enzimas

Material elaborado por F. Agius, O. Borsani, P. Díaz, S. Gonnet, P. Irisarri, F. Milnitsky y J. Monza. Bioquímica. Facultad de Agronomía.
ENZIMAS
¿Qué son las enzimas?
Las enzimas son catalizadores biológicos que permiten que las reacciones metabólicas
ocurran a gran velocidad en condiciones compatibles con la vida.
En las células, la actividad secuencial de muchas enzimas permite que las moléculas se
degraden, o bien se formen moléculas de mayor tamaño a partir de moléculas sencillas.
Desde el punto de vista químico, las enzimas son proteínas globulares, algunas de ellas
con estructura cuaternaria. Para cumplir su función requieren conservar su estructura
nativa en la que se destaca una región formada por un número reducido de residuos
aminoacídicos que poseen afinidad por los compuestos que intervienen en la reacción.
Ese lugar se llama sitio activo, y en él se desarrolla la reacción.
El estudio de las enzimas y su actividad ha sido importante para conocer los distintos
pasos de las vías metabólicas y su regulación, para detectar enfermedades, pero también
desde un punto de vista práctico para elaborar productos útiles a nivel alimenticio,
medicinal, industrial o farmacéutico. Son ejemplos de utilización del conocimiento de la
actividad de las enzimas el empleo de renina en la producción de queso así como las
proteasas y lipasas en detergentes.
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Las enzimas se clasifican de acuerdo al tipo de reacción que catalizan
Las enzimas pertenecen a seis grupos que aparecen a continuación:
1. Oxidoreductasas, actúan en reacciones de oxidoreducción y se las llama también
deshidrogenasas.
2. Transferasas, transfieren grupos funcionales de un compuesto a otro. Las quinasas
representan un grupo especializado que transfiere grupos fosfato.
3. Hidrolasas, rompen un enlace adicionando una molécula de agua.
4. Liasas, rompen enlaces por mecanismos distintos a la hidrólisis o la oxidación. Las
decarboxilasas y aldolasas son ejemplos de liasas.
4. Isomerasas, catalizan reacciones de interconversión de isómeros.
5. Ligasas, unen moléculas utilizando energía proveniente del ATP. También se llaman
sintetasas.
El nombre específico de una enzima contiene una referencia al sustrato y al tipo de
reacción que cataliza. La denominación sistemática de una enzima se realiza según
reglas nomenclaturales mediante cuatro números precedidos de la abreviatura E.C.
(Enzymatic Code). Por ejemplo, la enzima que reduce el nitrógeno atmosférico a amonio
en los rizobios, la nitrogenasa, es la E.C.1.18.6.1.
•
Hay enzimas que necesitan un componente no proteico para actuar
Para actuar frente a su sustrato algunas enzimas requieren un componente químico
adicional que se llama cofactor.
Los cofactores pueden ser inorgánicos (Fe+2,Mn+2, Zn+2, etc.) o moléculas orgánicas
complejas llamadas coenzimas. Las coenzimas derivan de vitaminas o son la vitamina
misma. Todos los cofactores tienen que ser ingeridos en la dieta por los mamíferos y los
principales síntomas de la falta de vitaminas son consecuencia del mal funcionamiento de
alguna enzima.
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Las enzimas son proteínas eficientes, específicas y regulables
Las enzimas son catalizadores biológicos que, como los catalizadores químicos,
aceleran reacciones y no se alteran durante la reacción, por lo que pueden intervenir
muchas veces catalizando la misma reacción. A diferencia de otros catalizadores, las
enzimas tienen en su estructura, el sitio activo que les permite unir y orientar las
moléculas que intervienen en la reacción y de esa forma maximizan la posibilidad de
formación o ruptura de enlaces que es necesaria para la obtención de productos. Son, por
lo tanto, moléculas eficientes. Una enzima es capaz de catalizar la conversión de
alrededor de mil moléculas de sustrato en producto, por segundo.
El interior de la célula es denso y, aunque los sustratos y las enzimas están en número
relativamente pequeño, se pueden encontrar y dar lugar al complejo ES porque están en
continuo movimiento. Las enzimas se mueven más lentamente que los sustratos y la
velocidad de encuentro va a depender de la concentración de sustrato presente.
El sitio activo tiene una forma determinada por el ordenamiento espacial de los - R que es
única y que es reconocida por su sustrato. Esta es la base de otra de las características
de las enzimas que es su especificidad.
