Exámen Microscópico

 Piensa Ud. en “Micosis” dentro
del diagnóstico diferencial ?
 Que se le puede pedir al
laboratorio de Micología ?
 Que se debe esperar del
laboratorio de Micología?
Diagnóstico Diferencial
Las manifestaciones clínicas muchas veces
son poco orientadoras y se confunden
fácilmente por otras enfermedades:
• distintas infecciones bacterianas
• procesos neoplásicos
• transplantes de órganos
• afecciones alérgicas
• psoriasis
• etc.
• Solicitud de pedido clara y completa
• Muestra representativa con transporte
y mantenimiento correcto
 Adecuado procesamiento
 Informe preliminar rápido
 Preparación de Medios de Cultivo y
reactivos
 Indicaciones claras para el paciente y el
médico
 Toma de muestra y transporte
 Exámen microscópico
 Cultivo
 Identificación
 Sensibilidad antifúngica
 Serología (Ag /Ac)
 Biología molecular
Espectrometría de masas
MANUALES DE GESTION DE CALIDAD DE CADA LABORATORIO
Medios de Cultivo para Microbiología
Control de Calidad
Para que los microorganismo
puedan crecer adecuadamente, los
Medios de Cultivo deben cumplir
con diversos “requisitos”.
Diagnóstico Micológico
Hongos patógenos y oportunistas mas frecuentes
M.CUTÁNEASSUBCUTÁNEAS
MICOSIS
ENDÉMICAS
M.HONGOS
OPORTUNISTAS
Dermatofitos
Histoplasma
capsulatum
Levaduras
Paracoccidioides
brasiliensis
Cryptococcus
neoformans
Hongos de
Micetomas
Coccidiodes
immitis/posadasii
Aspergillus spp
Sporotrix
shenckii
Blastomyces
dermatitidis
Zygomycetes
Penicillium marneffei
P. jirovecii
Otros
Candida spp
Trichosporon spp
1- Piel y Faneras
2- Secreciones mucosas (vaginal, bucofaríngeas) y
semimucosas (glande, vulva)
3- Punción de nódulos subcutáneos
4- Biopsias y piezas quirúrgicas
5- Escarificación cutánea
6- Hemocultivos - Médula ósea
7- Orina
8- Esputo y secreciones bronquiales
9- LCR y liq. punción
10- Suero
Htal Fernández
Sección Microbiología
2013

Examen directo y Cultivo
(tradicional)

Multiplex PCR
(Biol. Molecular)
J.Clin.Microbiol 2007, 45:1200-1204. (diagnóstico en 5 hs de T.rubrun
en uñas )
Htal Fernández
Sección Microbiología
2013

Suspender tratamiento antifúngico
 1 semana para tratamiento local o sistémico continuo
 3- 4 semanas para tratamiento por pulsos

