portadores de oxigeno artificiales de hemoglobina humana o

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OFICINA ESPAÑOLA DE
PATENTES Y MARCAS
A61K 35/14 (2006.01)
C07K 14/805 (2006.01)
C08G 65/32 (2006.01)
ESPAÑA
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11 Número de publicación: 2 275 712
51 Int. Cl.:
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA
T3
86 Número de solicitud europea: 01962733 .0
86 Fecha de presentación : 12.06.2001
87 Número de publicación de la solicitud: 1294386
87 Fecha de publicación de la solicitud: 26.03.2003
54 Título: Portadores de oxígeno artificiales de hemoglobina humana o porcina reticulada modificada, procedi
mientos para su preparación a partir de material modificado y su uso.
30 Prioridad: 29.06.2000 DE 100 31 740
73 Titular/es: SanguiBioTech GmbH
Alfred-Herrhausen-Strasse 44
58455 Witten an der Ruhr, DE
45 Fecha de publicación de la mención BOPI:
16.06.2007
72 Inventor/es: Barnikol, Wolfgang;
Burkhard, Oswald;
Pötzschke, Harald;
Domack, Ulrike;
Dinkelmann, Stephanie;
Fiedler, Bernd y
Manz, Birgit
45 Fecha de la publicación del folleto de la patente:
74 Agente: Carpintero López, Francisco
ES 2 275 712 T3
16.06.2007
Aviso: En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín europeo de patentes, de
la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea
de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se
considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del
Convenio sobre concesión de Patentes Europeas).
Venta de fascículos: Oficina Española de Patentes y Marcas. Pº de la Castellana, 75 – 28071 Madrid
ES 2 275 712 T3
DESCRIPCIÓN
Portadores de oxígeno artificiales de hemoglobina humana o porcina reticulada modificada, procedimientos para
su preparación a partir de material modificado y su uso.
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La presente invención comprende según las reivindicaciones la preparación de hemoglobinas químicamente modificadas reticuladas con propiedades funcionales mejoradas, las hemoglobinas reticuladas preparadas según este procedimiento así como su uso como portadores de oxígeno artificiales. El procedimiento de preparación se caracteriza
tanto por simplicidad técnica como también por altos rendimientos.
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Se conjuga hemoglobina altamente pura desoxigenada bajo la protección de un agente antioxidante con un efector
de la unión de oxígeno, en especial pirixodal-5-fosfato, después se lleva a cabo la polimerización de la hemoglobina
con glutardialdehído con un gran aumento del volumen de la mezcla de reacción y con ello una gran dilución de los
reactantes durante la adición del reticulante. A continuación, tras la dilución con agua, se acopla químicamente un derivado de poli(óxido de etileno) a la hemoglobina reticulada. Se obtienen polímeros compatibles con plasma sanguíneo
con características de unión a oxígeno optimizadas, que se pueden usar como portadores de oxígeno artificiales, en
especial divididos en una proporción de bajo peso molecular y una de alto peso molecular como sustitutos sanguíneos
o como aditivos sanguíneos, por ejemplo en el tratamiento de estados de falta de oxígeno.
En la medicina resulta deseable por diferentes indicaciones médicas disponer de un sistema artificial de apoyo para
el transporte de oxígeno. En caso de una grave pérdida de sangre parece no sólo razonable sustituir el volumen de forma isotónica e isooncótica, sino también restituir una función adicional de la sangre, concretamente, el transporte de
oxígeno. Con la cada vez menor disposición a la donación de sangre, en casos catastróficos graves (entre otros en caso
de guerra) hay cada vez menos sangre conservada adecuada disponible, en especial para poder cubrir una necesidad
imprevisible. La disponibilidad momentánea de sangre conservada apropiada conlleva además considerables problemas logísticos. Además, la sangre conservada sólo se puede almacenar normalmente aproximadamente 35 días y por
ello tiene que renovarse continuamente - lo que ocasiona costes considerables - mientras que soluciones artificiales
se pueden conservar durante un tiempo esencialmente más prolongado, ya que dado el caso se pueden congelar. En
función del tiempo de almacenamiento, la sangre conservada se adicifica intracelularmente, y por ello sus características de unión a oxígeno no son de ninguna manera óptimas, sino que más bien se deben regenerar en primer lugar en
el organismo. Por el contrario, un portador de oxígeno artificial funciona de forma óptima desde el primer momento.
La cada vez menor disposición a la donación de sangre se enfrenta por otro lado al creciente envejecimiento de la
población que aumenta la demanda. De forma simultánea, a causa del envejecimiento también se reduce el número de
los donantes de sangre potenciales. De la misma forma, a causa de los riesgos de infección ineludibles (debilidades
inmunes, hepatitis), la población de los suburbios (“slums”) queda excluida como donante de sangre. Un sustituto
sanguíneo artificial transportador de oxígeno también sería universal, independientemente del grupo sanguíneo. Es
posible además que con un sustituto sanguíneo de este tipo se pueda atravesar un choque por hipovolemia antes que
con una sangre conservada, ya que los eritrocitos de la conserva están rígidos y por ello presentan una transitabilidad
capilar reducida. En cualquier caso, los experimentos con animales han demostrado que se puede combatir el choque
por hipovolemia con un sustituto sanguíneo transportador de oxígeno de forma más eficaz que con expansores plasmáticos simples (Pabst, R. (1977): “Sauerstofftransport mit stromafreien Hämoglobinlösungen und Fluorocarbonen”,
Med. Klin. 72: 1555-1562, Keipert P.E., Chang T. M.S. (1985) “Pyridoxylated Polyhemoglobin as a Red Cell Substitute for Resucitation of Letal Hemorrhagic Shock in Conscious Rats2”, Biomater., Med. Dev. Artif. Organs 13: 1-15). A
esto se añaden otras aplicaciones de un portador de oxígeno artificial: cada vez se pueden realizar menos intervenciones quirúrgicas complicadas que cursan obligatoriamente con graves pérdidas de sangre porque faltan las reservas de
sangre necesarias. En cambio se desarrollan intervenciones quirúrgicas cada vez mayores y más invasivas - entre las
que se cuentan especialmente también transplantes - cuya realización en cada caso concreto depende decisivamente
de la disponibilidad de muchas reservas de sangre apropiadas. Adicionalmente, se pueden conservar mucho mejor
órganos previstos para un transplante si se prefunden con portadores de oxígeno (artificiales). Sólo un transplante de
hígado requiere hasta 100 unidades de transfusión de 450 ml cada una. En casos de daños por politraumatismo (por
ejemplo a causa de un accidente de automóvil) se requieren grandes cantidades similares.
Pero no sólo en caso de una grave pérdida de sangre, sino también en caso de trastornos circulatorios crónicos (en
especial cerebrales, coronarios, renales y periféricos - por ejemplo en caso de sordera sensitiva súbita - o de una crisis
anémica por ejemplo en caso de osteomielitis crónica o después de quimioterapia tumoral) existe una necesidad de
una sustancia sanguínea transportadora de oxígeno artificial. También en caso de una falta de oxígeno fetal a causa
de una insuficiencia placentaria para evitar una amenaza de aborto o para evitar los daños por la falta de oxígeno
en el parto se ofrece la aplicación del aditivo o para la deshabituación de la respiración asistida. Una necesidad de
este tipo es incluso considerablemente superior a la del caso mencionado anteriormente de una grave pérdida de
sangre: tales trastornos circulatorios crónicos son la causa de la muerte de aproximadamente 750.000 personas al
año en Alemania. A esto se añaden los casos de enfermedad por esta causa. Sólo aproximadamente la mitad de
personas mueren de cáncer anualmente. La falta crónica de oxígeno en los tejidos se intenta tratar de forma conocida
mediante suministro de oxígeno hiperbárico. Independientemente de que esta terapia sólo surte efecto mientras impera
la sobrepresión de oxígeno e independientemente de que el procedimiento no está exento de peligro, A este respecto
existe el peligro de daños tisulares oxidativos por reacciones radicálicas de oxígeno que se pueden comprobar mediante
los correspondientes productos de reacción. Un portador de oxígeno artificial actúa mientras está presente y ofrece a
los tejidos el llamado oxígeno de baja presión, de forma que no aparecen los daños mencionados. La aplicación de un
aditivo sanguíneo transportador de oxígeno como apoyo provisional del sistema de transporte de oxígeno endógeno
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representa otra posibilidad y alternativa para la lucha contra la falta de oxígeno tisular crónica que hasta ahora se ha
intentado tratar con agentes potenciadores de la circulación (por ejemplo, vasodilatadores).
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Para el tipo de aplicación, resulta muy adecuado el concepto de que se trate de una terapia de oxígeno funcional:
no se aplica el sustrato (el oxígeno), sino que se mejora la función del sistema portador que lleva el oxígeno a los
tejidos. Esto hace multiplicativo el efecto de la terapia, así como muy efectivo, y le proporciona simultáneamente
un carácter catalítico. A esto se añaden también indicios claros de que un portador de oxígeno disuelto en plasma
es mucho más eficaz que uno “empaquetado” en eritrocitos. Adicionalmente, un sustituto sanguíneo artificial de este
tipo puede prepararse exento de los patógenos conocidos; de esta forma se pueden evitar problemas infecciosos como
hepatitis y el síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA).
