,5 1,5 1,6 l, w 1,7 1,6 1,5 [d], e, n, x 1,6 l, w 1,7 1,7 e ,n, z15 [z45] [1,5] e, n, x e, n, x Nota: La primera columna indica el nombre de la serovariedad, en la segunda columna indica el serogrupo del Ag O, en la tercera, están consignados los Ags somáticos (O). Los números indican el o los factores del Ag O y se escriben separados por una coma. En las últimas columnas, se observan los Ags flagelares (H), estableciendo los factores pertenecientes a la fase 1 (motil) denominados con letras minúsculas y en la fase 2 (no motil) se usan números. El signo (-) indica que la fase está ausente. Los factores entre paréntesis aglutinan débilmente. Los factores somáticos determinados por conversión fágica están subrayados y los que están entre corchetes pueden estar presentes o ausentes. * Serovariedades encontradas en reptiles Fuente: Laboratorios DIFCO® 111 ANEXO Nº 5: Interpretación de pruebas de sensibilidad a antimicrobianos TABLA DE INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Metodo de Difusión en Agar (Normas CLSI – NCCLS Año 2005) AGENTE ANTIMICROBIANO CARGA RESISTENTE INTERMEDIO AMICACINA 30µg Estafilococos – Haemofilus Enterobacterias SENSIBLE (mm) (mm) (mm) 14 15 - 16 17 20/10 µg 19 - 20 20/10 µg 13 14-17 18 Entericos Gram Negativos 10 µg 13 14 -16 17 Estafilococos 10 µg 28 Enterococos 10 µg 16 Haemofilus sp. 10 µg 18 19-21 22 10 µg 11 12-14 15 10 µg 19 P. aeruginosa 100µg 13 14-16 17 Enterobacterias y Acinetobacter 100µg 19 20-22 23 AMOXICILINA/CLAVULANICO AMPICILINA 29 17 AMPICILINA/SULBACTAM Entericos Gram Negativos y Estafilococos Haemofilus sp. 20 CARBENICILINA CEFACLOR 14 15-17 18 Haemofilus 30µg 16 17-19 20 CEFALOTINA 30µg 14 15-17 18 CEFAMANDOLE 30µg 14 15-17 18 CEFAZOLINA 30µg 14 15-17 18 CEFEPIME 30µg 14 15-17 18 N. gonorrea 30µg Grupo Viridans 30µg CEFETAMET 10µg N. gonorrea 10µg CEFIXIMA 5µg N. gonorrea 5µg 15 16-18 31 CEFMETAZOLE 30µg 12 13-15 16 N. gonorrea 30µg 27 28-32 33 CEFONICID 30µg 14 15-17 18 CEFOPERAZONA 75 µg 15 16-20 21 CEFOTAXIMA 30µg 14 15-22 23 N. gonorrea 30µg 31 Estreptococos Beta Hemoliticos 30µg 24 Grupo Viridans 30µg 31 21 22-23 24 18 14 15-17 29 19 25 112 26-27 28 TABLA DE INTERPRETACIÓN DE LOS RESULTADOS Metodo de Difusión en Agar (Normas CLSI – NCCLS Año 2005) AGENTE ANTIMICROBIANO CARGA RESISTENTE INTERMEDIO SENSIBLE (mm) (mm) (mm) CEFOXITINA 30µg 14 15 – 17 18 N. gonorrea 30µg 23 24-27 28 E. aureus y lugdunensis 30µg 19 20 E. coagulasa negativo excepto 30µg 24 25 lugdunensis CIPROFLOXACINA 5µg N. gonorrea 5µg 15 16-20 41 Haemofilus 5 µg 27 28-40 21 CLORAMFENICOL 30µg 12 13-17 18 E.pneumoniae 30µg 20 Haemofilus 30µg 25 26-28 29 DOXICICLINA 30µg 12 13-15 16 ENROFLOXACINA 5µg 15 16-20 21 ERITROMICINA 15µg 13 14-22 23 E.pneumoniae 15µg 15 16-20 21 Enterococos (alta resistencia) 300µg 6 7-9 10 Otros microorganismos 10µg 11 12-14 15 FLORFENICOL 30µg 16 17-20 21 Enterococos (alta resistencia) 120µg 6 7-9 10 Otros microorganismos 10µg 12 13-14 15 KANAMICINA 30µg 14 14-17 18 NALIDIXICO ACIDO 30µg 13 14-18 19 NITROFURANTOINA 10µg 14 15-16 17 NORFLOXACINA 10µg 12 13-16 17 Enterococos 10U 28 Estreptococos (- E. pneumoniae) 10U 26 N. gonorrea 10U 14 Haemofilus 5µg 16 17-19 20 E . pneumoniae 5µg 16 17-18 19 Estafilococos 30µg 14 15-18 19 Estreptococos 30µg 18 19-22 23 SULFATRIMETOPRIM 1,25/23,75 10 11-15 16 14 15-16 17 21 21 ESTREPTOMICINA GENTAMICINA PENICILINA G 29 Estafilococos 15 27-46 24 47 RIFAMPICINA Estafilococos – Enterococos y TETRACICLINA µg VANCOMICINA 30µg 113 ANEXO Nº 6. Muestras positivas para Salmonella sp. en cada estanque según cada muestreo. · Muestreo Nº 1 (N = 129) MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N = 76 ) ORIGEN DE LA MUESTRA Nº ESTANQUE AGUA / MATERIA FECAL / HISOPADO SEDIMENTO ARENA CLOACAL 2 X 5 X 6 X X 7 X 14 x 21 X 22 X 25 X TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 9 (12,3 %) MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N = 53) ORIGEN DE LA MUESTRA Nº ESTANQUE AGUA / MATERIA FECAL / HISOPADO SEDIMENTO ARENA CLOACAL 30 X 31 X 34 X 38 X 43 X 45 X 46 X 47 X 48 X 51 X TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 10 (18,8%) Caiman Adulto: 2 / Caiman Neonato: 6 / Caiman Juvenil: 2 · Muestreo Nº 2 (N = 94) MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N = 60) ORIGEN DE LA MUESTRA Nº ESTANQUE AGUA / MATERIA FECAL / HISOPADO SEDIMENTO ARENA CLOACAL 11 X X 12 X TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 3 (5%) 114 MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N = 34) ORIGEN DE LA MUESTRA Nº ESTANQUE AGUA / MATERIA FECAL / HISOPADO SEDIMENTO ARENA CLOACAL 42 X 44 X 49 X TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 3 (8,8 %) Caiman Juvenil: 1 Caiman Neonato: 2 · Muestreo Nº 3 (N = 76) MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE TESTUDINES DE LA E.B.T.R.F (N =48) ORIGEN DE LA MUESTRA Nº ESTANQUE AGUA / MATERIA FECAL/ HISOPADO SEDIMENTO ARENA CLOACAL 8 X 24 X TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 2 (4,2%) MUESTRAS POSITIVAS PARA Salmonella EN LOS ESTANQUES DE Crocodylia DE LA E.B.T.R.F (N= 28) ORIGEN DE LA MUESTRA Nº ESTANQUE AGUA / MATERIA FECAL / HISOPADO SEDIMENTO ARENA CLOACAL 33 X 36 X TOTAL DE MUESTRAS POSITIVAS: 2 (7.14 %) Caiman Adulto: 2 115