No colocarse cremas, ni polvos

Uñas: realizar baños de agua y jabón blanco los 3 días
previos a la toma de muestra
Concurrir con zapatos cerrados y medias de algodón
No: cremas, polvos, esmaltes, ni cortarse las uñas
Htal Fernández
Sección Microbiología
2013
Diagnóstico Micológico
TOMA DE MUESTRA DE UÑAS
proximal subungueal
distal subungueal
Diagnóstico Micológico
TOMA DE MUESTRA
PIEL LAMPIÑA
tomar escamas de los bordes
Htal Fernández
Sección Microbiología
2013
Diagnóstico Micológico
TOMA DE MUESTRA
Pitiriasis versicolor
tomar escamas de
toda la lesión
Diagnóstico Micológico
TOMA DE MUESTRA
Cuero cabelludo
Desprender con pinza y
raspar la superficie del
cuero cabelludo.
Inflamatoria
 Hidróxido
de potasio de 10 a 40% c/tinta Parker
indeleble y glicerina 10% o Calcofluor
 Flamear a la llama hasta desprendimientos de
burbujas.
 Microscópio c/10 y 40 X de aumento
 Coloración de Azul de Metileno o Kinyoun
(Malassezia/Nocardia)
Htal Fernández
Sección Microbiología,
2013
OHK 40% c/tinta Parker
Examen directo
de uñas-piel
Filamentos hialinos, artrosporados, ramificados
Calcofluor
Htal Fernández
Sección Microbiología
2013
Examen directo
de cuero cabelludo
Pelo con OHK 40%
c/tinta Parker
Pelo microspórico (40x)
Examen directo
de cuero cabelludo
Pelo con OHK 40%
c/tinta Parker
Pelo tricofítico (40x)
Cultivo
1- PIEL Y FANERAS:- Medios de Cultivo
 Agar Sabouraud Miel
Agar Lactrimell de Borelli
Agar Banana/Avena/Leche
Agar DTM
Agar Sabouraud actidione
(inhibe hongos ambientales)
 Agar Dixon, etc.(Malassezia)
 Otros
Sembrar en 2 tubos, 28 ºC
Incubar por 3 semanas
PIEL Y FANERAS:- Medios de Cultivo
Lact
Sab/actid
Lact
Contaminantes
Contaminantes
dermatofitos
PIEL Y FANERAS:- Medios de Cultivo
Agar DTM
Dermatofitos
DTM
levaduras
Agar
Sabouraud
Examen con c/Azul de lactofenol (a 40x)
Trichophyton mentagrophytes
Macroconidias
Hifas espiraladas
Microconidias redondas
Htal Fernández
Microbiología -2013
Examen con c/Azul de lactofenol (a 40x)
Trichophyton tonsurans
Microconidias de
tamaño variado
Htal Fernández
Microbiologia-2013
Examen con c/Azul de lactofenol (a 40x)
Microsporum canis
Macroconidias
Htal Fernández
Microbiología -2013
Examen con c/Azul de lactofenol
Microsporum gypseum
(a 40X)
Macroconidias
Htal Fernández
Microbiología-2013
Examen con c/Azul de lactofenol
Del medio Sab/actidone (a 40X)
Hifas estériles de un dermatofito
(sin fructificación)
Htal Fernández
Microbiologia -2013
Examen con c/Azul de lactofenol
del medio Sabouraud con aceite de oliva:
Malassezia spp (40X)
Levaduras dentro
de las gotas de aceite
Htal Fernández
Microbiologia -2013
Examen con c/Azul de lactofenol
del medio Sabouraud con aceite de oliva:
Malassezia spp (100X)
Htal Fernández
Microbiologia -2013
Diagnóstico Microbiológico
Secreciones Mucosas
Muestras:
-Bucofarigea ó Vaginal: con hisopo en SF/Stuart
-Labio,vulva ó glande: hisopo o raspado en SF.
Exámen Microscópico:
-Fresco
-Coloración de Giemsa.
Cultivo e Identificación:
-Medios cromogénicos (Candida ID,Chromagar, Oxoid)
-2 tubos de Sabouraud a 35-37ºC, ~ 7 días.
Candida ID
C. albicans
C. krusei
C. glabrata
C. tropicalis
(seca)
Htal J.A.Fernández
Microbiología-2013
CRHOMagar
C. albicans
C. tropicalis
Otras
Htal J.A.Fernández
Microbiología-2013
Agar Cromogénico
Oxoid
C. dubliniensis
C. albicans
Agar Cromogénico
Oxoid
2 especies
C. krusei
C. parapsilosis
Aspecto y color de la colonia
• Aspecto microscópico (clamidosporos, tubo
•
germinativo, etc)
• Agar cromogénico
• Fermentación y asimilación de azúcares
• Pruebas bioquímicas (urea, agar opacidad, etc.)
Htal J.A.Fernandez
Microbiología-2013
Identificación de Levaduras
Candida albicans
Y C. dubliniensis
Tubo germinativo:
0.3ml suero, 2-3hs
Aspecto Microscópico
en Agar Harina de Maíz con
Tween 80 (40X)
Clamidosporos
Blastoconidias
Blastoconidias
C.albicans
Aspecto Microscópico
en Agar Harina de Maíz con
Tween 80 (40X)
Blastoconidias
Clamidosporos
pseudohifas
C.albicans
Aspecto Microscópico
en Agar Harina de Maíz con
Tween 80 (40X)
Blastoconidias
C.glabrata
SIN pseudohifas
Candida parapsilosis
Blastoconidias
Aspecto Microscópico
en Agar Harina de Maíz con
Tween 80 (40X)
pseudohifas
 TOMA DE MUESTRA
Asepsia- Descostrar-Bisturí- Raspar fondo
2 portaojetos y material en SF estéril (1 ml)
 EX. MICROSCÓPICO
Fresco o Tinta china.
Giemsa (hongos y citológico:Herpes - Mollusco)
Ziehl Neelsen o Kinyoun (BAAR, Nocardia)
 CULTIVO e IDENTIFICACION
2 SAB y 2 BHI- (28 y 35ºC)
1 L.Jensen (30ºC Micobacterium marinum)
Htal J.A.Fernandez
Microbiología-2013
Escarificación Cutánea
Microscopia: por coloración de Giemsa (100X)
Histoplasma capsulatum
levaduras intramacrófagos,
teñidas en casquete
Escarificación cutánea
Histoplasma capsulatum
levaduras intramacrofagos,
teñidas en casquete (100x)
Escarificación cutánea
celulas hiperpigmentadas
halo claro
Mollusco contagiosum
Escarificación cutánea
Herpes spp
(100x):
células gigantes multinucleadas,
compatibles con proceso viral
 MUESTRAS:
Sacar en SF (Micología) y en formol 10%(A.Patológ)
- B.micetomas: “granos”
- B.nódulos (feohifomicosis y cromomicosis)
- Biopsias de posibles Zigomicetes
 EX.MICROSCÓPICO:
Si se piensa en Zigomicetes, NO MACERAR
preparar improntas para:
Fresco- Giemsa - ZN - Gram- KY.
 CULTIVO:
Si se vieron en el directo:
- Hifas ramificadas, gruesas y no tabicadas.
NO MACERAR. Sembrar 2 BHI y 2 SAB (28 y 35ºC).
- Bacilos ácido alcohol resistente, ramificados o no:
T. Martin, SAB sin ATB, Agar sangre.
- Actinomices: BHI en anaerobiosis (35ºC)
Agar blando glucosado(35ºC)
Htal Fernández
Microbiología, 2013
Mucormicosis
Paciente pediátrico
transplantado
Médula Osea
Rhizomucor spp
Filamento grueso
sin tabiques
(Gram-Neisser- 40X)
Hospital Fernandez
2013
Rhizomucor spp
 TOMA DE MUESTRA:
-Métodos automatizados, bifásicos o clásico
(< tiempo, > sensibilidad con frascos específicos
para algunas levaduras)
-Lisis centrifugación c/saponina 5%(cc.final
0.5%)/Isolator
Htal FernandezMicrobiologia 2013
En tubo estéril:
 Saponina 5% (concentración final 0.5%) +
 Polianetol sulfonato de sodio al 0.4 % ó EDTA.