Un grupo receptor potencial adicional para soluciones transportadoras de oxígeno artificiales son pacientes para los
que se prevé una reacción alérgica por ejemplo frente a los antígenos HLA. Hasta ahora se ha intentado eliminar los
leucocitos de la sangre conservada mediante una filtración sobre algodón. Las soluciones de sustitutos sanguíneos artificiales estarían por el contrario completamente exentas de leucocitos. Muy recientemente se ha observado en cerdos
que tras la mejora del suministro de oxígeno (disminución de la afinidad de la hemoglobina por el oxígeno), se reduce
el volumen de latido del corazón y la frecuencia cardiaca permanece inalterada (Villereal M.C. y col. (1987): “Engineered Red Blood Cells with Modified Oxygen Transport Properties: A New Oxygen Carrier”, Biomater., Med. Dev.,
Artif. Organs 15: 397). En otro trabajo (Bosman R.J. y col., (1992): “Free Polymerized Hemoglobin Versus Hydroxyetyl Starch in Resucitation of hypopovolemic dogs”, Anesth. Analg. 75: 811-817) se mostró que la administración
de soluciones transportadoras de oxígeno tras un choque de hipovolemia en perros evita el aumento de volumen del
corazón y por lo tanto protege al corazón. Aquí se abre la posibilidad de alcanzar una protección miocárdica funcional
mediante la mejora del suministro de oxígeno, lo que resulta de ayuda por ejemplo en el caso de un infarto. Esto sería
un aspecto completamente nuevo para aplicación de soluciones transportadoras de oxígeno.
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Otra aplicación de tales portadores de oxígeno artificiales sería el aumento de la sensibilidad a la irradiación de
tumores, ya que cada vez se insinúa más que portadores de oxígeno moleculares disueltos en el plasma ceden oxígeno
a los tejidos de forma mucho más efectiva que sangre completa: tales portadores artificiales ocasionan una sinergia
con los portadores nativos (intraeritrocitarios). Es decir, el portador artificial molecularmente disperso en el plasma
sanguíneo no sólo cede oxígeno a los capilares de la mejor manera de por sí, sino que además refuerza la cesión de
oxígeno del sistema nativo existente, y concretamente mediante el mecanismos de la difusión facilitada. Esto significa
que para este propósito sólo se requiere una pequeña concentración del portador artificial en el plasma. A pesar de
ello, esta terapia funcional se mantiene excepcionalmente efectiva (véase anteriormente).
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Todo lo dicho pone de manifiesto la necesidad de un transportador de oxígeno artificial. Resulta imprescindible
para la utilización de un portador de oxígeno artificial que su material de partida esté disponible en cantidad suficiente.
Las reservas de sangre caducadas no resuelven por tanto el problema. Por ello es necesario utilizar hemoglobinas
animales, preferentemente de los animales de matadero más importantes; vacas y/o cerdos.
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A partir de la representación de la necesidad de portadores de oxígeno artificiales resultan a grandes rasgos dos tipos
de aplicación: por una parte en caso de una gran pérdida de sangre y por otra parte en caso de una falta de oxígeno
crónica. En el primer caso, para la compensación se necesita un sustituto volumétrico isooncótico transportador de
oxígeno (portadores de oxígeno artificiales de primera generación), en el segundo caso por el contrario, un aditivo
sanguíneo transportador de oxígeno (portadores de oxígeno artificiales de segunda y nueva generación). Como se ha
mencionado, el segundo caso es con mucho el más común. Por lo habitual, un aditivo sanguíneo correspondiente
permite, en combinación con un llamado expansor de plasma, también la terapia de una perdida de sangre grave con
la gran ventaja de que el médico tiene la posibilidad de adaptar tanto el aporte de portadores de oxígeno como también
del volumen de líquido a las necesidades del paciente concreto.
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También el organismo puede modificar ambos (cantidad del portador de oxígeno y volumen sanguíneo) independientemente entre sí, concretamente la formación de eritrocitos a través de eritropoyetina y el volumen plasmático
mediante un sistema de regulación propio. Ambas magnitudes se desacoplan por el hecho de que el portador tiene en
la sangre una presión osmótica coloidal mucho menor que el plasma.
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Hasta ahora otros han seguido fundamentalmente tres estrategias para el desarrollo de un portador de oxígeno para
la sangre (estado de la técnica; Rudolph A.S. y col. (eds.): Red Blood Cell Substitutes: Basic principles and Clinical
Applications, Marcel Dekker, Nueva York, u.a. 1998; Tsuchida E. (ed.): Blood Substitutes: Present and Future Perspectives, Elsevier Sciences, Ámsterdam 1998; Chang, T.M.S. (autor o ed.): Blood Substitutes: Principles, Methods,
Products and Clinical Trials, Volumen 1 y Volumen 2, Karger Landes, Basilea u.a. 1997 y 1998).
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Uso de emulsiones con hidrocarburos fluorados - últimamente también se utilizan otros halógenos como bromo - en
las que el oxígeno puede disolverse especialmente bien (Hirlingen W.K. y col. (1982): “Auswirkunden eines teilweisen
Blutaustausches mit Fluosol DA 20% auf den intakten Organismus des Schweines”, Annästhesist 31 660-666). Dado
que los fluorocarburos son lipófilos, es de esperar sin embargo que se produzcan interacciones y trastornos en las
capas lipídicas de las membranas celulares. Estas últimas son componentes funcionales integrantes de las células.
Además los fluorocarburos se deben dispersar con emulgentes tales como fosfolípidos, los cuales pueden interferir
adicionalmente con las membranas de las células (los llamados portadores de oxígeno artificiales sobre la base de
fluorocarburos de primera generación).
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La microencapsulación de soluciones altamente concentradas de hemoglobina natural y también químicamente
modificada en vesículas fosfolipídicas con la adición de efectores apropiados de la unión de hemoglobina (“eritrocitos
artificiales o hemosomas”) representa una estrategia adicional (Ogata Y. (1994): “Characteristics of Neo Red Cells,
Their Function and Safety: In-Vivo Studies”, Artificial Cells, Blood Substiutes, and Immobilization Biotechnologies
22 875-881). En este campo se han realizado también los primeros experimentos animales (Hunt, A.C, y col., (1995):
“Synthesis and Evaluation of a Protypal Artificial Red Cell”, Science 230: 1165-1168). Las vesículas tenían un diámetro de menos de 0,05 µm y eran por lo tanto en cuestión de volumen dos potencias decimales menores que los glóbulos
rojos naturales.
La tercera estrategia consiste en la preparación de soluciones de hemoglobina que se pueden infundir. El portador de oxígeno artificial está presente por lo tanto de forma extracelular en la sangre. Mientras que las dos primeras
soluciones del problema se pueden ver como la preparación de una sangre artificial, de forma que no puede aparecer
la dificultad de una interferencia osmótica coloidal, en el caso de esta solución del problema se encontraba inicialmente un expansor plasmático cuyas macromoléculas también podían transportar oxígeno (los llamados portadores de
oxígeno artificiales sobre la base de hemoglobina de primera generación).
La hemoglobina nativa no se puede usar para esto, ya que por ejemplo es excretada muy rápidamente por los
riñones. Es ineludible por lo tanto una modificación química. En el marco de esta estrategia por ejemplo se ha unido la hemoglobina por sus grupos amino de forma covalente a dextranos o se ha polimerizado entre sí hasta un
peso molecular de aproximadamente 700.000 g/mol. Lo primero fue perseguido por ejemplo por la empresa Fresenius (Fresenius E. (1976): “Blood and Plasma Substitute Comprising a Colloidal Solution of Hydroxyethyl Starch Coupled To Haemoglobin Free Stroma”, publicación de patente DE-P 2616-086)I y lo último por la empresa
Biotest (Bonhard K. y col. (1983): “Verfahren zur Gewinnung von hepatitissicheren, sterilen, pyrogenfreien und
stromafreien Hämoglobinlösungen”, documento de patente DE-O-3130770) y la empresa Alza (Bonsen P. (1976):
“Water-soluble Polymerized Hemoglobin”, documento de patente DE-O-2607706). Otra estrategia referente a soluciones extracelulares es estabilizar la hemoglobina, reticulándola en tetrámeros o enganchando grupos laterales
(oligoetilenglicol), sin aumentar esencialmente el peso molecular (tetramérico) (estabilisierte Hämoglobine (Matsushita M., y col. (1987): “In vivo Evaluation of Pyridoxylated Hemoglobin-Polyoxyethylene Conjugate”, Biomat.
Artif. Cells., artif. Org. 15: 377). Como se ha mencionado anteriormente, las soluciones de sustitutos sanguíneos extracelulares han demostrado en experimentos animales resultados prometedores en lo referente a un tratamiento de
choque.
Es una ventaja del uso de hemoglobinas como portadores de oxígeno artificiales - frente a los fluorocarburos - que
se puedan aprovechar las adecuadas propiedades de la unión natural a oxígeno. A ellas pertenecen la afinidad por el
oxígeno media óptimamente adaptada, la cooperatividad homotrópica, es decir, la forma de S de la curva de unión a
oxígeno, así como el efecto de Bohr (alcalino), que forma la base de un mecanismo de autorregulación natural para la
cesión dirigida de oxígeno a tejidos con carencia de suministro.
