Cromatografía líquida - Sistema educativo virtual UNLP

Química Analítica III
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
FUNDAMENTOS
Las muestra se
disuelven en una
fase móvil (FM)
líquida que se hace
pasar a través de
una fase
estacionaria (FE)
inmiscible, la cual se
mantiene fija en una
columna o lecho
cromatográfico
Los componentes de
la muestra se
distribuyen de modo
distinto entre la FM
y FE dependiendo
de la afinidad por
ambas fases,
desplazándose a
velocidad distinta
Debido a la distinta
movilidad, los
componentes se
separan en bandas
discriminadas que
pueden analizarse
cualitativamente y/o
cuantitativamente
Eluyente: lo que entra
en la columna
Eluato: lo que sale de
la columna
Elución: proceso de
paso de la FM a
través de la columna
FUNDAMENTOS
CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS
TIPO
FASE ESTACIONARIA
INTERACCIÓN
Adsorción
Sólido
Fuerzas de van der
Waals
Intercambio iónico
Resina
Electrostáticas
Exclusión
Gel
Tamaño de
partículas
Partición
Líquido
Solubilidad
Afinidad
Sólido
Retenciones
bioespecíficas
CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS
Según el mecanismo de separación
CLASIFICACIÓN DE LOS MÉTODOS
CROMATOGRÁFICOS
CROMATOGRAFÍA DE PARTICIÓN
La FE líquida está retenida por
un soporte sólido.
Los soportes sólidos más
utilizados en CLL son: gel de
sílice, tierra de diatomeas
(Kieselguhr, Celita, etc.) y
celulosa.
Dificultad en relación con el
soporte sólido: presencia de
fenómenos de
adsorción(siempre muestra algo
de actividad superficial).
CROMATOGRAFÍA DE ADSORCIÓN
La FE es un sólido adsorbente de
gran área superficial.
Los centros activos situados sobre la
superficie del sólido interaccionan
con los grupos funcionales polares de
los compuestos a separar.
La separación se produce como
consecuencia de la distinta
intensidad de esas interacciones
para los diferentes compuestos.
CROMATOGRAFÍA DE INTERCAMBIO IÓNICO (CII)
Se basa en el equilibrio de los
iones de soluto entre el solvente
y los sitios cargados en la FE.
La FE consta de una matriz (R)
con grupos funcionales
cargados (A) y contraiones de
carga opuesta (M), susceptibles
de intercambiarse con especies
de la misma carga contenidas
en la FM (X)
R–A– M+ + X+ ↔ R–A–X+ + M+
(intercambio catiónico)
R–A+M– + Y– ↔ R–A+Y– + M–
(intercambio aniónico)
CROMATOGRAFIA DE EXCLUSION MOLECULAR
(CPG)
Se aplica fundamentalmente para
la separación y caracterización de
sustancias de peso molecular
elevado.
Se utiliza extensamente en
Bioquímica para separar moléculas
grandes como proteínas e hidratos
de carbono, si bien, también
encuentra aplicaciones en la
química de los polímeros.
CROMAROGRAFÍA LÍQUIDA
Por qué se produce la distribución del soluto entre las
dos fases?
Debido a la interacción, en diferente proporción, de las
moléculas de soluto con las moléculas de cada fase
Fuerzas intermoleculares:
iónicas
polares
INTENSIDAD DECRECIENTE
dispersivas
FUERZAS INTERMOLECULARES
Fuerzas
iónicas:
• atracción electrostática de iones con carga opuesta
para separar aniones se requiere una FE catiónica y
viceversa
Atracciones
polares:
• puede tratarse de interacciones de moléculas polares
(alcoholes, cetonas, aldehídos) o polarizables (benceno,
tolueno, naftaleno)
• Para su separación se requerirá que la FM sea no polar o
poco polar y la FE sea polar
Interacciones
dispersivas:
• se originan entre cadenas hidrocarbonadas y sustancias
polares como consecuencia de asimetrías electrónicas
instantáneas
PRINCIPIOS BÁSICOS
CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA DE ALTA
RESOLUCIÓN
(CLAR O HPLC)
EVOLUCIÓN DE LA CL
a) CL convencional. b) HPLC con partículas peliculares. c) HPLC con partículas
microporosas.
OPTIMIZAR LA CL
El primer aspecto considerado fue incrementar la velocidad
de la fase móvil
Utilización de bombas adecuadas y conexiones de tubos
que impidan fugas, al estar sometido el líquido a
presiones elevadas.
Con fases estacionarias convencionales, el empleo de
altas velocidades de fase móvil implica una pérdida de
resolución.
Para mejorar ésta, se hace necesario modificar el
empaquetamiento (conexión con la ecuación de van
Deemter)
B
H = A + + Cu
u
OPTIMIZAR LA CL
La resolución en CL
se mejora al
disminuir el tamaño
de las partículas de
FE
Se reduce A ya que
las trayectorias
seguidas por la FM
son más uniformes
B/u sólo es
significativa cuando
la velocidad de flujo
es excesivamente
lenta.
