Guion practica-EROD

Inducción enzimática (Nov-06)-1
INDUCCIÓN de una ACTIVIDAD ENZIMÁTICA tipo CITOCROMO P450
-ACTIVIDAD ENZIMÁTICA ERODENZIMAS BIO-MARCADORAS
Los sistemas enzimáticos tipo Cit P450 tienen actividad oxidasa de función mixta, capaz de oxidar a los XBs lipofílicos
absorbidos por los organismos. Estas enzimas, presentes fundamentalmente en el hígado, intentan transformar los XBs a
metabolitos mas polares para que puedan ser excretados fácilmente desde el organismo. El benzo-a-pireno es relativamente
inocuo en el organismo, pero cuando es metabolizado por la actividad Cit P450, se puede generar un metabolito reactivo que se
une al DNA, produciendo errores de transcripción y potencialmente cáncer. Una característica de estas enzimas Cit P450 es su
carácter inducible por compuestos que después pueden ser sus sustratos.
Ese carácter inducible permite que ciertas enzimas Cit P450 sean usadas como biomarcadores de la exposición de organismos
a contaminantes ambientales (ver tabla). Por ejemplo, la exposición a xenobióticos no-polares, como puedan ser: PCDD, PCBs
o PAHs, conduce a la inducción de enzimas, como la 7-etoxi-resorufina-O-desetilasa (EROD). La actividad EROD (Lepomis
auritas) se ha propuesto como un biomarcador de ambientes acuáticos contaminados, aunque tiene algunos inconvenientes
puesto que se conocen variaciones para su actividad en función de parámetros no controlables, como la temperatura del agua,
lo que conlleva una variación estacional de la actividad fisiológica de la EROD. Otro problema con la investigación de estas
actividades Cit P450 es la falta de información sobre la predicción en la relación dosis-respuesta, dato que se requiere para que
esta enzima sea usada como biomarcador para propósitos reguladores.
ICES 1997: revisión de técnicas relativas a efectos biológicos y su potencial aplicación a programas de monitoreo.
Técnicas recomendadas para programas de monitoreo biológico en niveles nacional e internacional.
METODO
Formación de
aductos DNA
voluminosos
Inhibición AChE
Inducción
metalotioneinas
Nº
ORGANIS ORGANISMO
Labor.
2
IOB
Peces y
moluscos bivalvos
*
2
IB
Peces,
crustáceos,moluscos
bivalvos
*
2 de IB
Peces
*
EROD o
inducción de
Cyt P450-1A
2
IOB
Peces
*
Inhibición
d-ALAD
E. antioxidantes
2
IOB
2
IB
Peces
*
Peces
*
OBJETIVOS
SIGNIFICADO BIOLOGICO
PAHs
genotoxicidad
Otros orgánicos sintéticos: nitro
organicos, plaguicidas amino triazinas
Organofosforados y
Medida de exposición
carbamatos o similares.
Posibles toxinas de algas.
Inducción de metalotioneinas Exposición
por
ciertos metales
Desequilibrios del
(Zn, Cu, Cd, Hg)
Metabolismo del Cu
Inducción enzimatica
Posible predicción de XBs
detoxifica contaminantes
a través de su inducción
organicos planares
enzimática.
(PAHs, PCBs, dioxinas)
Indicador sensible
Plomo
Indice de exposición
Responden a un amplio
Rango de contaminantes
Mide la presencia de
radicales
1.-INDUCCIÓN ENZIMÁTICA de Cit P450 EN CULTIVOS CELULARES
Una de las características mas importante del Cit P450 es que es inducible. La inducción es selectiva respecto a las isoenzimas
de P450, que juegan un papel importante en la determinación de los posibles efectos biológicos de los compuestos químicos.
La isoenzima CYP 2E1 esta comprometida en el metabolismo oxidativo de medicamentos, procarcinógenos, protoxinas.
FAMILIAS ISOENZIMÁTICAS DEL CIT P450
FAMILIA
Cit P450 1
Cit P450 2
SUBFAMILIA
Cyp 1A1
Cyp1A2
Cyp 2B1, 2, 4
Cyp 2E1
SUSTRATO
etoxiresorufina
metoxiresorufina
pentoxiresorufina
anilina
INDUCTORES
PAH, dioxinas
PAH, dioxinas
PCBs, barbitúricos
Etanol, imidazol
EJEMPLOS de inductores
B(a)P, βNF, TCDD
B(a)P, βNF, Met-colantreno
fenobarbital
Inducción enzimática (Nov-06)-2
La inducción de CYP 1A1 en peces expuestos a PAH o a β-naftoflavona es un hecho comprobado. Esta proteína no es
inducida en peces control, mantenidos en agua limpia. La etoxi-resorufina desetilasa (EROD) es una actividad enzimática
representativa de CYP 1A1 en células de hígado.