De la bibliografía relacionada se desprende claramente que un acoplamiento covalente intratetramérico de las unidades de hemoglobina (Keipert P.E. y col. (1989): “Metabolism, Distribution and Excretion of HbXL: A Nondissociation Interdimerically Crosslinked Hemoglobin with excepcional Oxygen Offloading Capability”, - en Chang T.M.S.,
Geyer R.P. (Eds.): Blood Substitutes, Marcel Dekker, Nueva York 1989) y/o una polimerización de la hemoglobina
conducen a un fuerte aumento del tiempo de permanencia en sangre (Chang T.M.S. (1987): “Modified Hemoglobin
as Red Cell Blood Substitutes”, Biomater., Med. Devices Artif. Organs 14: 323-328; Friedman H.J. y col. (1984): “In
vivo Evaluation of Pyridoxylated-Polymerized Hemoglobin Solution”, Surg., Gynecol., Obstet. 159: 429-435). Esto es
una condición esencial para la utilidad clínica de tales soluciones.
En el caso de los portadores de oxígeno artificiales extracelulares molecularmente dispersos, se han desarrollado
hasta ahora sin embargo ignorando un gran campo de demanda - la falta de oxígeno crónica -, intentando soluciones
isooncóticas. Las consecuencias de trastornos circulatorios crónicos que aparecen considerablemente más a menudo,
como se ha mencionado anteriormente, sólo se pueden mejorar mediante soluciones transportadoras de oxígeno cuya
presión osmótica coloidal se despreciable frente a la normal (3,5 kPa), es decir, sólo con ayuda de un aditivo sanguíneo
transportador de oxígeno, en cierto modo un concentrado eritrocítico molecular”. Estos son portadores de oxígeno
artificiales basados en hemoglobina de segunda generación.
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En los distintos intentos de desarrollar un transportador de oxígeno artificial surgieron los problemas que se mencionan a continuación:
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• Aumento de la afinidad oxígeno-hemoglobina: la presión de semisaturación (P50) se reduce a causa de la
modificación química en la molécula de hemoglobina. Por ello se dificulta la cesión del oxígeno al tejido.
Esto aparece marcadamente en el caso de la unión de hemoglobina a dextrano. Para evitar el aumento
de la afinidad de oxígeno, se han unido efectores apropiados (por ejemplo, piridoxalfosfato) a los grupos
prostéticos de la hemoglobina.
• A menudo disminuyen simultáneamente el llamado valor n50 (índice de HILL) como una expresión de la
cooperatividad homotrópica disminuida (forma de S atenuada de la curva de unión oxígeno-hemoglobina),
lo que de igual modo dificulta el suministro de oxígeno al tejido. Esta forma de S de la curva de unión
oxígeno-hemoglobina facilita asimismo la captación de oxígeno en los pulmones y su cesión a las células.
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Los fluorocarburos poseen por el contrario una “curva de unión a oxígeno” lineal y no tienen por lo tanto
la misma ventaja funcional.
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• El portador de oxígeno artificial tiene a menudo un tiempo de permanencia en el organismo demasiado
escaso, la excreción de las hemoglobinas disueltas se lleva a cabo a través de los riñones. En caso de
soluciones de hemoglobina extracelulares como portadores de oxígeno artificiales se ha intentado impedir la
excreción mediante reticulación intermolecular, no obstante el tiempo de permanencia de las hemoglobinas
extracelulares sigue siendo inferior al deseado. Por el contrario, los hemosomas son retirados del plasma
por el sistema retículoendotelial del organismo. Por ejemplo, el tiempo medio de los eritrocitos artificiales
ascendió a sólo 5,8 horas (véase anteriormente).
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• Respecto a la alta presión osmótica coloidal: A causa de ello se puede producir una pérdida de volumen
(choque hipovolémico). Este efecto aparece cuando el peso molecular del portador de oxígeno artificial es
comparable con el de las proteínas plasmáticas. Tampoco se tiene libertad a este respecto con la dosificación
del portador de oxígeno artificial, sino que se tienen que tomar en consideración las proporciones oncóticas.
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• El ambiente oncótico del plasma se determina además de forma decisiva por el llamado segundo coeficiente
del virial (valor A2 ): éste caracteriza la interacción del portador de oxígeno (siempre macromolecular) con
el disolvente (agua). La síntesis ha de ajustarse de tal manera que este valor se aproxime a cero.
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• Respecto a la alta viscosidad de la solución de portador: esta va acompañada normalmente por un valor
A2 demasiado elevado, y aparece preferiblemente cuando un portador está compuesto de moléculas en
cadena. Una viscosidad demasiado elevada no aparece según la ley de la viscosidad de Einstein cuando las
moléculas portadoras poliméricas son redondeadas y compactas.
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• Estabilidad in vitro de las moléculas portadoras: esta se refiere por un lado a la desintegración de las moléculas y por otro a la unión oxidativa de metahemoglobina, la cual ya no puede unir oxígeno y finalmente
a la viscosidad a través de interacciones que se modifican lentamente entre el portador y la albúmina del
plasma.
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• Reacción desproporcionada del sistema reticuloendotelial (SRE): Un factor de influencia principal es el
tamaño molecular del portador artificial. Existe para ello un límite crítico en aproximadamente 0,3 µm:
partículas mayores activan el SRE.
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• Daño renal y hepático: Un choque renal apareció sobre todo cuando se usó solución de hemoglobina con
contenido en estroma. Desde que se ultrafiltran las soluciones, ya no se ha observado ningún daño renal.
Los daños hepáticos se indicaron con ayuda del perfil de transaminasas plasmáticas, estas se basan presumiblemente en interacciones de la membrana celular: el hígado posee una circulación abierta (capilares
fenestrados).
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• También debe comprobarse la hemostasia; son posibles trastornos en el sentido de una potenciación o de
un impedimento, se debe prestar especial atención a la agregación de los trombocitos.
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• Efecto antigénico: respecto a esto se ha demostrado recientemente en estudios homólogos con ratas que la
hemoglobina nativa no tiene un efecto antigénico y que la polimerización con glutardialdehído no aumenta
la antigenicidad (Hertzman C.M. y col. (1986): “FERUM Antibody Titers in Rats Receiving Repeated
Small Subcutaneous Injection of Hemoglobin or Polyhemoglobin. A Preliminary Report”. Int. J. Artif.
Organs 9: 179-192). En el mismo trabajo se muestra que la hemoglobina humana nativa y polimerizada
actúa de forma poco antigénica en ratas y que el efecto mediante la polimerización se refuerza como mucho
en un grado mínimo.
• Los efectos tóxicos se pueden diferenciar en pirogénicos, vasoconstrictores - por ejemplo en los vasos
coronarios - y endotóxicos. El efecto vasoconstrictor se basa presumiblemente en la captura de los radicales
de monóxido de nitrógeno, los cuales son sustancias de control vasodilatadoras endógenas conocidas; el
efecto vasoconstrictor se puede aclarar no obstante también mediante la alta eficacia de los portadores
artificiales, ya que se suministra “demasiado bien” oxígeno a la musculatura lisa.
• Estabilidad in vivo: Se puede pensar en una catálisis enzimática endógena, por ejemplo mediante proteasas.
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• Sobrecarga del organismo con lipoides (emulgentes): esta complicación aparece con la aplicación de soluciones de hemoglobina y fluorocarburos microencapsuladas, a este respecto se determinaron en ratas una
activación del complemento a través de la ruta alternativa así como una formación de anticuerpos.
• La tolerabilidad de los portadores artificiales con plasma sanguíneo humano reciente, en función del valor
de pH puede producir precipitaciones.
Presumiblemente a causa de los problemas mencionados hasta ahora no está disponible un portador de oxígeno
artificial para la aplicación clínica rutinaria.
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A partir de la mención de los diversos problemas se deduce que aún sigue habiendo un gran catálogo de requerimientos para un portador de oxígeno artificial útil.
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En la naturaleza el oxígeno siempre se transporta en enormes agregados microscópicos. Aquí se han desarrollado
básicamente dos “soluciones al problema” diferentes. En animales superiores (y también en los seres humanos), el
portador de oxígeno molecular está empaquetado en células (en los eritrocitos). En segundo lugar se desarrollaron
enormes moléculas de unión a oxígeno que no se encuentran intracelularmente, sino extracelularmente disueltas en
la hemolinfa, esta variante se encuentra predominantemente en animales inferiores con diferentes características. Los
anélidos poseen por ejemplo hemoglobinas de alto peso molecular con un peso molecular medio alrededor de 3000000
g/mol como portadores de oxígeno. Además existen las llamadas hemoeritrinas, en las que el hierro como agente de
unión a oxígeno está directamente acoplado molecularmente a la proteína. Finalmente se encuentran las hemocianinas
con un peso molecular alrededor de 8000000 g/mol, en las que el ión de metal pesado de unión a oxígeno es cobre, véase también Barnikol W.K.R., y col. (1996): “Hyperpolymere Hämoglobine als küstliche Sauerstoffträger. Ein
innovativer Ansatz der medizinischen Entwicklung”, Therapiewoche 46: 811-815.
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La transición en la historia del desarrollo desde los portadores de oxígeno extracelulares hasta los eritrocitos ha
llevado a que el contenido en oxígeno del fluido sanguíneo se incremente tres veces: mientras que 1 ml de “sangre” de
la lombriz de tierra sólo puede unir como máximo 3,6 µmoles de oxígeno, en el mismo volumen de sangre humana se
unen hasta 9,0 µmoles de oxígeno.