La resistencia a la
transferencia de
masa, Cu, es
fundamental
A altos valores de u,
sólo si la
transferencia de
solutos entre FM y
FE es rápida la Rs
será alta.
Decisiva la
reducción del
tamaño de las
partículas de la
relleno
Los materiales que
se usan en CL
convencional tienen
partículas de 150
μm ó más y poros
profundos.
FM estanca, lenta
transferencia de
masa entre fases.
Se origina un
ensanchamiento de
bandas
excesivamente
grande.
PROPIEDADES DE LOS SOLVENTES EMPLEADOS
EN HPLC
La caída de presión a lo
largo de una columna
se puede calcular como:
ΔP =






250 LFη
d 2p d c2
ΔP = caída de presión (psi)
L= longitud de columna (cm)
η= viscosidad (cP)
F = caudal (mL/min)
dp = diámetro de partícula (μm)
dc = diámetro de columna (cm)
η (cP)

Viscosidad de mezclas acuosas
empleadas como FM en RPLC
%v/v de agua
Al usar una mezcla de 50% de MeOH en agua, se
obtiene un ΔP que es el doble del que se obtendría
para la misma columna con una mezcla
MeCN/agua.
PROPIEDADES DE LOS SOLVENTES EMPLEADOS
EN HPLC
Alto poder solubilizante para no precipitar el analito en la columna
Baja reactividad
Alto grado de pureza
Compatibilidad con el detector (en el caso del detector UV, punto de
corte adecuado)
Baja viscosidad (evitar caídas de presión elevadas y mejorar la
transferencia de materia entre fases)
La fase
estacionaria se
une químicamente
a la superficie del
soporte sólido.
Cromatografía de
fase enlazada (CFE
o BPC)
Los grupos –OH
pueden ser
silanizados por
reacción con
organocloro u
organoalcoxisilanos para formar
enlaces siloxano
estables
Constituido por
micropartículas de
gel de sílice
(diámetros entre 3
y 10 μm).
SOPORTE SÓLIDO
El soporte más común en
HPLC son las partículas
microporosas de sílice.
Pueden tener un área
superficial de hasta 300
m2/g.
Su superficie contiene
unos 8 μmol/m2 de grupos
SILANOL (Si-OH).
PARTÍCULAS DE SÍLICE (TAMAÑO DE PORO, 10 nm)
a)Agregado de partículas esféricas, área
superficial 150 m2/g
b)Estructura esponjada, área superficial 300m2/g.
PARTÍCULAS DE SÍLICE
Partículas
irregulares o
esféricas
LC 40-200μ
Tamaño :
HPLC 3 -10 μ
CROMATOGRAFÍA DE FASE ENLAZADA (BPC)
con octadecilclorosilano, el proceso es,
Los grupos silanol residuales que no hayan
reaccionado es necesario desactivarlos, lo
cual suele hacerse con clorotrimetilsilano.
EMPAQUES DE SILOXANOS
Las fases ligadas más frecuentes (cepillo, oligomérica y voluminosa) son
producidas por monocloro, dicloro y triclorosilanos, respectivamente.
unión siloxano
grupo silanol reactivo
Si OH
O
+
Si OH
unión
siloxano
CH3
ClSi R
CH3
Si
- HCl
O
O
CH3
Si R
CH3
Si OH
alquil clorosilano
R = C6H13; C8H17; C18H37;
C4H6N;C8H9SO3; etc
FASE UNIDA TIPO “CEPILLO” (BRUSH)
Los grupos están en posición perpendicular a la superficie generando una estructura
de cepillo o brocha
Estructura A
impedimento estérico (grupos
metilo unidos al silicio)
Estructura B
más aceptada
FASE UNIDA TIPO “OLIGOMÉRICA”
Etapa 1
Alquil diclorosilano
FASE UNIDA TIPO “OLIGOMÉRICA”
Etapa 2
Etapa 3
Se trata la
silica en
forma
alternada
con agua y
diclorosilano.
Se va
formando el
oligómero
que
constituye la
FE
FASE UNIDA TIPO “OLIGOMÉRICA”
Etapa final
Cuando se une la
última cadena, se hace
reaccionar al grupo
silanol remanente con
trimetil clorosilano.
Es la fase ligada más
difícil de obtener
Etapa 1
Alquil triclorosilano
FASE UNIDA TIPO “VOLUMINOSA” (BULK)
Consiste en una película polimérica algo abierta de FE
cubriendo la superficie de la sílica
Etapa 2
La cadena
“octildicloro”
reacciona con
agua para dar
una cadena
“octildihidroxo”
FASE UNIDA TIPO “VOLUMINOSA”
Etapa 3
La cadena
“octildihidroxo” reacciona
con moléculas de
triclosilanos y forma la
superficie polimérica.