La fracción microsomal hepática de ratas no tratadas tiene bajos niveles de CYP 1A2 y niveles no detectables de CYP
1A1. Los PAH (metil-colantreno, benzo(a)pireno, B-naftofalvonas), los hidrocarburos aromáticos polihalogenados
(TCDD, PCBs) y ciertos aditivos alimentarios (fenotiazina,) son inductores de las isoenzimas CYP 1A. La inducción del
CYP 1A1 implica una activación transcripcional del gen CYP 1A1 que resulta en un incremento de los niveles del
mRNA y de la síntesis de las monooxigenasas Cit P450 correspondientes.
α-Naftoflavona
β-Naftoflavona
2.- DETERMINACIÓN DE la ACTIVIDAD ENZIMÁTICA EROD
EROD: 7-ETOXIRESORUFINA O-DEETILASA, ISOENZIMA CIT P450 1A1:
(Otra actividad similar puede ser ECOD: etoxi-cumarina-O-dealquilasa., P450 2B1)
El Centro de Toxicología Ambiental (CENTOX, 1999) fue iniciado en la Universidad de Lincoln y entre las pruebas de
evaluación de ecotoxicidad que ofrece se encuentra la determinación de la actividad enzimática EROD (CYP 1A1).
La determinación de la actividad EROD es una prueba usada para indicar la exposición de la vida silvestre a
contaminantes. Con células en cultivo se ha observado que la actividad de la enzima EROD, medida de la proteina CYT
P450 1A1, se incrementa dramáticamente en células RTL-W1 bajo su exposición a concentraciones crecientes de Bnafto-flavonas (BNF) o 2,3,7,8-tetracloro-dibenzo-p-dioxina (TCDD). Con estas propiedades, RTL-W1 pueden ser
usadas para estudios de expresión de las enzimas citocromo P450 y como una herramienta para la evaluación de la
potencia tóxica de contaminantes ambientales. En animales se ha estudiado el perfil de esta enzima a lo largo del
desarrollo (7, 14, 21, 50 y 100 días) en hígado y pulmón. Las actividades CYP 1A1 y CYP 2B1 en hígado de rata no
resultan alteradas por los componentes del humo ambiental de fumadores. Estos componentes si afectan,
incrementándolas, a estas enzimas de pulmón en las diferentes edades del desarrollo.
OBJETIVO:
Nosotros realizamos ensayos in vitro con hepatocitos (línea celular HepG2) en cultivo para observar la habilidad de
algunos XB (PCBs, Benzo (α) pireno y β-nafto-flavona) en la inducción de la isoforma de enzimas Cit P450, CYP 1A1.
Este ensayo puede ser usado para detectar y/o determinar la presencia de contaminantes ambientales (como PCBs,
PAHs y dioxinas) en ambientes acuáticos donde se desarrollen organismos .
2A.-EXPOSICIÓN DE LAS CELULAS A XENOBIÓTICOS (β
βNF, B(α
α)P, PCBs, etc.)
La exposición de las células (HEPG2, hepatoblastoma humano) a los tóxicos (β
βFN, PCBs, B-α
α-P) se realiza en
incubador y en placas de cultivo. Cada placa se siembra con 7 x 105 células en 5 ml de medio de crecimiento (DMEN
con 10% FBS). Cuando las placas son confluyentes, que suele ser a los 3 ó 5 días de crecimiento, el medio es
reemplazado y en él se añaden los XBs en concentraciones crecientes:
SUSTANCIA
PM
Sol. stock
[] sol. stock
[] en placa
AÑADIR
Aroclor-1254
328
50 mg / 1 ml
152.44 mM
100 uM
6.5 uL / 10 mL
400 uM
26 uL / 10 mL
100 uM
50 uL / 10 mL
400 uM
200 uL / 10 mL
100 uM
50 uL / 10 mL
400 uM
200 uL / 10 mL
Benzo(a)pireno
β-naftoflavona
252.3
273.3
5.046 mg / 1 mL
5.446 mg / 1 mL
20 mM
20 mM
Inducción enzimática (Nov-06)-3
Cada concentración se repite por triplicado para obtener muestra suficiente del extracto enzimático. Las soluciones
stock de XBs se preparan en DMSO, por lo que los cultivos control deben llevar 0.5 % de DMSO. El periodo de
exposición habitual es de 72 h, aunque a veces se ensaye con tiempos mas cortos ( 24 h).
