Fecha emisión: 01/06/2002 Revisión: 4 ENUMERACIÓN DE

Fecha emisión:
01/06/2002
Revisión: 4
Sección Microbiología
de Alimentos
ENUMERACIÓN DE
ENTEROBACTERIACEAE EN ALIMENTOS
SIN RESUSCITACIÓN.
TECNICA NUMERO MAS PROBABLE (NMP) Fecha revisión:
08/05/2008
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1.
OBJETIVO
Estimar el número de Enterobactereaceas presentes en el alimento.
2.
CAMPO DE APLICACIÓN Y ALCANCE
Aplicar este procedimiento a todas las muestras de alimentos que se sospeche un bajo contenido
de microorganismos presentes (1 a 100 por gramo o mililitros de muestra).
3.
FUNDAMENTO
Esta metodología tiene una etapa presuntiva de siembra en caldo de enriquecimiento y una etapa
confirmativa.
4.
4.1
REFERENCIAS
General Guidance for the Enumeration of Enterobacteriaceae without resuscitation. –MPN
technique and colony-count technique-ISO Número 7402/1993.
5.
TERMINOLOGÍA
No Aplica
6.
MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS
6.1
EQUIPOS
6.1.1 Baño de agua 48-50ºC
6.1.2 Incubadora 35 ºC ± 0,5
6.1.3 Vortex mixer
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6.2
6.2.1
6.2.2
6.2.3
6.2.4
6.2.5
6.2.6
6.2.7
MATERIAL DE LABORATORIO
Placas Petri de 15x100mm.
Pipetas estériles de 1 y 5mL
Asa de nicrón (aprox. de 3mm de diámetro).
Tubos estériles de 16x160 mm.
Mondadientes de madera o asa de vidrio
Mecheros Bunsen
Frascos de capacidad ± 160 mL.
6.3
6.3.1
MEDIOS DE CULTIVOS Y REACTIVOS
Caldo de enriquecimiento Enterobacteriaceae (caldo EE) en tubos tapa rosca de
16x160mm con 10 mL de medio. (Almacenar hasta 1 semana 4ºC)
Caldo de enriquecimiento Enterobacteriaceae doble concentración (caldo EE) en tubos
tapa rosca de 18x180mm con 10 mL de medio.
Agar VRBG, este debe ser preparado justo antes de usar.
Agar nutritivo o agar BAB (en placa Petri con 15 a 18 mL).
Agar glucosa
Solución acuosa de dihidrocloruro de tetrametilparafenilendiamina al 1%
Etanol 70%
6.3.2
6.3.3
6.3.4
6.3.5
6.3.6
6.3.7
7.
DESARROLLO
7.1
Etapa presuntiva
7.1.1 Preparar diluciones decimales de la muestra de alimento (10-1 y 10-2).
7.1.2 Inocular 3 tubos de caldo de enriquecimiento Enterobacteriaceae doble concentración
con 10 mL de muestra de muestra si el producto es líquido, o 10 mL de la suspensión
inicial en el caso de los otros productos.
7.1.3 Inocular 3 tubos de caldo de enriquecimiento Enterobacteriaceae de caldo concentración
simple con 1 mL de la muestra si el producto es líquido o con 1 mL de la suspensión
inicial en el caso de los otros productos.
7.1.4 Inocular 3 tubos de caldo de enriquecimiento Enterobacteriaceae de caldo concentración
simple con 1 mL de la dilución 10-1 si el producto es líquido o con 1 mL de la dilución
10-2 en el caso de los otros productos.
7.1.5 Agitar suavemente la gradilla para mezclar la muestra con el medio de cultivo.
7.1.6 Incubar los tubos a 35 ºC por 24 hrs.
7.1.7 Leer los tubos. Considerar positivos los tubos que presentan turbidez.
7.1.8 Registrar el resultado de cada tubo por dilución en registro RG-712.00-024
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7.2
7.2.1
7.2.2
7.2.3
7.2.4
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Aislamiento
De cada uno de los 9 tubos incubados en el punto anterior traspasar una asada en agar
VRBG.
Incubar las placas de VRBG entre 35 y 37 ºC por 24 horas.
Seleccionar 5 colonia típicas para confirmación bioquímica. (Colonias típicas: colonias
de color rosa a rojo con o sin halo de precipitación, o mucoides e incoloras).
Inocular una placa con una cepa de E. coli, otra con S. aureus Anotar en el RG-712.00004. En paralelo incubar una placa sin inocular como control de esterilidad del medio,
anotar en el RG-712.00-006.
7.3
Etapa confirmativa
7.3.1 Subcultivo
7.3.1.1 Repicar 5 colonias típicas en agar nutritivo en placa, para realizar pruebas bioquímicas
confirmativas.
7.3.1.2 Incubar las placas a 35 a 37 º C por 24 ± 2 hrs.
7.3.1.3 Agregar control positivo E. coli y control negativo S. aureus.
7.3.1.4 Seleccionar una colonia aislada desde cada una de las placas incubadas, para la
confirmación bioquímica.
7.3.2 Prueba de oxidasa
7.3.2.1 Usar asa de inoculación de platino/iridio o de vidrio, tomar una porción de cada colonia
aislada y colocar en contacto con papel filtro recientemente humedecido con el reactivo
de oxidasa. No se debe usar asa de inoculación de níquel /cromo.