En el sitio activo los grupos - R están próximos debido a los plegamientos originados por
las estructuras secundaria y terciaria, a pesar de que están alejados en la estructura
primaria de la enzima. Estos - R participan en la reacción, algunos uniendo y orientando el
sustrato y otros, formando o rompiendo enlaces.
Algunas enzimas presentan especificidad absoluta porque la topografía del sitio activo
además de ordenada es rígida lo que se ha esquematizado con el modelo de llavecerradura. Sin embargo, muchas enzimas presentan especificidad relativa porque pueden
catalizar el mismo tipo de reacción con más de un sustrato estructuralmente similar o
permitir la unión de un sustrato no complementario que igual permita la formación de
productos.
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modelo llave-cerradura
modelo de ajuste inducido
En el metabolismo, el producto de la acción de una enzima es el sustrato de la siguiente y
aunque las reacciones tienden al equilibrio, no llegan nunca a él porque los sustratos y
productos están en continua transformación. El conjunto de reacciones que forman una
vía metabólica, está de todas maneras controlado por enzimas cuya estructura es
sensible a las variaciónes de concentración de sustratos, productos, compuestos
intermedios o de productos finales de las cadenas metabólicas. Las enzimas son, por lo
tanto, regulables.
•
Las enzimas tienen un pH y una temperatura óptimos
Las enzimas son catalizadores biológicos que tienen una configuración nativa
determinada por las fuerzas estabilizadoras de la proteína.
Cualquier factor externo que altere esas fuerzas va a modificar la actividad de la misma.
La gráfica muestra la variación de la actividad de una enzima mitocondrial (fumarasa) a
distintos pH.
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Los valores de pH o temperatura óptimos varían según la enzima pero en todos los casos
permiten que la estructura del sitio activo sea la más adecuada para la catálisis.
La cinética enzimática ayuda a conocer el mecanismo de reacción
La cinética enzimática estudia las velocidades de las reacciones catalizadas por enzimas
y su variación frente a cambios de parámetros experimentales.
La velocidad de una reacción química corresponde al número de moléculas de reactivo(s)
que se convierten en producto(s) por unidad de tiempo y depende de la concentración de
los compuestos incluídos en el proceso y de la constante de velocidad que es una
característica de la reacción. Por ejemplo, la conversión reversible de A en B tiene una
velocidad de reacción directa cuya ecuación es:
v= k+1[A]
y otra inversa que es v inversa = k-1[B]
donde k+1 y k-1 son las constantes de velocidad y [A] y [B] simbolizan las concentraciones
de A y B respectivamente.
En el equilibrio, las dos velocidades son iguales lo que lleva a definir la constante de
equilibrio de la reacción (Keq)
Keq = k+1/k-1 = [B] / [A]
Todas las enzimas actúan en general de la misma manera, aún cuando el mecanismo de
acción de cada enzima es único. Los reactivos y los productos están en concentraciones
cientos o miles de veces mayores que las de la enzima en una reacción enzimática típica.
Por lo tanto, cada molécula de enzima cataliza la conversión en producto de varias
moléculas de reactivo. A los reactivos en bioquímica los llamamos sustratos y su
conversión en productos ocurre en el sitio activo de la enzima. El complejo que se forma
cuando el sustrato y la enzima se combinan se llama complejo enzima-sustrato (ES).
Entre la unión del sustrato a la enzima y la reaparición de enzima libre y productos se
producen una serie de pasos que se resumen a continuación:
E+S
ES
EP
E + P
La cantidad de producto formado a partir de una determinada concentración de sustrato y
de enzima varía con el tiempo. Solamente en los primeros minutos de la reacción existe
una relación lineal entre el producto formado y el tiempo. La velocidad de la reacción
calculada a partir de los datos de esos primeros minutos, es lo que llamamos velocidad
inicial (v o ) y este es el término al que nos referiremos de ahora en adelante cuando
hablemos de velocidad.
La velocidad (vo) de una reacción enzimática se puede medir por la variación de la
cantidad de sustrato transformado, o la cantidad de producto formado por unidad de
tiempo. En algunas reacciones en las que intervienen coenzimas, la velocidad puede
medirse por la cantidad de coenzima transformada por unidad de tiempo en lugar de
medir el sustrato o el producto.