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La lombriz de tierra posee en su sangre enormes moléculas (eritrocruorina) como portadores de oxígeno con un
peso molecular de aproximadamente 3400000 g/mol con alrededor de 200 sitios de unión para oxígeno. Además la
molécula es muy compacta y su estructura cuaternaria es altamente ordenada. La molécula es tan grande que se puede
ver directamente con ayuda del microscopio electrónico. Su concentración en la hemolinfa asciende a al menos 6
g/dl. La medición de la curva de unión a oxígeno en condiciones in vivo simuladas da como resultado una presión
de semisaturación (P50) de 9,1 Torr (1,2 kPa) (Barnikol W.K.R., Burkhard O. (1987): “Highly Polymeryzed Human
Hemoglobin as an Oxygen Carrying Blood Substitute”, Advances in Experimental Medicine and Biology Volumen
215: 129-134; Barnikol W.K.R. (1986): “The Influence of Glutardialdehyde on the Oxygen Cooperativity of Human
Hemoglobin”, Pflügers Archiv 406: R61). Este sistema suministra por lo tanto suficiente oxígeno a las células de la
lombriz de tierra. Por el peso molecular extremadamente alto, la hemoglobina de la lombriz de tierra prácticamente ya
no tiene ningún efecto osmótico coloidal (sólo aproximadamente 4 kPa). Con ello, como en la sangre de los mamíferos
- la presión oncótica de los eritrocitos asciende sólo a 1,3 10−6 Pa - tanto la función de coloidoosmolaridad y de unión
a oxígeno están desacopladas, y ambas pueden variarse libremente por el organismo como variable de control.
Si se quiere transmitir el principio del sistema de la lombriz de tierra a portadores de oxígeno artificiales que
se basen en hemoglobina humana o animal, se debe modificar la molécula de hemoglobina de tal forma que pueda
apoyar como enorme molécula extracelular con presión oncótica despreciable al transporte de oxígeno normal de los
eritrocitos al menos temporalmente. Tales portadores de oxígeno artificiales son por lo tanto hemoglobina altamente
polimerizada que debe tener en cuenta toda la problemática anteriormente mencionada. La “hemoglobina” de lombriz
de tierra, que cumple con los requisitos de presión oncótica, no se puede usar para este propósito en humanos porque
presumiblemente posee una alta antigenicidad, además la presión de semisaturación es con 1,2 kPa demasiado baja
(Barnikol W.K.R., Burkhard O. (1987): “Highly Polymeryzed Human Hemoglobin as an Oxygen Carrying Blood
Substitute”, Advances in Experimental Medicine and Biology Volumen 215: 129-134; Barnikol W.K.R. (1986): “The
Influence of Glutardialdehyde on the Oxygen Cooperativity of Human Hemoglobin”, Pflügers Archiv 406: R61).
Además, presumiblemente no se puede obtener en las cantidades necesarias.
Hasta ahora, en el desarrollo de portadores de oxígeno artificiales se ha intentado ajustar su presión de semisaturación exactamente al valor normal para el ser humano de aproximadamente 3,47 kPa. Experimentos con animales
muestran en realidad que un portador de oxígeno artificial molecularmente disperso con una presión de semisaturación
de aproximadamente 2 kPa oxigena los órganos de la mejor forma (Conover y col. (1999), Art. Cells, Blood Subst., and
Immobil. Biotech. 27 93-107). Por otra parte, experimentos con animales muestran también no obstante que para un
suministro suficiente de oxígeno resulta igualmente importante una capacidad de oxígeno de la sangre suficientemente
grande (Moss G.S., y col. (1984): “Hemoglobin Solution - From Tetramer to Polymer”, en: The Red Cells; Sixth Aven
Arbor Conference, Alan Riss, Nueva York, 1984: 191-210). Esta depende a su vez de la concentración posible del
portador de oxígeno en el plasma. Además se demuestra a este respecto que una presión de semisaturación de 3,47
kPa no se debe mantener indispensablemente. Esencialmente consiste más bien en que no se puede quedar por debajo
de un valor crítico determinado.
A los requerimientos en el desarrollo de un portador de oxígeno artificial se suman el hecho de que un procedimiento de preparación debe ser lo más simple posible y con ello rentable, sobre todo ya que se debe trabajar de forma
estéril desde el principio. El producto se debe poder obtener con el mayor rendimiento posible. Durante la reacción
de reticulación se debe producir simultáneamente material para su uso como aditivo sanguíneo así como aquel para su
uso como sustituto del volumen sanguíneo transportador de oxígeno.
En especial, en la preparación de los polímeros artificiales de hemoglobina mediante la reticulación de las moléculas de hemoglobina a través de sus grupos amino por medio de reticulantes difuncionales se debe prestar atención
además a que no se formen redes moleculares que son insolubles y por lo tanto disminuyen el rendimiento del producto. Por ello debe evitarse la aparición de la llamada distribución de percolación de los pesos moleculares:
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La presente invención tenía como objetivo poder preparar en un procedimiento técnicamente sencillo con grandes
rendimientos portadores de oxígeno artificiales hipooncóticos de hemoglobina reticulada que poseyesen buenas características funcionales optimizadas, en especial la característica de la unión a oxígeno y que fuesen adecuados para
aplicarse como productos farmacéuticos a seres humanos.
5
10
15
El objetivo se consigue según la invención como se describe a continuación. El problema fundamental de la aparición de una distribución de percolación de los grados de multimerización y de los pesos moleculares a través de
la reticulación de las hemoglobinas polifuncionales con el reticulante difuncional glutardialdehído se pudo resolver
sorprendentemente gracias al hecho de que durante la reticulación el volumen de la mezcla de reacción se aumenta en
gran medida (en total de 2 a 10 veces), y concretamente, añadiendo en primer lugar simultáneamente el reticulante en
solución diluida y a continuación diluyéndolo adicionalmente con agua. Con ello se producen hemoglobinas reticuladas con alto grado de reticulación con altos rendimientos, sin que se produzca una distribución de percolación de los
pesos moleculares con formación de redes moleculares insolubles. El producto en bruto de la reticulación destaca más
bien por un límite superior deseado (aproximado) determinado del intervalo de pesos moleculares. Se obtiene en el
cromatograma en gel una llamada distribución en cuadrilátero del peso molecular (véanse la figura 1, figura 2 y figura
3).
La preparación según la invención comprende por lo tanto las siguientes etapas:
20
En una reacción en un recipiente, la hemoglobina
i) en primer lugar se desoxigena, en especial mediante flujo de nitrógeno;
ii) a continuación se hace reaccionar covalentemente con un efector químicamente reactivo de la unión a oxígeno:
25
iii) luego se mezcla la solución con un efector no reactivo químicamente y entonces
30
iv) la hemoglobina se reticula entre sí covalentemente de modo estable con glutardialdehído, bajo una gran dilución
(de 2 a 5 veces) del volumen de la mezcla de reacción, con adición simultánea del reticulante (en solución), y a
continuación el volumen de reacción se aumenta adicionalmente (dilución total del volumen de la solución hasta 210, en especial 2-7, especialmente 5-6 veces el volumen) y después
v) se acopla covalentemente un óxido de polietileno.
35
El producto obtenido se puede procesar de forma conocida.
Preferiblemente, la hemoglobina de partida es de origen porcino o proviene de seres humanos, con muy especial
preferencia, de origen porcino, en especial del cerdo doméstico.
40
45
En especial, según la invención, en la etapa iii) se añade glutardialdehído en una solución altamente diluida de
forma cronometrada. Preferiblemente, se lleva a cabo a continuación una dilución adicional y un aumento del volumen
de reacción con agua, de forma que se alcance la dilución total anteriormente mencionada.
A este respecto se prefiere que en la etapa iv) se añada glutardialdehído en una cantidad en moles de 6-10, preferiblemente 7-9 mol/mol en relación con la hemoglobina monomérica, disuelto en 1-4, preferiblemente 1-2, en especial
1,5-2, con muy especial preferencia 1,7-1,9 litros de agua por litro de solución de reacción original.
Esta adición se lleva a cabo de forma cronometrada entre aproximadamente 3 y 15, preferiblemente 3-10, en
especial 4-6 minutos. A continuación la solución reacciona entre 1 y 6 horas.
50
Adicionalmente se prefiere que a la solución que contiene hemoglobina antes de la reacción según la etapa ii) se le
añadan 2-8, en especial 3-6, con muy especial preferencia 3-4 moles de ascorbato de sodio por mol de hemoglobina
no reticulada. Esta reacción se lleva a cabo a lo largo de 0,5-6 horas, en especial 70-120 minutos.
55
60
Además se une covalentemente, en la etapa ii) preferentemente, como efector piridoxal-5’-fosfato en una proporción molar, en relación con la hemoglobina monomérica de 0,5 a 3, preferiblemente de 1 a 2,5 mol/mol a lo largo de
un periodo de 0,5-20, en especial de 1-7 horas.
Según la invención resulta además ventajoso y se prefiere que en la etapa iii) así como en la etapa iv) tras la unión
covalente de piridoxal-5’-fosfato así como glutardialdehído se añada respectivamente borohidruro sódico reductor.
Este se añade en especial en la etapa ii) en una cantidad de 1-9, preferiblemente de 1-5, en especial de 1-2,5
mol/mol, por ejemplo de 30 a 90 minutos, y en la etapa iv) en una cantidad de 5-20, en especial de 6-12 mol/mol,
respectivamente en relación con la hemoglobina monomérica durante 15 a 100 minutos.
