QUANTIMIX EASY HRM KIT.esp.Ed.07 Marzo 14

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1. DESCRIPCIÓN
“High Resolution Melt (HRM) Assay” es una tecnología de gran utilidad para la
detección de mutaciones, polimorfismos y variantes epigenéticas en muestras de
ADN de doble hebra. Entre las mutaciones que se pueden detectar con este análisis
se encuentran: polimorfismos de nucleótido simple (SNP), mutaciones nuevas, o
incluso discriminar una variante de ADN mutado minoritario en una muestra con
predominio de la secuencia salvaje. La base del análisis por HRM es la
caracterización de muestras ADN por el perfil de disociación de sus hebras
(melting), acontecido durante un gradiente ascendente de temperatura.
High Resolution Melt Assay es un método simple y económico que no requiere
ensayos post-PCR. Esta tecnología ha sido posible gracias al desarrollo de
termocicladores y software especializados, así como por la aparición de
fluorocromos de tercera generación con gran afinidad por el ADN doble cadena. La
intensidad de fluorescencia emitida por estos productos al unirse al ADN es superior
a la de sus antecesores, y a la concentración de saturación no inhiben la PCR.
QUANTIMIX EASY HRM KIT ha sido optimizado para conseguir la máxima
eficiencia, precisión y sensibilidad en reacciones de amplificación en tiempo real,
utilizando un fluoróforo intercalante de tercera generación. La master mix del kit
contiene todos los componentes necesarios para llevar a cabo la reacción de
amplificación, incluyendo una polimerasa con efecto hot-start (Biotools HotSplit DNA
Polymerase) que minimiza la formación de productos de amplificación inespecíficos
y de dímeros de primer, mejorando, la sensibilidad y especificidad del análisis por
HRM. La utilización de esta master mix facilita la manipulación reduciendo las
etapas de pipeteo, el tiempo de operación y los errores de pipeteo que pueden
tener efectos drásticos en estos ensayos.
2. REACTIVOS INCLUIDOS EN EL KIT
•
QUANTIHRM: Se trata de una Master Mix 2X lista para usar que
contiene todos los componentes necesarios para la amplificación de
ADN en tiempo real: Biotools HotSplit DNA Polymerase, dNTPs, Buffer
de Reacción y MgCl2 (4mM final).
•
50 mM MgCl2 Solution: Su uso sólo está indicado para reacciones de
amplificación que requieran optimización adicional (concentración final
2
de iones Mg >4mM).
El fluoróforo intercalante para ensayos de HRM no se proporciona
con el kit
3. MANIPULACIÓN Y ALMACENAMIENTO
Almacenar todos los componentes del QUANTIMIX EASY HRM Kit a -20ºC en un
congelador que garantice una temperatura constante (no se recomiendan
congeladores frost-free). Los reactivos deben ser descongelados y manipulados
en hielo. Para uso frecuente del kit se recomienda realizar alícuotas a fin de
evitar ciclos frecuentes de congelamiento/descongelamiento.
• QUANTIHRM: Mezclar antes de usar.
• MgCl2 Solution: Mezclar exhaustivamente antes de usar.
Si el kit se manipula y conserva siguiendo estas recomendaciones, su estabilidad
será la indicada en la etiqueta correspondiente.
QUANTIMIX EASY HRM KIT
Kit para el análisis de curvas de disociación de alta resolución
REF.
FORMATO
CONTENIDO
10.641
100 rxn
Quantimix Easy HRM Kit
10.642
200 rxn
Quantimix Easy HRM Kit
10.643
500 rxn
Quantimix Easy HRM Kit
Almacenar a -20ºC
Uso exclusivo en investigación. No para uso en procedimientos diagnósticos
Aviso a usuarios: Algunas de las aplicaciones que pueden llevarse a cabo con este producto están cubiertas por patentes
aplicables en ciertos países. La adquisición de este producto no incluye o provee de una licencia para realizar aplicaciones
patentadas. En algunos casos, los usuarios tienen la obligación de adquirir una licencia, dependiendo del país y/o la aplicación.