Adulto: 9 ml de sangre
Pediátrico: 1,5-3 ml de sangre

Los tubos de LC se centrifugan a 3000 r.p.m. durante
30 minutos, se descarta el sobrenadante

Sembrar el sedimento: en 2 Sabouraud miel c/ATB y
2 agar BHI
Incubar a 28 y 35 °C por 3 semanas.

S
Centrifugar
30 minutos
Saponina
+ sangre
B
+
S
B
sembrar
sedimento
28°C
37°C
S: Sabouraud miel c/antibioticos
B: BHI agar c/ antiboticos
Htal Fernández
Microbiología -2013
HEMOCULTIVOS- MEDULA OSEA
Técnica de elección:
“Lisis Centrifugación”
Es la técnica de elección para
Hemocultivo cuando se sospecha
hongos filamentosos
(H.capsulatum, Fusarium spp)
pues  significativamente la
recuperación y  el tiempo de
aislamiento (de 3 semanas a 1-2
semanas).
- Wilson,J.Clin.Microbiol.
31:865/71, 1993.
- Bianchi. Medical Mycology,
38: 77, 2000)
- Cumitech 1C Blood Cultures IV
ASM Press, 2005.
(N ◦ 683)
Nª aislamientos
Tiempo de deteccion de Histoplasmosis por lisis
centrifugacion
18
16
14
12
10
8
6
4
2
0
Histoplamosis
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25
Tiempo de deteccion en dias
Tiempo de detección de Criptococos según técnica
de hemocultivo (n=209)
30
25
20
15
10
5
Nº de0
episodios 1
Au
LC
2
3
4
5
6
7
8
9
Tiempo de detección en días
 EXAMEN MICROSCOPICO:
Sólo en Medula ósea,del sedimento de L-centrifugación
 CULTIVO:
LC: Sembrar el sedimento en 4-6 tubos en SAB y BHI.
Incubar a 28 y 35ºC por 3-4 semanas.
En pacientes con “Alimentación parenteral lipídica” agregar
medios especiales para fungemias por Malassezia sp
Htal FernandezMicrobiologia 2013