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Las reacciones catalizadas por enzimas tienen cinética de saturación
Cuando se miden las velocidades iniciales (vo) de una reacción enzimática con distintas
concentraciones de sustrato [S] en las mismas condiciones de pH y temperatura y
manteniendo constante la concentración de enzima [E], se obtiene una curva como se
representa a continuación:
Para valores bajos de [S] la vo aumenta en forma directamente proporcional a la [S]. En
ese tramo, cada vez más moléculas de S forman el complejo ES y la reacción tiene
cinética de primer orden. En este caso la reacción se representa como vo ∝ k [S] 1
A determinada [S], todas las moléculas de S están formando ES y entonces la vo se hace
independiente de la [S], la cinética de la reacción es de orden 0 y se alcanza la Vmáx . En
este caso la reacción se representa como vo ∝ k [S] 0. La reacción en presencia de mayor
[S] no produce mayor velocidad porque todas las moléculas de enzima están saturadas
con sustrato.
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La relación entre la v o y [S] se puede expresar cuantitativamente
La cinética de las reacciones esquematizadas anteriormente fue caracterizada por los
investigadores Michaelis y Menten. La ecuación de Michaelis-Menten es:
vo = Vmáx [S]
Km +[S]
(1)
Esta ecuación es una descripción cuantitativa de la relación entre la velocidad (vo) de una
reacción catalizada por una enzima, la concentración de sustrato [S] y dos constantes
Vmáx y Km (constante de Michaelis). Esta ecuación es una hipérbola equilátera con
coordenadas vo y [S] y donde Vmáx es la asíntota de la gráfica.
Ø La ecuación puede ser usada para demostrar que la concentración de sustrato
necesaria para alcanzar la mitad de Vmáx, es numéricamente igual a Km.
Las unidades de Km son, por lo tanto, unidades de concentración, usualmente molaridad.
Km puede definirse como la [S] a la que la enzima alcanza la mitad de su velocidad
máxima o la [S] a la que la mitad de las moléculas de enzima están formando ES.
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En condiciones definidas de pH y temperatura, los valores de Km y Vmáx son las
constantes cinéticas de una determinada enzima frente a su sustrato.
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Km y V máx se calculan por el método de las inversas
La forma de determinar Km por el método gráfico definido antes, no es la usada en la
práctica; rara vez se llega a medir Vmáx por problemas tales como la solubilidad del
sustrato a concentraciones altas. Se utiliza entonces, la transformación de la ecuación (1)
realizada por Lineweaver-Burk que consistió en tomar la inversa de cada término. La
ecuación queda como :
1 = Km
vo
Vmáx
.
1 +
1
[S]
Vmáx
(2)
La representación gráfica con coordenadas 1/vo y 1/[S] es una recta. El corte de la recta
con el eje de las ordenadas permite calcular Vmáx y el corte con el eje de las abscisas
permite calcular Km.
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Las enzimas pueden ser inhibidas por moléculas específicas
Algunos antibióticos, medicamentos quimioterapéuticos, insecticidas y herbicidas son
sustancias que interfieren en el funcionamiento de enzimas específicas. En las células
naturalmente se producen inhibiciones de enzimas lo que se conoce como biorregulación.
Los inhibidores pueden unirse reversible o irreversiblemente a las enzimas. Los
inhibidores irreversibles se unen covalentemente a residuos aminoacídicos de la enzima
impidiendo su acción. Este es el efecto de Hg+2, Pb+2 , los gases neurotóxicos y los
compuestos arsenicales.
Los inhibidores reversibles se unen a la enzima por el mismo tipo de interacciones que
se producen entre las enzimas y los sustratos y dentro de ellos se encuentran los
inhibidores competitivos y no competitivos.
Ø Inhibición competitiva
Cuando un inhibidor competitivo Ic omp y un sustrato S están en presencia de una enzima,
compiten entre sí por ocupar el sitio activo de la misma. El inhibidor competitivo tiene
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generalmente una estructura similar a la del sustrato por lo que tiene posibilidad de formar
un complejo EIcomp que no permite formar el complejo ES. El complejo EIcomp no da
productos y disminuye el número de moléculas de E libres en condiciones de
interaccionar con el S. Por eso la cantidad de producto formado con la misma cantidad de
sustrato es menor en presencia de inhibidor competitivo.
La unión del inhibidor competitivo a la E es reversible y por eso se puede aumentar el
número de moléculas de E libre aumentando la [S].
Las sulfas que inhiben pasos metabólicos exclusivos de bacterias y el fluoruracilo que se
usa para tratar el cáncer, son ejemplos de inhibidores competitivos. A nivel de
bioregulación se puede citar como ejemplo la inhibición por producto cuando se empieza
a acumular el producto de una reacción.
En la figura se esquematizan la interacción enzima sustrato y el mecanismo de acción de
dos tipos de inhibidores.