65
Con especial preferencia, en la etapa iii) se añade como efector químicamente no reactivo 2,3-difosfoglicerato en
una cantidad de 0,5-6, en especial de 1-4 mol/mol, en relación con la hemoglobina monomérica y aproximadamente
5-50 minutos, en especial 10-20 y con muy especial 15 minutos después se añade glutardialdehído.
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Como poli(óxido de etileno) se acopla preferiblemente un éter polieteilenglicólico por ejemplo con un resto alquilo C1-C5 como metilo, etilo, butilo con un peso molecular de 500 a 3000 g/mol, en especial un derivado de metoxipolietilenglicol con un peso molecular de 1500-2500 g/mol, en especial de 2000 g/mol, como especialmente succinimidil-propionato de metoxi-polietilenglicol, en cantidades de 2-12, en especial de 3-8 mol/mol de hemoglobina.
Otros productos de derivatización son metoxi-polietilenglicol-succinimidill-succinamida y succinimidil-oxiacetato de
metoxipolietilenglicol.
El acoplamiento de poli(óxido de alquileno) a hemoglobinas no reticuladas se describe en los documentos US-A
4179337, US 5478805, US 5386014, EP-A 0206448, EP-A 0067029, DE-OS 3026398.
10
La reacción se lleva a cabo preferiblemente a lo largo de 1-4, en especial 2-3 horas.
15
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25
Adicionalmente resulta ventajoso que todas las reacciones de preparación se lleven a cabo especialmente en soluciones que se han liberado de oxígeno mediante tonometría con gases libres de oxígeno. El procedimiento usado
se describe en: Pötzschke H.: Hyperpolymere des menschliches Hämoglobins: Entwicklung präparativer Verfahren zu
ihrer Synthese, Validierung analitischer Methoden und Geräte zu ihrer Charakterisierung, Tesis doctoral, Facultad de
Medicina, Universidad de Viena, 1997.
El producto obtenido puede procesarse de forma conocida, como se indica a continuación. Presenta especialmente
una distribución de pesos moleculares de 50000 hasta 5000000, dado el caso hasta 10000000 g/mol o más.
El producto obtenido se puede separar en una fracción de peso molecular medio superior y una fracción de peso
molecular medio inferior, estando el límite de separación preferiblemente en torno a los 700000 g/mol, mediante un
procedimiento de separación de sustancias preparativo, como por ejemplo una cromatografía de exclusión volumétrica, una ultrafiltración, una precipitación fraccionada, por ejemplo con poli(óxido de alquileno) o sales como sulfato
amónico como agente de precipitación o un procedimiento de fraccionamiento de campo-flujo (véase Curling J.M.
(ed) Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press, Londres entre otros 1980, así como los documentos
de patente EP-A 0854151 y EP-A 95107280).
30
A partir del producto de masa molecular superior y a partir del producto de masa molecular inferior se puede
preparar respectivamente una preparación farmacéutica, obteniéndose a partir de la porción de bajo peso molecular
de los polímeros un sustituto sanguíneo parenteral y a partir de la porción de alto peso molecular de los polímeros un
aditivo sanguíneo parenteral.
35
El ajuste del valor de pH antes (y después) de las etapas de reacción individuales se lleva a cabo preferiblemente
con ácido láctico o sosa cáustica hasta valores entre 6 y 10, dependiendo de la etapa de reacción, por ejemplo 6,5-7,5
antes de la etapa ii), a continuación a 7,5-8,5 y después de nuevo a 6,5-7,5 antes de la etapa iii), después a 7,5 a 9 así
como antes de la etapa v) a 7,5-10.
40
La concentración de hemoglobina asciende preferiblemente a 200-380 g/l, en especial 240-360 g/l, la solución
contiene adicionalmente 10 a 150 mmol/l de NaHCO3 así como 10 a 150 mmol/l de NaCl.
La temperatura durante la “reacción de un recipiente” asciende a 2-42ºC, en especial a 3-25ºC, preferiblemente a
4-22ºC.
45
El portador de oxígeno artificial preparado según la invención presenta preferiblemente un valor n50 (cooperatividad) de 1,6 a 2,5 y un valor de p50 (presión de semisaturación) de 2,1 a 3,2 kPa.
50
El producto obtenido según la invención con las características mencionadas se puede usar para la preparación de
un agente para la aplicación intravascular o biomédica como portador de oxígeno artificial o en forma de una preparación farmacéutica como reemplazo sanguíneo (sustituto sanguíneo) o como un añadido a la sangre para aumentar la
capacidad de transporte de oxígeno (aditivo sanguíneo) o a una solución alimenticia en el organismo humano o animal, en órganos individuales o en aplicaciones biotecnológicas, en especial para el tratamiento de una falta de oxígeno
crónica en el ser humano.
55
Para la preparación de los productos que se van a administrar, los derivados de hemoglobina según la invención se
disuelven en medios apropiados, como soluciones para infusión, por ejemplo en solución acuosa salina o de glucosa,
preferiblemente a concentraciones isotónicas con el plasma sanguíneo.
60
65
El procedimiento según la invención se basa por lo tanto en etapas de reacción individuales coordinadas entre sí,
cuyo significado y repercusión se explican a continuación.
Como material de partida sirve hemoglobina altamente pura. Esta se puede obtener según procedimientos conocidos a partir de sangre fresca de animales de matadero o por ejemplo a partir de sangre conservada caducada. Se
describen procedimientos para la obtención de hemoglobina purificada en: Antonini E. y col. (eds.): Hämoglobins
(Colowick S.P., Kaplan N.O. (eds.): Methods in Enzymology, Volume 76), Academic Press, Nueva York, entre otros
1981.
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5
Como se ha mencionado, según la invención la hemoglobina está desoxigenada (es decir, libre de su ligando
fisiológico) durante la reticulación con glutardialdehído, la cual es conocida en sí misma, véanse los documentos DE
2499885, US 4857636, US-A 4001200, US-A 4001401, DE 449885, US 5439882, EP-A 0201618, ya que sólo los
polímeros preparados a partir de hemoglobina desoxigenada durante la reticulación poseen propiedades de unión de
oxígeno que posibilitan un empleo como portador de oxígeno artificial en las indicaciones deseadas.
Preferiblemente, para una segunda protección contra la oxidación de la hemoglobina por trazas de oxígeno restante,
éste se puede eliminar mediante reacción química con iones ascorbato.
10
Como efector de la unión de oxígeno se une en especial piridoxal-5’-fosfato, en una cantidad optimizada según
las propiedades del producto final, de forma covalente a la hemoglobina porcina o humana. Esta unión de piridoxal5’-fosfato a hemoglobina es en principio conocida, por ejemplo, el documento de patente EP-P0528841 describe un
procedimiento para la preparación de hemoglobina piridoxilada. La piridoxilación conduce a los valores de presión de
semisaturación deseados, cuando se procede como se describe según la invención.
15
20
Los lugares de acoplamiento (aldiminas = bases de Schiff) del acoplamiento covalente no estable de piridoxal5’-fosfato se pueden estabilizar de forma conocida (v.a.) mediante reducción con borohidruro de sodio (se producen
aminas), manteniéndose según la invención las condiciones especiales mencionadas. Para proteger la capacidad de las
moléculas de hemoglobina de una cooperatividad homotrópica de los sitios de unión de oxígeno entre sí, que en la mayoría de los casos se pierde claramente con la reticulación de la hemoglobina con el reticulante glutardialdehído, según
la invención se añade antes de la reticulación 2,3-difosfoglicerato, un efector químico (heterotrópico) no reactivo de la
unión de oxígeno de la hemoglobina. Este puede estar almacenado con ello durante la reticulación de forma reversible
en su sitio de unión en la molécula de hemoglobina. Tras la síntesis, se eliminan completamente 2,3-difosfoglicerato
junto con los reactantes no consumidos así como productos de reacción sobrantes (véase más adelante).
25
Como reticulante bifuncional se emplea glutardialdehído en las condiciones según la invención especificadas anteriormente.
30
Los sitios de acoplamiento (aldiminas = bases de Schiff) de los puentes de glutardialdehído moleculares de reticulación se estabilizan como se ha descrito mediante la reacción con borohidruro de sodio (se producen aminas),
debiéndose mantener las condiciones según la invención.
Mediante la reticulación se producen hemoglobinas reticuladas con una distribución de los pesos moleculares entre
aproximadamente 50000 y 5000000 g/mol (y mayores, por ejemplo 10-15000000 g/mol).
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40
45
Para mejorar la compatibilidad con las proteínas del plasma, se acopla a la hemoglobina reticulada un derivado(MVV) de poli(óxido de etileno), en especial el recientemente mencionado (metoxi)polietilenglicol monofuncionalmente activado con un peso molecular de 1500-2500 g/mol. El acoplamiento de polietilenglicol (PEG), la llamada
pegelación así como también la reticulación de hemoglobina son en sí conocidas (véase también E. Tsucheda (ed.):
Blood Substituts: Present and Future Perspectives, Elsevier Science, Ámsterdam 1998).
No obstante son nuevas tanto la pegelación como también la reticulación de hemoglobina conjuntamente, así como
la aplicación del efector químicamente ineficaz antes de la reticulación, lo que contribuye en especial al mantenimiento
de la cooperatividad, como también en especial las condiciones de reticulación detalladas. Mediante la pegelación que
se propone en este documento, se impide ahora la en cualquier caso débil reacción del SER y también la degradación
enzimática mediante proteasas.