Ed .7 – Marzo 14
4. CONSIDERACIONES GENERALES
El éxito del análisis por HRM depende en gran medida de una optimización
adecuada de la PCR previa. La presencia de productos de amplificación
inespecíficos y/o dímeros de primer pueden invalidar el ensayo. Pequeñas
diferencias en las curvas de melting pueden ser originadas por diferencias en la
secuencia y/o longitud de los amplicones, presencia de impurezas en las
muestras de ADN, diseño de primers inadecuado, entre otras.
Molde: Se recomienda utilizar el mismo proceso de extracción y purificación para
todas las muestras de ADN incluidas en el ensayo. Biotools recomienda su línea
de productos Speedtools para la extracción y purificación de ADN genómico a
partir de sangre (Speedtools DNA Extraction Kit), de tejido (Speedtools Tissue
DNA Extraction Kit), de comida (Speedtools Food DNA Extraction Kit) y de
plantas (Speedtools Plant DNA Extraction Kit).
A fin de conseguir resultados fiables en las curvas de disociación de alta resolución,
la concentración de ADN de las muestras a procesar debe de ser similar entre ellas.
Cuantificar el contenido de ADN e intentar ajustar todas las muestras a la misma
concentración. Los resultados del análisis pueden variar dependiendo tanto por la
calidad del molde como por la secuencia del amplicón analizado. Muestras de ADN
de baja calidad pueden generar productos de amplificación inespecíficos que
dificulten o incluso invaliden el análisis posterior.
Diseño del Amplicón: La longitud del amplicón generado en la PCR puede
afectar la sensibilidad y especificidad del análisis por HRM. Amplicones cortos
generan perfiles de melting fáciles de interpretar pues la incidencia de la
mutación en el perfil del fragmento completo es superior. El tamaño
recomendado de los fragmentos de amplificación para análisis de HRM es de
100-300 bp; sin embargo, para la detección de SNP se recomiendan amplicones
entre 80-100 bp. Productos de mayor tamaño pueden analizarse correctamente
por HRM, aunque la sensibilidad del ensayo suele reducirse.
La secuencia del producto de PCR también incide en el análisis post-PCR. Por
ejemplo, cuando la secuencia del amplicón presenta un alto contenido en GC o
estructuras secundarias, puede dificultarse la detección de mutaciones puntuales.
Diseño y concentración de primers: La presencia de dímeros de primers y/o de
productos de amplificación inespecíficos reduce significativamente la eficacia del
análisis por HRM. Al diseñar los cebadores evitar seleccionar parejas de primers
que posean 2 ó 3 bases complementarias en el extremo 3’ porque favorecen la
formación de dímeros. Se recomienda diseñar primers que posean entre 18-30bp
de longitud, con una temperatura de anillamiento entre 55-65°C (y similar entre
ambos) y con un contenido en GC entre 40-60%. Los primers a seleccionar
deberán amplificar un fragmento de ADN corto y la mutación a analizar tiene que
estar flanqueada por los mismos.
La concentración de primers a utilizar en PCR con análisis de HRM posterior
suele ser inferior a la utilizada en experimentos de qPCR convencionales (a fin
de evitar la formación de dímeros) y debe de ser optimizada experimentalmente.
La concentración de primers recomendada es de 0.05-0.5 µM.
Programa de PCR: Ciertos parámetros de la programación afectan tanto la
especificidad como la eficiencia de la amplificación. Debido al pequeño tamaño
de los amplicones, los programas de ciclado para qPCR suelen ser más cortos
que en PCRs convencionales; en tanto que el número de ciclos de amplificación
recomendados para ensayos de HRM es superior que en qPCRs estándares (4050 ciclos).
Para resolver perfiles de melting de variantes heterozigotos con mayor
resolución, se recomienda incluir una etapa de pre-melting (calentamiento y
enfriamiento rápido a 50°C) que garantiza la formac ión de los dúplex
(especialmente los hetero-dúplex), antes de la captura de los datos de melting.