Ø Inhibición no competitiva
Cuando el efecto de una sustancia inhibidora no se puede revertir aumentando la [S], el
inhibidor es no competitivo. Este compuesto se une a un sitio distinto al sitio activo y por
eso puede formarse el complejo enzima-sustrato-inhibidor (EIS) que no da productos. De
hecho, la presencia del inhibidor actúa como si disminuyera la [E] presente y por eso
nunca se llega a la Vmáx por más que se aumente la [S]. Las moléculas de E libre que
están en condiciones de actuar y dar producto, se comportan como si no hubiera inhibidor
y por eso el Km de la reacción no varía.
Las modificaciones de las constantes cinéticas de una enzima frente a un inhibidor
competitivo y a uno no competitivo, se presentan en la figura siguiente:
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En las células, las enzimas están reguladas
En una misma célula coexisten sustratos y enzimas de reacciones de síntesis y
degradación. Para que el metabolismo sea armónico y adecuado a las necesidades
celulares, es necesaria la regulación enzimática. Esta regulación se puede realizar sobre
la actividad de enzimas ya sintetizadas o sobre la cantidad de enzima.
La cantidad se modifica por degradación o por síntesis de las enzimas lo que será
estudiado más adelante. Cualquiera de estos mecanismos son lentos y por eso se
necesitan otras formas de regulación.
La actividad de las enzimas puede ser modificada por la acción de inhibidores que ya fue
analizada, por la acción de moduladores alostéricos sobre enzimas alostéricas o por
modificación covalente de la enzima.
•
Enzimas reguladoras o alostéricas
La mayoría de las enzimas que catalizan reacciones sucesivas en las vías metabólicas
tienen cinética de Michaelis Menten. La regulación del conjunto de la vía está a cargo de
enzimas reguladoras o enzimas alostéricas que tienen una cinética distinta.
Las enzimas alostéricas catalizan pasos ubicados al principio de la vía o en puntos de
ramificación de la misma y su actividad está modulada por la unión de moléculas
fisiológicamente importantes que se conocen como efectores o moduladores.
Estas enzimas tienen muchas veces estructura cuaternaria y cada molécula de enzima
tiene varios sitios activos. La unión de una molécula de sustrato al primer sitio activo
produce un aumento de afinidad del segundo sitio por otra molécula de sustrato y así
sucesivamente (efecto cooperativo). Esto explica que la representación gráfica vo contra
[S] sea una curva sigmoidea y no una hipérbola como es el caso de las enzimas con
cinética de Michaelis Menten.
Además de los sitios activos, estas enzimas tienen sitios alostéricos a los que se unen
los moduladores alostéricos. La unión del modulador al sitio alostérico origina cambios
conformacionales que se trasmiten a través de la molécula de la proteína hasta el sitio
activo alterando las propiedades catalíticas de la enzima. Los que incrementan la
actividad catalítica, se conocen como moduladores positivos. Los que reducen o inhiben
la actividad catalítica son moduladores negativos.
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Un ejemplo de regulación alostérica en una vía metabólica es la inhibición por
retroalimentación donde la acumulación de producto final actúa como modulador negativo
de la primera enzima de la vía como se esquematiza a continuación.
A
•
B
C
D
E
F
Modificaciones covalentes
Existen enzimas que se regulan por el pasaje de una forma activa a inactiva debido a la
formación o rotura reversible o irreversible de enlaces covalentes.
En muchos casos no es suficiente la modulación alostérica para la regulación de todas las
vías metabólicas. Por eso algunas enzimas tienen un mecanismo rápido de regulación
que permite el pasaje de una forma activa a una forma inactiva. Un ejemplo de este tipo
de regulación es la unión de un grupo fosfato a un – OH de un residuo de aminoácido de
la molécula de enzima que permite la transformación de una forma en otra. Esta es una
modificación covalente reversible.
La transformación de zimógenos en enzimas activas es un tipo de modificación covalente
irreversible. Esto ocurre en enzimas en las que se elimina parte de la cadena proteica y,
como consecuencia, el nuevo ordenamiento (plegamiento) permite la formación del sitio
activo en la molécula. Este es el caso de la transformación de pepsinógeno, tripsinógeno
o quimiotripsinógeno en enzimas proteolíticas activas.
En las células eucariotas la compartimentación es otra forma de regular el funcionamiento
simultáneo de distintas reacciones; por ejemplo la degradación de los ácidos grasos
ocurre en la mitocondria y su síntesis en el citoplasma.