El ajuste del valor de pH se lleva a cabo como se ha detallado anteriormente.
50
Mediante el desarrollo y las condiciones de reacción conseguidos para ello se puede por una parte impedir la
aparición de una distribución de percolación (mediante la dilución según la invención), por otra parte se pueden evitar
las alteraciones indeseables de la afinidad por el oxígeno y la cooperatividad condicionadas por la reticulación y las
uniones covalentes a la hemoglobina por ejemplo de glutardialdehído, piridoxalfosfato y poli(óxido de etileno), y en
especial también se puede conseguir una alta compatibilidad plasmática.
55
Todas las etapas de reacción contribuyen a estas propiedades especiales del producto preparado según la invención.
60
65
El procesamiento posterior se encentra en el marco del conocimiento del experto en la materia: los componentes
insolubles se pueden separar por centrifugación (por ejemplo durante 20 minutos con una aceleración centrifuga
relativa de 20000 g).
Las hemoglobinas reticuladas se separan mediante una etapa de procedimiento (conocida) preparativa, por ejemplo mediante una cromatografía de exclusión volumétrica o una ultrafiltración, una precipitación fraccionada o un
fraccionamiento de campo-flujo, en una porción de bajo peso molecular y otra de alto peso molecular. Eligiendo
procedimientos adecuados (son especialmente importantes el límite de separación nominal de peso molecular de la
membrana de ultrafiltración o la zona de separación de peso molecular del gel empleado), se eliminan a este respecto
al mismo tiempo todos los reactantes no consumidos así como los productos de reacción no deseados.
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Una configuración especialmente preferida de la invención se aclara con más detalle por medio del siguiente
ejemplo de preparación:
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Se disuelve hemoglobina porcina o humana purificada con una concentración entre 200 y 380 g/l, preferiblemente
entre 240 y 360 g/l en una solución acuosa electrolítica. Esta contiene hidrogenocarbonato de sodio con una concentración entre 10 y 150 mmol/l, preferiblemente entre 40 y 60 mmol/l, así como cloruro de sodio con una concentración
entre 10 y 150 mmol/l, preferiblemente entre 50 y 100 mmol/l.
La temperatura asciende a 2 a 42ºC, preferiblemente entre 3 y 25ºC.
10
Esta solución de hemoglobina se agita, se lleva a cabo una desoxigenación de la hemoglobina mediante flujo de
nitrógeno puro.
15
A esta solución se añaden de 2 a 8, preferiblemente de 3 a 4 mol de ascorbato de sodio (como solución 1 molar en
agua) por mol de hemoglobina y se deja reaccionar entre 0,5 y 6 horas, preferiblemente entre 70 y 120 minutos.
El valor de pH de la solución se titula ahora con ácido láctico o sosa cáustica (de una concentración entre 0,1 y 1,
preferiblemente entre 0,4 y 0,6 mol/l) hasta un valor entre 6,5 y 7,5, preferiblemente entre 6,9 y 7,3.
20
En este momento se añaden 0,5 a 3,0, preferiblemente de 1,0 a 2,5 moles de piridoxal-5’-fosfato por mol de
hemoglobina y se dejan reaccionar entre 0,5 y 20, preferiblemente entre 1 y 7 horas.
El valor de pH se ajusta con sosa cáustica o ácido láctico (de una concentración entre 0,1 y 1, preferiblemente entre
0,4 y 0,6 mol/l) a un valor entre 7,5 y 8,5, preferiblemente entre 7,7 y 8,2.
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30
35
Ahora se añaden de 1,0 a 9,0, preferiblemente aproximadamente de 1,0 a 2,5 moles de borohidruro de sodio (como
solución 1 molar en sosa cáustica 0,01 molar) y se dejan reaccionar entre 30 y 90, preferiblemente entre 50 y 70
minutos. El valor de pH de la solución se titula con ácido láctico o sosa cáustica (de una concentración entre 0,1 y 1,
preferiblemente entre 0,4 y 0,6 mol/l) a un valor entre 6,5 y 7,5, preferiblemente entre 6,9 y 7,5. En este momento se
añaden de 0,5 a 6,0, preferiblemente de 1,0 a 4,0 moles de 2,3-difosofoglicerato por mol de hemoglobina y se dejan
reaccionar entre 5 y 50, preferiblemente entre 10 y 20 minutos.
A continuación se lleva a cabo la adición controlada cronometrada del reticulante bifuncional, se añaden entre 6 y
10, preferiblemente entre 7 y 9 moles de glutardialdehído por mol de hemoglobina, disuelto en 1-4, preferiblemente
en 1,5 a 2 litros de agua por litro de solución de hemoglobina, durante 3 a 10, preferiblemente durante 4 a 6 minutos
y se dejan reaccionar entre 1 y 6, preferiblemente entre 2 y 3 horas.
El valor de pH se ajusta con sosa cáustica o ácido láctico (de una concentración entre 0,1 y 1, preferiblemente entre
0,4 y 0,6 mol/l) a un valor entre 7,5 y 9,0, preferiblemente entre 7,6 y 8,8.
40
Se añaden de 5 a 20, preferiblemente de 6 a 12 moles de borohidruro de sodio (como solución 1 molar en sosa
cáustica 0,01 molar) por mol de hemoglobina y se dejan reaccionar entre 15 y 100, preferiblemente entre 30 y 80
minutos.
45
Entonces se lleva a cabo una adición de 0 a 4, preferiblemente entre 0,5 y 3 litros de agua por litro de la solución
de hemoglobina origina. El valor de pH se ajusta, en caso de que fuese necesario, con sosa cáustica o ácido láctico (de
una concentración entre 0,1 y 1, preferiblemente entre 0,4 y 0,6 mol/l) a un valor entre 7,5 y 10, preferiblemente entre
8 y 9.
50
En este momento se añaden por mol de hemoglobina monomérica entre 2 y 12, preferiblemente entre 3 y 8 moles de
un derivado de poli(óxido de alquileno) activado, preferiblemente succinimidil-propionato de metoxi-polietilenglicol,
con un peso molecular entre 500 y 3000, preferiblemente 1000 y 2500 g/mol, en especial 2000 g/mol.
55
A continuación se sustituye con agitación constante de la solución de hemoglobina la atmósfera de nitrógeno
durante 1 a 3 horas por oxígeno puro y se oxigena completamente la hemoglobina.
El procesamiento se lleva a cabo como se ha detallado anteriormente.
Las ventajas del procedimiento según la invención se pueden resumir como sigue:
60
65
Mediante el desarrollo de la reacción según la invención, en especial mediante el aumento de volumen de reacción
en la etapa iv) del procedimiento, se obtiene un producto que se puede utilizar íntegramente para la preparación de portadores de oxígeno artificiales y concretamente, aproximadamente por igual respectivamente como aditivo sanguíneo
(la fracción con la hemoglobina reticulada de mayor grado de polimerización: fracción I) y como sustituto de volumen
sanguíneo (fracción II, con las porciones de bajo peso molecular). La separación se puede llevar a cabo fácilmente con
procedimientos conocidos, algunos procedimientos posibles se especifican por ejemplo en los documentos de patente
EP-A95107280 y EP-A 97100790. Los polímeros de la fracción I, preferiblemente hasta un peso molecular mayor
de 700000 g/mol son tan suficientemente uniformes molecularmente, que en la concentración plasmática terapéutica
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deseable poseen una presión osmótica coloidal suficientemente baja. Gracias a esta uniformidad molecular se alcaza
simultáneamente una coeficiente virial bajo, así como una escasa viscosidad. La compatibilidad con las proteínas del
plasma sanguíneo, una compatibilidad inmune y tiempo de permanencia intravasal suficientes así como unos efectos
secundarios vasoconstrictores suficientemente escasos, es decir, una escasa extravasación de los polímeros de la fracción molecular I se consigue mediante un acoplamiento covalente de poli(óxidos de alquileno). Adicionalmente, el
requisito de simplicidad y rentabilidad se tiene en cuenta de forma decisiva en este nuevo procedimiento ya que toda
la preparación tiene lugar en un único recipiente (la llamada preparación en un recipiente) y se consiguen altos rendimientos de más del 70%, ascendiendo los rendimientos de polímeros con un peso molecular mayor de 700000 g/mol a
más del 15%. El procedimiento de preparación posibilita la preparación de hemoglobinas modificadas y reticuladas en
pocas etapas de procedimiento. Los parámetros de procedimiento elegidos conducen a este respecto a una distribución
definida de los polímeros de hemoglobina modificados, que son adecuados como portadores de oxígeno artificiales y
tienen en cuenta las circunstancias fisiológicas en el suero sanguíneo.
Además, la cooperatividad de la hemoglobina no reticulada se mantiene considerablemente en el producto reticulado y la presión de semisaturación se puede ajustar de forma adecuada.
Los portadores de oxígeno artificiales preparados según la invención de hemoglobina reticulada son compatibles
con el plasma en administración parenteral y se pueden aplicar clínicamente como se ha detallado.
20
La invención se explicará más detalladamente por medio de los siguientes ejemplos.