Toma de muestra:
Igual Urocultivo
Para C.neof. y P.brasil.: en hombre post-masaje prostático

Examen microscópico:
Fresco (Tinta china)


Del Sobrenadante:
- Látex para C.neoformans
Cultivo e Identificación:
SAB (en placa) y/o Agar Cromogénico.
Recuento de colonias: ????
Diagnóstico Micológico
ORINA
Candiduria significativa :
-
En pacientes sondados, con recuento de colonias
≥ 102 ufc/ml de un patógeno predominante
- Síntomas clínicos
- Sedimento urinario: no siempre presenta leucocituria
- Realizar el cultivo con recambio de sonda
(30 % mejora)
Consenso Intersociedades
Manejo Inf. Tracto Urinario
Septiembre 2006
Diagnóstico Micológico
ORINA

En pacientes sondado de UTI o UTIN:
se solicita una 2da muestra con recambio de
sonda, el mismo día.

En pacientes de Neonatologia:
se trabaja e informa la 1er muestra

Punción suprapubica:
se trabaja la muestra

En pacientes sondados se siembra 10 y 100ul
Htal J.A.Fernández
Microbiología-2013
 MUESTRA:
Esputo seriado (3 muestras)
Secreciones broqueales, LB, miniBAL,BAL
 EXAMEN MICROSCOPICO:
Importante porque define si la muestra es
representativa. Fresco y coloraciones.
 CULTIVOS:
2-3 tubos SAB c/ATB pero SIN actidione, 2-3 BHI,
Agar Sangre y Tayer Martin
 INTERPRETACION e IDENTIFICACION
Htal Fernández-Microbiología 2013
EXAMEN MICROSCOPICO:
Fresco (40x)
Filamento hialino, ramificado, dicotómico
COLORACIONES:

Gram-Neisser, 40x

Calcofluor white

Giemsa (H.capsulatum, P.marnefei, Pcp,)

Kinyoun (Nocardia).

Gram Wiegert, Azul Toluidina O, IFI (Pcp), Grocott
Examen en fresco
de biopsia pulmón
con Gram- Neisser
Examen en fresco (10x) de un BAL
Acúmulos de P.jiroveci
Examen en fresco (40x) de un BAL
Acúmulos de P.jiroveci
Coloración de Gram -Weigert
Acúmulos de P.jiroveci
Coloración de metenamina plata
C.neoformans
Examen en fresco con Gram - Neisser (40x) de
un BAL
Cryptococcus neoformans
Examen en fresco
Coloración de Giemsa (100X)- BAL
Histoplama capsulatum
Acúmulos de P.jiroveci
Examen en fresco
Levaduras catenuladas (40x)
Levaduras en rueda de timon
Aumento (40x)
CULTIVO E IDENTIFICACION
Aspergillus fumigatus
Anverso
Reverso
Aspecto macroscópico de la colonia
IDENTIFICACION
Conidioforo: corto, pared lisa
Vesicula: subglobulosa, en forma de cúpula
Fialides : uniceriadas, 2/3 superior
Aspergillus fumigatus
 MUESTRA: LCR >3ml. Centrifugar
 EX.MICROSCÓPICO: Tinta China del Sedimento
 CULTIVO: SAB-BHI a 28 y 37 ºC del Sedimento
 SEROLOGIA: del Sobrenadante
- Latex, Elisa para C.neoformans (Ag)
- Elisa y radioinmunoensayo para H.capsulatum (Ag)
- CIE y Fijación de Complemento (Ac) para
H.capsulatum, P.brasiliensis y C.posadasii
Htal Fernandez-Microbiologia 2013
Tinta China
Cryptococcus neoforman
MUESTRA: Suero (LCR, orina)
 ANTÍGENO:
- Látex, Elisa para C.neoformans,
- Elisa (Galactomananos) y/o Colorimétrico
(13)-- D-glucanos para Aspergillus spp
- Elisa y radioinmunoensayo para H.capsulatum
Anticuerpo:
Inmunodifusión, CIE y Fijación de Complemento
(H.capsulatum, P.brasiliensis, C.immitis/posadasii,
Aspergillus fumigatus, A.niger, A.flavus)
 DETECCIÓN DE METABOLITOS: Mananos y Enolasa
 TÉCNICAS MOLECULARES: PCR, PCR Real-Time, etc.
 Espectrometría de masa (Malditof)