Para realizar el análisis de HRM seleccionar una ventana de temperaturas de
melting de aproximadamente 10°C y centrada alrededor de la Tm del amplicón.
Para determinar la Tm de productos nuevos, puede realizar un primer análisis de
HRM en un rango amplio de temperaturas que incluya los puntos de melting
esperados (65-95°C); y en siguientes experimentos r educirlo a aproximadamente
10°C (Tm del amplicón ± 5°C):
A fin de evitar la formación de dímeros de primers y/o productos de amplificación
inespecíficos, muy perjudiciales en el análisis de HRM, puede seleccionar un
programa de amplificación “touch-down”.
5. PROTOCOLO ESTÁNDAR
6. SOLUCIÓN DE PROBLEMAS
Antes de realizar el análisis de HRM, examinar atentamente las gráficas de
amplificación en tiempo real a fin de detectar anomalías en la PCR. Los problemas
más frecuentes en el análisis de HRM suelen deberse a fallos en la amplificación
(Ct>30 ciclos, productos de amplificación inespecíficos, dímeros de primer, entre
otros) que suelen dificultar la interpretación del análisis de HRM.
Problemas con la PCR
Materiales que deberán ser aportados por el usuario:
•
•
•
•
La interpretación de los resultados es realizada con la ayuda de software
específicos disponibles para los termocicladores de HRM, seguir las instrucciones
dadas por el fabricante para realizar el análisis posterior a la PCR. Una selección
inadecuada de las regiones de pre-melting y post-melting puede invalidar o afectar
el análisis de HRM; entre ellas la más crítica es la de pre-melting ya que la
selección correcta de esta región puede maximizar las diferencias entre las
variantes genéticas analizadas.
1. Corroborar la calidad y cantidad de los ADNs. Corroborar la calidad y
Fluoróforo intercalante para ensayos de HRM
Downstream primer
Upstream primer
Agua libre de nucleasas
cantidad del ADN mediante electroforesis en gel de agarosa o por
fluorimetría. Utilizar una concentración suficiente de molde y cantidades
equivalentes entre las diferentes muestras. Para un correcto análisis de HRM
posterior, las curvas de amplificación deben poseer una Ct≤30 ciclos.
Evitar el arrastre de inhibidores durante el proceso de purificación (ej. etanol).
Si sospecha la presencia de inhibidores, realizar diluciones del ADN molde y
repetir el ensayo.
El flujo de trabajo en el laboratorio debe de ser unidireccional, desde el área de preamplificación hacia el área de amplificación. Utilizar equipamiento específico para cada
área de trabajo.
2.
2.-Diluir el fluoróforo. Algunos fluoróroro intercalante requieren una dilución previa
a partir de la solución stock; para ello siga las instrucciones del fabricante. Proteger
el fluorocromo de una exposición prolongada a la luz.
Revisar el diseño y la concentración de primers. Si bien una
concentración de primers baja suele prevenir la formación de dímeros, ésta
deberá ser suficiente para que la amplificación resulte óptima (concentración
recomendada ≤ 0.5 µM). Incrementar la concentración de primers en
incrementos de 0.05 µM, y migrar los productos de PCR en gel a fin de
descartar la presencia de productos de amplificación inespecíficos.
3.
Optimizar la concentración del fluoróforo. Incrementar la proporción de
fluoróforo intercalante en la reacción.
3.- Se recomienda incluir controles positivos y negativos en cada experimento
4.
Revisar la programación:
-Incrementar el número de ciclos de amplificación (tener precaución con la
formación de productos inespecíficos).
-Revisar la etapa de detección de fluorescencia. Asegurarse de que la lectura
de la fluorescencia ha sido activada en la etapa del ciclo correcta.
-Selección del canal adecuado. Los termocicladores de tiempo real suelen
poseer múltiples canales para la detección de fluorocromos, asegurarse de
haber activado el canal apropiado para su fluoróforo.