A este respecto, las figuras 1-3 muestras lo siguiente:
25
Figura 1: una distribución ponderada en masa de los tamaños moleculares y de los pesos moleculares (M) del
polímero de hemoglobina porcina del ejemplo 1, representada como cromatograma de exclusión volumétrica (obtenido
con gel Sephacryl S-400 HR, Pharmacia, Friburgo, Alemania). E425nm es la extinción en el eluido de cromatografía a
425 nm. Se incluyen los valores de abscisas de 700000 y 5000000 g/mol.
Figura 2: cromatograma para el ejemplo de aplicación 2, para las aclaraciones véase la figura 1.
30
Figura 2: cromatograma para el ejemplo de aplicación 3, para las aclaraciones véase la figura 1.
Además se aplicaron los siguientes procedimientos de determinación:
35
1. Contenidos en hemoglobina: se midieron fotométricamente con el procedimiento de cianohemiglobina modificado según Drabkin (“Hämoglobin-Farbtest MRP 3”, Boehrimger Manheim, Alemania).
2. Valores de pH: se midieron potenciométricamente (electrodo de vidrio de pH) con un analizador de gases sanguíneos (“ABL 5”, Radiómetro, Willich, Alemania).
40
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3. Se llevaron a cabo determinaciones de la distribución de pesos moleculares de las hemoglobinas reticuladas
mediante cromatografía de exclusión volumétrica (según: Pötzschke H. y col. (1996): “Vernetzte globuläre Proteine eine neue Klasse halbsynthetischer polymerer Moleküle: Characterisierung ihrer Struktur in Lösung am Beispiel hyperpolymeren Hämoglobins und Myoglobins mittels Volumenausschluss-Chromatografie, Viskometrie, Osmometrie
und Lichtstreuung”, Macromolecular Chemistry and Physics 197, 1419 - 1437, así como Pötzschke H. y col. (1996):
“Ein neuartiges Verfahren zur bestimmung Molarer Massen breit verteilter Polymerer mit Hilfe der Gel-Chromatographie und der Viskometrie am Beispiel Hämoglobin-Hyperpolymerer”, Macromolecular Chemistry and Physics
197, 3229 - 3250) en el gel “Sephacryl S-400HR” (Pharmacia Bioitech, Friburgo, Alemania).
50
4. Se llevaron a cabo determinaciones de las características de unión a oxígeno de las hemoglobinas por medio de un procedimiento y aparato propio (como se describe en: Barnikol W.K.R. y col. (1978); “Eine verbesserte
Modifikation der Mikromethode nach Niesel und Thews zur Messung von O2 -Hb-Bindungskurven in Vollblut und
konzentrierten Hb-Lösungen”, Respiration 36, 86 - 95.
55
5. La investigación de la compatibilidad plasmática de hemoglobinas reticuladas se llevó a cabo por medio de
una prueba de precipitación estandarizada in vitro. (Domack U. (1997), “Entwicklung und in vivo Evaluation eines
künstliches Sauerstoffsträgers auf Basis von Rinderhämoglobin”, Tesis doctoral, Departamento de Química, Universidad Johannes Gutenberg, Maguncia, 1997): se mezclaron soluciones de hemoglobina (contenidos en hemoglobina
aproximadamente 30 g/l, en una solución acuosa electrolítica (StLg) de la composición NaCl 125 mM, KCl 4,5 mM y
NaN3 3 mM) con las mismas cantidades de plasma humano esterilizado por filtración recién obtenido y a continuación
se añadieron respectivamente a 500 µl de la mezcla hasta 20 µl de ácido láctico 0,5 molar y se mezcló, de forma que
para cada derivado de hemoglobina que se iba a investigar se dieron respectivamente valores de pH de un intervalo
entre aproximadamente 7,4 hasta 6,8. Tras una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente y centrifugación
de las muestras, se llevó a cabo la determinación del contenido en hemoglobina como medida de la hemoglobina no
precipitada, así como el pH correspondiente en el sobrenadante, así como el control óptico subjetivo de precipitaciones
no coloreadas de proteínas plasmáticas.
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Ejemplo de realización 1
Preparación de una hemoglobina porcina según la invención reticulada y molecularmente modificada a 4ºC según el
procedimiento general de preparación
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Hemoglobina porcina altamente pura, en una concentración de 330 g/l disuelta en una solución electrolítica acuosa
de la composición NaHCO3 50 mM y NaCl 100 mM se desoxigenó a 4ºC con agitación de la solución bajo nitrógeno
puro continuamente renovado sobre la solución. A continuación se añadieron 4 moles de ascorbato de sodio (como
solución 1 molar en agua) por mol de hemoglobina (monomérica) y se dejó reaccionar 6 horas. La solución se tituló
con ácido láctico 0,5 molar hasta un valor de pH de 7,1, se añadieron 1,1 moles de piridoxal-5’-fosfato por mol de
hemoglobina y se dejó reaccionar durante 16 horas. En este momento se ajustó un valor de pH de 7,8 con sosa cáustica
0,5 molar, se añadieron 1,1 moles de borohidruro de sodio (como solución 1 molar en sosa cáustica 0,01 molar) y se
dejó reaccionar durante una hora. Ahora se ajustó un valor de pH de 7,3 con ácido láctico 0,5 molar, a continuación
se añadieron 1,1 moles de 2,3-difosfoglicerato por mol de hemoglobina y tras 15 minutos de reacción, 8 moles de
glutardialdehído por mol de hemoglobina, disueltos en 1,8 litros de agua pura por litro de solución de hemoglobina
para la reticulación de la hemoglobina durante 5 minutos y se dejó reaccionar 2,5 horas. Tras la titulación con sosa
cáustica 0,5 molar hasta un valor de pH de 7,8 siguió una adición de 15 moles de borohidruro de sodio (como solución
1 molar en sosa cáustica 0,01 molar) por mol de hemoglobina durante 1 hora. Siguió una adición de 2 litros de agua por
litro de solución de hemoglobina original. El valor de pH ascendió entonces a 9,3, y siguió directamente una adición
de 4 moles de succinimidil-propionato de metoxi-polietilenglicol de 2000 g/mol de peso molecular durante 2 horas.
La atmósfera de nitrógeno sobre la solución se sustituyó por una atmósfera de oxígeno puro.
Después de 1 hora se separaron componentes insolubles mediante centrifugación (20000 g durante 15 minutos).
A continuación se llevó a cabo una cambio de la solución electrolítica mediante una cromatografía de exclusión
volumétrica (gel Sephadex G-25, Pharmacia, Alemania) a una solución electrolítica acuosa de la composición NaCl
125 mM, KCl 4,5 mM y NaCOH3 20 mM.
El rendimiento ascendió a 77%; el rendimiento para peso molecular mayor de 700000 g/mol es de 28%.
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La figura 1 muestra una representación de la distribución de las masas moleculares de los polímeros de hemoglobina obtenidos en forma de un cromatograma de exclusión volumétrica.
Las mediciones de las características de unión a oxígeno en condiciones fisiológicas (una temperatura de 37ºC,
una presión parcial de dióxido de carbono de 5,3 kPa y un valor de pH de 7,4) dieron para el producto un valor de p50
de 2,9 kPa y un valor de n50 de 1,95.
En la “prueba de precipitación”, la hemoglobina porcina reticulada no mostró en el intervalo de pH de 7,4 a 6,8
ninguna interacción con el plasma humano, en especial ninguna precipitación perceptible, ni de la hemoglobina ni de
las proteínas plasmáticas.
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Ejemplo de realización 2
Preparación de una hemoglobina porcina según la invención reticulada y molecularmente modificada a temperatura
ambiente según el procedimiento general de preparación
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Hemoglobina porcina altamente pura, en una concentración de 330 g/l disuelta en una solución electrolítica acuosa
de la composición NaHCO3 50 mM y NaCl 100 mM se desoxigenó a 22ºC con agitación de la solución bajo nitrógeno
puro continuamente renovado sobre la solución. A continuación se añadieron 4 moles de ascorbato de sodio (como
solución 1 molar en agua) por mol de hemoglobina (monomérica) y se dejó reaccionar 90 minutos. La solución se
tituló con ácido láctico 0,5 molar hasta un valor de pH de 7,1, se añadió 1,1 moles de piridoxal-5’-fosfato por mol de
hemoglobina y se dejó reaccionar durante 2 horas. En este momento se ajustó un valor de pH de 7,8 con sosa cáustica
0,5 molar, se añadieron1,5 moles de borohidruro de sodio (como solución 1 molar en sosa cáustica 0,01 molar) y se
dejó reaccionar durante una hora. Ahora se ajustó un valor de pH de 7,3 con ácido láctico 0,5 molar, a continuación
se añadieron 1,1 moles de 2,3-difosfoglicerato por mol de hemoglobina y tras 15 minutos de reacción, 9 moles de
glutardialdehído por mol de hemoglobina, disueltos en 1,8 litros de agua pura por litro de solución de hemoglobina
para la reticulación de la hemoglobina durante 5 minutos y se dejó reaccionar 1 hora. Tras la titulación con sosa
cáustica 0,5 molar hasta un valor de pH de 7,8 siguió una adición de 10 moles de borohidruro de sodio (como solución
1 molar en sosa cáustica 0,01 molar) por mol de hemoglobina durante 0,5 horas. El valor de pH ascendió entonces
a 8,7, y siguió directamente una adición de 8 moles de succinimidil-propionato de metoxi-polietilenglicol de 1000
g/mol de peso molecular durante 1 hora. La atmósfera de nitrógeno sobre la solución se sustituyó por una atmósfera
de oxígeno puro.