2B.- OBTENCIÓN DEL EXTRACTO CELULAR (FRACCIÓN MICROSOMAL)
Después del periodo de incubación, las células se separan de la superficie de crecimiento mediante tratamiento con
tripsina y se centrifuga la suspensión durante 12 min a 2800 rpm; a continuación se lavan las células con PBS y el pellet
es resuspendido en 500 uL de TS buffer para romperlas por congelación. En cualquiera de las suspensiones celulares de
volumen controlado se efectuará un recuento celular. Los extractos celulares se sonican con 20 ciclos de intensidad 50%
Se usan alícuotas de 5 uL para determinar proteínas por Bradford y 150 uL para determinar la actividad EROD por el
siguiente método.
2C.-DETERMINACIÓN DE LA ACTIVIDAD EROD
Se ensaya por determinación fluorimétrica de la formación de resorufina desde el 7-etoxi-resorufina. La mezcla de
reacción completa contiene:
N
H3C
CH2
O
O
N
CYP 1A1
O
+ CH3-CH2OH
7-etoxi-resorufina
HO
O
etanol
+ resorufina
Volumen
1000 uL
10 uL
15 uL
20 uL
14 uL
150 uL
31 uL
1.24 mL
[ ] cubeta
0,1 M
1,75 mg/mL
5,3 mM
1,24 uM
0,27 mM
O
INCUBACIÓN ENZIMÁTICA:
HEPES
BSA
MgSO4
7-etoxi-resorufina
NADPH
Extracto celular
Agua
Vol. final
[ ] reactivo
124 mM, pH=7.8
217 mg/mL
0,438 M
76,88 uM
24 mM
..........
..........
La reacción transcurre a 25 ºC en tubos durante 10 min. La reacción es lineal con el tiempo al menos por 15 min y con
concentraciones de proteina por encima de 0.7 mg /ml.. La adición de 2.0 ml de metanol frio acaba con la reacción y
precipita las proteinaS, que se separan por centrifugación a temperatura ambiente durante 30 min a 2 800 rpm.
La resorufina es determinada fluorimetricamente en el sobrenadante con un espectrofluorimetro en una longitud de
excitación 550 nm con una abertura de 15 nm y una longitud de emisión de 585 nm con una abertura de 60 nm. La
actividad es expresada en picomoles de resorufina por mg de proteina por min (pmol/mgP/min), para lo que será
necesaria una curva patrón de la fluorescencia de la resorufina.
En algunos ensayos la α-naftoflavona en DMSO podría ser añadida a la mezcla de reacción al final, en
concentraciones de 1, 10, o 100 uM. En estos casos, la mezcla control recibe cantidades equivalentes de DMSO. La αnaftoflavona es un inhibidor de la actividad dependiente del Cit P450 en fracción microsomal hepática de trucha
arcoiris.
2D.- TRATAMIENTO DE LOS RESULTADOS
Se debe de contar con los datos de citotoxicidad de los XBs ensayados, en función del Nº de células en los cultivos o de
la cantidad de proteina en los extractos celulares.
Los datos de intensidad de fluorescencia son proporcionales a la actividad enzimática en las muestras (extractos
celulares) ensayadas en la incubación.
CONTESTAR:
2D.1:.Que tipo de actividad enzimática se determina
2D.2: Determinar mediante representación gráfica si la citotoxicidad de los xenobióticos ensayados es dosisdependiente
2D.3: Calcular la intensidad de la inducción enzimática en cada muestra y explicar los resultados.
Inducción enzimática (Nov-06)-4
REACTIVOS
HEPES
124 mM (Pm 238,3)
0,2383 g/ 8,064 mL
BSA
217 mg/mL
250 mg/ 1,152 mL
MgSO4
0,438 M (Pm 246,48)
123,24 mg/ 1,141 mL
7-etoxi-resorufina
76,88 uM (Pm 241,2)
1 mg/1mL DMSO (4,146 mM*) (momento)
20 uL * / 1,06 mL de HEPES (76,88 uM)
NADPH
24 mM (Pm 833,4)
25 mg/1,25 mL (preparar en el momento)