-Seleccionar un programa de amplificación “touch-down” a fin de reducir la
formación de productos inespecíficos y/o dímeros de primer.
MANTENER REFRIGERADOS LOS TUBOS DE REACCIÓN
Trabajar en el área de preparación de reactivos en una cabina de flujo laminar. Utilizar
guantes y material plástico libre de nucleasas, y puntas de pipeta con filtro.
1.- Descongelar y mezclar cuidadosamente los reactivos antes de su dispensación.
4- Preparar la master mix siguiendo las instrucciones de la TABLA 1.
TABLA 1. Preparación de la Master Mix
COMPONENTES
Concentración Final
QUANTIHRM 2X
1X
50 mM MgCl2 Solution*
4-6 mM
0.05-0.5 µM
Primers
+
Fluoróforo para HRM
Agua libre de nucleasas
ADN molde
2-15 ng de ADNg
20 µl rxn
10 µl
x µl
x µl
x µl
Hasta 20 µl
x µl
Análisis de HRM no concluyente
1.
Gráficas de melting de duplicados muy distanciadas. Corroborar que la
concentración de ADN de las diferentes muestras sea similar.
2.
Múltiples dominios de melting. Presencia de más de un sitio de mutación
en el amplicón: re-optimizar la PCR y/o rediseñar primers que permitan
obtener un amplicón de menor longitud y confirmar mediante secuenciación.
3.
Análisis de HRM no permite discriminar claramente entre homocigotos
y heterocigotos. Presencia de productos de amplificación inespecíficos y/o
dímeros de primers: realizar la PCR seguida de análisis de melting.
*Sólo necesario para concentraciones de MgCl2 >4mM final
+
Ej. EvaGreenTM Dye (concentración final 1X)
Proceder a trabajar en el área de purificación de ADN separada de otras fuentes de ADN.
Nunca introducir el ADN en la cabina de flujo laminar del área de preparación de
reactivos. Es conveniente que la amplificación comience en un plazo máximo de 10
minutos desde que se incorpora el ADN y los primers a la mezcla de amplificación.
Mantener los tubos de reacción refrigerados hasta su introducción en el
termociclador.
7. INFORMACIÓN PARA PEDIDOS
5.- Añadir el ADN molde a cada vial de reacción. Cerrar los viales y mezclar
cuidadosamente (no utilizar vortex).
DESCRIPCIÓN
Tamaño
6.- Centrifugar brevemente los viales de amplificación.
QUANTIHRM
1100 µl
2 x 1100 µl
5 x 1100 µl
50 mM MgCl 2 Solution
1.8 ml
1.8 ml
1.8 ml
Proceder al área de amplificación o PCR
7.- Colocar los tubos en el termociclador.
8.-Programar el termociclador con HRM siguiendo las recomendaciones del
fabricante (ver sugerencias en Tabla 2).
TABLA 2. Programa de PCR para QUANTIMIX EASY HRM Kit
Desnaturalización
inicial*
Ciclos de
amplificación
(40-50)
Pre-Melting***
ETAPA
Activación
enzimática
Desnaturalización
Anillamiento
#
Extensión**
Desnaturalización
Enfriamiento rápido
HRM Melting Curve
Temperatura
Tiempo
95-98ºC
5-8 min
95-98ºC
Tm de primers
(55-65ºC)
72°C
5-15 seg
5-30 seg
95-98ºC
50°C
Tm del amplicón ± 5°C
15-40 seg
30-45 seg
30 seg
(incrementos:
dependientes del ensayo)
* HotSplit DNA Polymerase se activa durante esta etapa
** Opcional: Se puede escoger un programa de 2-etapas, en cuyo caso la lectura de la
flurescencia se realiza durante la etapa de Anillamiento/Extensión
# Lectura de fluorescencia se realiza durante esta etapa en el canal apropiado
*** Opcional, aunque muy recomendable
www.biotools.eu
Referencia
10.641
10.642
10.643
10.641
10.642
10.643