Después de 1 hora se separaron componentes insolubles mediante centrifugación (10 minutos a 20000 g). A continuación se llevó a cabo una cambio de la solución electrolítica mediante una cromatografía de exclusión volumétrica
(gel Sephadex G-25, Pharmacia, Alemania) a una solución electrolítica acuosa de la composición NaCl 125 mM, KCl
4,5 mM y NaCOH3 20 mM.
El rendimiento ascendió a 79%; el rendimiento para peso molecular mayor de 700000 g/mol ascendió a 28%.
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ES 2 275 712 T3
La figura 2 muestra una representación de la distribución de las masas moleculares de los polímeros de hemoglobina obtenidos en forma de un cromatograma de exclusión volumétrica.
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Las mediciones de las características de unión a oxígeno en condiciones fisiológicas (una temperatura de 37ºC,
una presión parcial de dióxido de carbono de 5,3 kPa y un valor de pH de 7,4) dieron para el producto un valor de p50
de 2,9 kPa y un valor de n50 de 1,96.
En la “prueba de precipitación”, la hemoglobina porcina reticulada no mostró en el intervalo de pH de 7,4 a 6,8
ninguna interacción con el plasma humano, en especial ninguna precipitación perceptible, ni de la hemoglobina ni de
las proteínas plasmáticas.
Ejemplo de realización 3
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Preparación de una hemoglobina humana según la invención reticulada y molecularmente modificada (a 4ºC) según
el procedimiento general de preparación
Hemoglobina humana altamente pura, en una concentración de 330 g/l disuelta en una solución electrolítica acuosa
de la composición NaHCO3 50 mM y NaCl 100 mM se desoxigenó a 4ºC con agitación de la solución bajo nitrógeno
puro continuamente renovado sobre la solución. A continuación se añadieron 4 moles de ascorbato de sodio (como
solución 1 molar en agua) por mol de hemoglobina (monomérica) y se dejó reaccionar 3 horas. La solución se tituló
con ácido láctico 0,5 molar hasta un valor de pH de 7,1, se añadió 1,1 moles de piridoxal-5’-fosfato por mol de
hemoglobina y se dejó reaccionar durante 16 horas. En este momento se ajustó un valor de pH de 7,8 con sosa cáustica
0,5 molar, se añadieron 1,5 moles de borohidruro de sodio (como solución 1 molar en sosa cáustica 0,01 molar) y se
dejó reaccionar durante una hora. Ahora se ajustó un valor de pH de 7,3 con ácido láctico 0,5 molar, a continuación
se añadieron 1,5 moles de 2,3-difosfoglicerato por mol de hemoglobina y tras 15 minutos de reacción, 9 moles de
glutardialdehído por mol de hemoglobina, disueltos en 1,8 litros de agua pura por litro de solución de hemoglobina
para la reticulación de la hemoglobina durante 5 minutos y se dejó reaccionar 2,5 horas. Tras la titulación con sosa
cáustica 0,5 molar hasta un valor de pH de 8,0 siguió una adición de 10 moles de borohidruro de sodio (como solución
1 molar en sosa cáustica 0,01 molar) por mol de hemoglobina durante 1 hora. Siguió una adición de 2 litros de agua por
litro de solución de hemoglobina original. El valor de pH ascendió entonces a 8,6, y siguió directamente una adición
de 4 moles de succinimidil-propionato de metoxi-polietilenglicol de 2000 g/mol de peso molecular durante 2 horas.
La atmósfera de nitrógeno sobre la solución se sustituyó por una atmósfera de oxígeno puro. Después de 1 hora se
separaron componentes insolubles mediante centrifugación (10 minutos a 20000 g). A continuación se llevó a cabo
una cambio de la solución electrolítica mediante una cromatografía de exclusión volumétrica (gel Sephadex G-25,
Pharmacia, Alemania) a una solución electrolítica acuosa de la composición NaCl 125 mM, KCl 4,5 mM y NaCOH3
20 mM.
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La figura 3 muestra una representación de la distribución de las masas moleculares de los polímeros de hemoglobina obtenidos en forma de un cromatograma de exclusión volumétrica. El rendimiento total ascendió a 75%; el
rendimiento para peso molecular mayor de 700000 g/mol ascendió a 17%.
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Las mediciones de las características de unión a oxígeno en condiciones fisiológicas (una temperatura de 37ºC,
una presión parcial de dióxido de carbono de 5,3 kPa y un valor de pH de 7,4) dieron para el producto un valor de p50
(como medida de una afinidad media por el oxígeno) de 2,8 kPa y un valor de n50 (una cooperatividad media aparente
de los sitios de unión de oxígeno) de 1,74.
En la “prueba de precipitación”, la hemoglobina porcina reticulada no mostró en el intervalo de pH fisiológica y
fisiopatológicamente interesante de 7,4 a 6,8 ninguna interacción con el plasma humano, en especial ninguna precipitación perceptible, ni de la hemoglobina ni de las proteínas plasmáticas.
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ES 2 275 712 T3
REIVINDICACIONES
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1. Procedimiento para la preparación de portadores de oxígeno artificiales de hemoglobina reticulada con propiedades funcionales mejoradas, caracterizado porque la hemoglobina
i) en primer lugar se desoxigena
ii) a continuación se hace reaccionar covalentemente con un efector de la unión de oxígeno químicamente reactivo;
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iii) después la solución se mezcla con un efector no reactivo químicamente; y después
iv) la hemoglobina se reticula entre sí covalentemente de forma estable con glutardialdehído, bajo muy intensa
dilución de la mezcla de reacción con adición simultánea del reticulante, a continuación la solución se diluye de nuevo
con agua, incrementándose el volumen total de la mezcla de reacción en un factor de 2 a 10 y después de ello,
v) se acopla covalentemente un poli(óxido de etileno),
vi) el producto obtenido se procesa de forma conocida.
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2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la hemoglobina es de origen porcino o humano.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque como material de partida sirve hemoglobina
porcina.
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4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque en la etapa iv) se añade glutardialdehído en una solución muy intensamente diluida cronometradamente y de esa forma el volumen de la mezcla de
reacción y la concentración de hemoglobina durante la reacción de polimerización varían simultáneamente de forma
inversa y a continuación se diluye la solución.
5. Procedimiento según la reivindicación 4, caracterizado porque en la etapa iv) se añade glutardialdehído en una
cantidad de 6 a 10 moles, en relación con la hemoglobina monomérica, disuelto en 1 a 2 litros de agua por litro de
solución de reacción original durante 3 a 15 minutos y reacciona 1 a 6 horas adicionales.
6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque a la solución que contiene hemoglobina antes de la reacción según la etapa ii) se le añaden 2 a 8 moles de ascorbato de sodio por mol de hemoglobina
no reticulada durante 0,5 a 6 horas.
7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque en la etapa ii) se une covalentemente como efector piridoxal-5’-fosfato en una proporción molar, en relación con la hemoglobina monomérica de 0,5
a 3, preferiblemente de 1 a 2,5 mol/mol durante 0,5 a 20 horas.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque en la etapa ii), así como en la etapa iv) tras la
unión covalente de piridoxal-5’-fosfato a la hemoglobina así como tras el acoplamiento covalente de la hemoglobina
con glutardialdehído se añade respectivamente borohidruro de sodio reductor.
9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, caracterizado porque en la etapa iii) se añade 2,3difosfoglicerato en una cantidad relativa de 0,5 a 6 moles en relación con la hemoglobina monomérica, y se comienza
de 5 a 50 minutos después la etapa iv).
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10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque en la etapa v) se acopla un éster
de polietilenglicol con un peso molecular de 500 a 3000 g/mol.
11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque el producto obtenido se separa
mediante un procedimiento de separación en una fracción de mayor peso molecular medio y un fracción de menor
peso molecular medio.
12. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque a partir de la porción de bajo peso molecular
de los polímeros se prepara un sustituto sanguíneo parenteral y a partir de la porción de mayor peso molecular de los
polímeros se prepara un aditivo sanguíneo parenteral.
13. Portador de oxígeno artificial, caracterizado porque se trata de una hemoglobina conjugada covalentemente
con un efector de la unión a oxígeno así como polimerizada con glutardialdehído y acoplada químicamente con un
derivado de poli(óxido de alquileno).
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14. Portador de oxígeno artificial según la reivindicación 13, caracterizado porque el portador presenta un valor
de n50 de 1,6 a 2,5 y un valor de p50 de 2,1 a 3,2 kPa.
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ES 2 275 712 T3
15. Uso de hemoglobina reticulada según la reivindicación 13 ó 14 para la preparación de un agente para la
aplicación por vía intravascular o biomédica como portador de oxígeno artificial en el organismo humano o animal
para el tratamiento de estados de falta de oxígeno.
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16. Uso según la reivindicación 15 para el tratamiento de una falta de oxígeno crónica en el ser humano.
17. Uso según la reivindicación 16, caracterizado porque el agente se usa en forma de una preparación farmacéutica como un reemplazo de la sangre (sustituto sanguíneo) o como un añadido a la sangre para aumentar la capacidad
de transporte de oxígeno (aditivo sanguíneo) o en órganos individuales.
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18. Uso ex vivo de hemoglobina reticulada según la reivindicación 13 ó 14 como añadido a una solución de
alimentación o en aplicaciones biotecnológicas.
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ES 2 275 712 T3
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