Los grupos clorosilanos
tienen libertad de
movimiento para
reaccionar con silanoles
de la superficie (capa de
polímero entrecruzado)
FASE UNIDA TIPO “VOLUMINOSA”
FASES LIGADAS
Fases tipo
“cepillo”
(brush)
Se sintetizan de una
manera reproducible, y por
lo tanto son generalmente
recomendadas para la
mayoría de las
aplicaciones.
Fases
voluminosas
(bulk)
Tienen alta capacidad
retentiva y son adecuadas
para sistemas que
operarán con mezclas de
solventes acuosos con
altos contenidos de agua.
CROMAROGRAFÍA DE PARTICIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO
Teoría de equilibrio
El potencial químico del soluto en fase estacionaria (ms) y en fase móvil (mM) se pueden
expresar:
μ = μo + RTlna
S S
S
μ = μo + RTlna
M M
M
Al alcanzar equilibrio:
μ =μ
M
S
a
RTln
S = μo - μo = RTlnK o
M
S
a
M
Donde Ko es la constante termodinámica de distribución o partición
CROMAROGRAFÍA DE PARTICIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO
Teoría de equilibrio
a
x γ
γ
Ko= S = S S = Kx S
a
x γ
γ
M
M M
M
x representan fracciones molares
Kx = xS/xM es la constante de distribución expresada en fracciones molares
Tomando como estado normal del soluto al soluto puro (a=1 para x=1) en ambas fases:
μo = μo
M
S
Por lo tanto:
K° = 1
y
γ
Kx = M
γ
S
CROMAROGRAFÍA DE PARTICIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO
Teoría de equilibrio
Para las soluciones diluídas con las se trabaja en cromatografía se puede
escribir:
x
Kx =
x
S
M
o
o
v
C
n
v
V
N
S
M = S S
M = S S
o
o
v
n v
C
V
N n
M M
M M
S
S M
n
nS y nM: número de moles en fase estacionaria (S) y móvil (M)
NS y NM número de moles de S y M
v°S y v°M volúmenes molares de S y M
VS y VM volúmenes de fase estacionaria y móvil
CS y CM concentración molar del soluto en fase estacionaria y móvil
CROMAROGRAFÍA DE PARTICIÓN LÍQUIDO-LÍQUIDO
Teoría de equilibrio
o
C
v
Reordenando la ecuación anterior:
K = S =Kx M
o
D
C
v
M
S
Combinando con la expresión de Kx encontrada:
o
v
γ
K = M M
o
D
γ
v
S S
KD y VR están, como siempre, relacionados por la ecuación fundamental de la
cromatografía
V
R
=V
+K V
M
D S
Cómo calcular los coeficientes de actividad?
Teoría de las soluciones regulares de Hildebrand
 Para una “solución regular”, el coeficiente de actividad a
dilución infinita de un soluto 1 en un solvente 2 viene dado por:
δ
o
v
ln γ ∞= 1 (δ - δ )2
1 2
1
RT
es el “parámetro de solubilidad”, que es una medida de lo que
comúnmente se denomina polaridad.
 cuanto más polar es una sustancia, mayor es su parámetro de
solubilidad.
 la expresión para el coeficiente de actividad de un soluto i en fase
móvil y en fase estacionaria será:
o
v
ln γ ∞ = i (δ - δ )2
i M
i, M
RT
o
v
ln γ ∞ = i (δ - δ )2
i S
i, S
RT
Coeficientes de distribución en cromatografía líquida
 Introducimos las expresiones anteriores la de KD
o
o
v
v
2
2
ln K = i [ (δ - δ ) - (δ - δ ) ] + ln M
o
D
M
M
i
i
RT
v
S
 Si los volúmenes molares de los líquidos usados como fases móvil y
estacionaria no son muy diferentes v°M ≅ v°S
o
2
2
ln K = i [(δ - δ ) - (δ - δ ) ]
D
i M
i M
RT
v
MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
Si vamos a separar
analitos polares
(δi grande)
• δs deberá ser de similar magnitud para
minimizar (δi – δs)
• δm deberá ser pequeño para maximizar
(δi – δm) y lograr tener retención
La fase estacionaria
deberá ser polar y la • Estamos en presencia de partición en
FASE NORMAL (NPLC)
fase móvil poco
polar
δ >δ >δ
M
S
i
MODALIDADES DE CROMATOGRAFÍA LÍQUIDA
Si vamos a separar
analitos no polares
(δi chico)
• δs deberá ser de similar magnitud (chico) para
minimizar (δi – δs) y lograr tener retención
• δm deberá ser grande para maximizar (δi – δm)
La fase estacionaria
en presencia de partición en FASE
deberá ser no polar • Estamos
REVERSA (RPLC)
y la fase móvil polar
δ <δ <δ
M
S
i