7.3.2.2 Considerar que la prueba es negativa cuando el color del papel filtro no se ha tornado
azul en 10 segundos. Las Enterobacterias son oxidasa negativa. Como control positivo
de reacción se puede usar Pseudomona aeruginosa y como control negativo de
reacción E.coli.
7.3.2.3 Anotar en el Registro RG-712.00-024.
7.3.3 Prueba de fermentación
7.3.3.1 Repicar en profundidad, usando un asa de inoculación, las mismas colonias
seleccionadas para la prueba de oxidasa (7.3.2) en tubos de agar glucosa previamente
aireado y enfriado. Incluir una cepa de E. coli como control positivo y una cepa
Pseudomona aeruginosa como control negativo.
7.3.3.2 Incubar a 35 a 37 ºC por 24 ± 2 hrs.
7.3.3.3 Si se desarrolla un color amarillo a lo largo del contenido del tubo, la reacción se
considera positiva. La mayoría de las cepas producen gas.
7.3.3.4 Anotar en el Registro RG-712.00-024
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7.4 EXPRESIÓN DE RESULTADOS
7.4.1 Contar el número de tubos que dan una reacción positiva para cada dilución.
7.4.2 Si una de las colonias seleccionadas es oxidasa negativa y glucosa positiva, el tubo del
cual deriva el subcultivo es considerado positivo.
7.4.3 Usando la tabla de NMP, determinar el número de tubos positivos en las diferentes
diluciones para calcular el índice de Número Mas Problable (NMP).
7.4.4 En el caso de productos líquidos, el número de Enterobacteriaceae por mL es calculado
dividiendo el índice NMP por 10.
7.4.5 En caso de otros productos donde se prepara una suspensión inicial, el número por
gramo es igual al índice NMP.
7.4.6 Expresar los resultados en gérmenes/ g o mL de muestra.
7.4.7 Es conocido que amplias variaciones pueden ocurrir en la técnica de NMP. Los
resultados obtenidos por este método deberían ser usados con precaución. Los límites e
confianza están dados en el anexo A de la norma (ISO 7402/1993).
8.
REGISTROS
Identificación
del registro
RG-712.00-004
Almacenamiento
Protección Recuperación Tiempo retención y
disposición
Archivador rojo rotulado Acceso libre Papel
Almacenar por 5 años
Registro de Controles al personal
y disponer en la basura
laboratorio 348
del
cortado en trozos.
laboratorio
348.
RG-712.00-006
Archivador rojo rotulado Acceso libre Papel
Registro de Controles al personal
laboratorio 348
del
laboratorio
348.
Almacenar por 5 años
y disponer en la basura
cortado en trozos.
RG-712.00-024
Archivador azul rotulado Acceso libre Papel
Registro de Lecturas de al personal
Informe de Resultados del
laboratorio
de laboratorio
enterobacterias
348.
Almacenar por 5 años
y disponer en la basura
cortado en trozos.
RG-712.00-050
Archivador rojo rotulado Acceso libre Papel
Almacenar por 5 años
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Identificación
del registro
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Almacenamiento
Protección Recuperación Tiempo retención y
disposición
Registro de Controles al personal
y disponer en la basura
laboratorio 348
del
cortado en trozos.
laboratorio
348.
TABLA DE MODIFICACIONES
Revisión Nº
Pág.
Modificada
Página 2 punto
6.3.1
Página 2 punto
6.3.3
Página 2 punto
6.3.5
Página 3
Motivo del cambio
Se incluye una recomendación
del uso del medio de cultivo
Se incluye una recomendación
del uso del medio de cultivo
El medio utilizado en la norma
ISO 7402 es el agar glucosa
Se incluyo etapa de aislamiento
que no estaba considerada en el
procedimiento
Página 3 punto Se cambia la palabra
7.3.1.1
característica por la palabra
típica
Pagina 4 punto Se corrige un error en la
7.3.2
interpretación de resultados, dice
“oxidasa positiva…..es
considerado positivo” y lo
correcto es “oxidasa
negativa….es considerado
positivo”
Pagina 3 Punto Se incluye controles de calidad
7.2.4
Página 4 punto Se incluye los controles para las
7.3.3.1 y 7.3.2.2 pruebas confirmativas.
Página 5 punto Indica que “Los límites de
7.4.7
confianza están dados en el
anexo A”, se agrega las palabras
(ISO 7402/1993).
Fecha Aprobación
08/05/2008
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10. ANEXOS
10.1 Anexo Nº 1 RG-712.00-024, Registro de análisis de muestras de alimentos laboratorio
Enterobacteria.
10.2 Anexo Nº 2 RG-712.00-050, Registro control de ambiente laboratorio Enterobacterias.
10.3 Anexo Nº 3 Anexo A General Guidance for the Enumeration of Enterobacteriaceae
without resuscitation. –MPN technique and colony-count technique-ISO Número
7402/1993.
10.4 Anexo Nº 4 RG-712.00-004 Registro cepas control de Incubadoras.
10.5 Anexo Nº5 RG-712.00-006 Registro de Control de Esterilidad de Medios Cultivo
utilizados en el Análisis de coliformes, coliformes fecales, E. coli y Enterobacterias