Análisis de mutaciones en el dominio Tirosina quinasa BCR

PROGRAMA DE EVALUACIÓN EXTERNA
DEL DESEMPEÑO PARA LABORATORIOS
DE CITOGENÉTICA CLÍNICA - EEDDCARIO
Seminario Taller de Citogenética y
Discusión de Resultados 2012-2013
del Programa EEDDCARIO
INAS
Septiembre 19 de 2013
Análisis de mutaciones en el
dominio Tirosina quinasa
BCR-ABL, en pacientes con
leucemia mieloide crónica
GONZALO VÁSQUEZ PALACIO
Biol. Esp. MSc
Profesor:
Unidad de Genética Médica
Facultad de Medicina
Universidad de Antioquia
Fecha: septiembre 19, 2013
Agenda
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Introducción
Leucemia Mieloide Crónica
Citogenética del cromosoma Ph+
Biología Molecular LMC
Era del Imatinib
Mutaciones DTK
Proyecto Mutaciones en pacientes Colombianos
Conclusiones
INTRODUCCIÓN
Búsquedas PUBMED por año
"FISH" and "Leukemia"
300
Cantidad de búsquedas
250
200
150
Series1, 139
100
50
0
1986198719881989199019911992199319941995199619971998199920002001200220032004200520062007200820092010201120122013
Búsquedas por año
"PCR" and "Leukemia"
600
Cantidad de búsquedas
500
400
300
Series1
200
100
0
Búsquedas por año
"Cytogenics" and "Leukemia"
250
Cantidad de búsquedas
200
150
Series1
100
50
0
INCIDENCIA Y MORTALIDAD
DE CÁNCER
INCIDENCIA Y MORTALIDAD
DE CÁNCER
Leucemia mieloide
crónica
lmc
La leucemia mieloide crónica (LMC) es un neoplasma
mieloproliferativo que se origina a partir de células
madre pluripotenciales anormales en médula ósea y
se asocia con la fusión génica BCR-ABL1 localizada en
el cromosoma Filadelfia Ph+.
Swerdlow SH, Campo E, Lee Harris N, Jaffe ES, Pileri SA, Stein H,
Thiele J, Vardiman JW. WHO classification of tumours of
haematopoietic and Lymphoid tissues. WHO. 2008.
http://www.hematologyatlas.com/leukemias/45.jpg
Hematopoyesis
Modelo de progresión LMC
CITOGENÉTICA
P.NOWELL, D HUNGERFORD - JANET D. ROWELY
1960 Peter Nowell y David Hungerford ( Ph )
1973 Janet D rowely
t(9;22)(q34;q11)
Biología
molecular
Métodos de diagnóstico Ph+
J Cancer Res Clin Oncol (2011) 137:1329–1336.
gen de fusión BCR-ABL1
Expresa una
oncoproteína de fusión
con aumento de la
actividad tirosinaquinasa (TK).
Gen de fusión BCR-ABL1 puede incluir
el exón 14 del gen BCR
Los puntos de quiebre genómicos pueden
variar entre pacientes pero, siempre se
producen uno de dos transcriptos primarios.
(b2a2
)
(b3a2)
Era del
imatinib
Imatinib
Louise N. Johnson.ord, Oxford. Proteinkinaseinhibitors: contributions from
structure to clinical compounds. Quarterly Reviews of Biophysics 42, 1 (2009), pp. 1–40.
Gambacorti-P.C, Gunby. RH, Piazza R., Galietta A, Rostagno R, and Scapozza L. Molecular mechanisms of resistance to
imatinib in Philadelphia-chromosome-positive leukaemias. THE LANCET Oncology Vol 4 February 2003
Mecanismo de acción del Imatinib
DRUKER BLOOD, 15 DECEMBER 2008 VOLUME 112, NUMBER 13
Mutaciones
dtk
CATEGORIA DE LAS MUTACIONES
Las mutaciones se pueden clasificar en 4 categorías:
Las que impiden la unión de Imatinb al sitio Catalítico
 Ocurren dentro del P-Loop
Ocurren dentro el sitio activo del P-Loop e Impiden la
unión del Imatinib a la Forma Inactiva.
Ocurren dentro dominio catalítico e impiden la
fosforilación.
Modelo de progresión y resistencia
LMC
Curso Clínico LMC
Células madre
hematopoyéticas
normales
1era Mutación Eventos mutagénicos
Expansión clonal de la población de progenitores pre-malignos (Ph negativo/BCR/ABL:
negativo)
2da Mutación. Origen BCR/ABL
en clon Stem cell premaligno
Prefase de LMC. Ph +, BCR/ABL: positivo. Conteos celulares sanguíneos normales,
clínicamente silenciosos
Eventos oncogénicos adicionales
en la transformación del clon Stem
Cell.
Fase crónica de LMC. BCR/ABL como el blanco y el factor oncogénico más importante
que contribuye a la supervivencia de las células leucémicas.
Curso Clínico LMC
Células madre
hematopoyéticas
normales
Futuras mutaciones oncogénicas
Progresión
Fase acelerada de LMC. BCR/ABL permanece como el factor más importante pero
adicionalmente otras moléculas oncogénicas participan en el crecimiento de las
células leucémicas
Futuras mutaciones oncogénicas
que permiten la maduración
proliferación y Progresión
Fase blástica de LMC. BCR/ABL permanece como un co-factor, pero otros mecanismos
conducen a la progresión a síndrome similar a LMA con abundante proliferación
celular y detenimiento en la maduración celular
Seguimiento molecular BCR-ABL (RT-PCR)
Incremento de la probabilidad de mutaciones en el
gen de fusión BCR-ABL1
N
N
N
M
M
E453G
Standardised
baseline
8
1
0.8
2
0.08
3
.0008
Imatinib 400
2.1- PTO. RES.
Estudio STI571
Pre 3IRIS
9
12 15 18 21 24 27 30 33 36 39
Meses desde el inicio de tratamiento con Imatinib
Hughes, Branford et al, 2006
4
Reducción Log
BCR-ABL1/BCR%
80
N
Mapa de mutaciones:
4 regiones críticas de TKD
GUÍAS DE SEGUIMIENTO LMC
FASE CRÓNICA
Sangre periférica
Aspirado y biopsia M.O
Morfológica
% de blastos
% de basófilos
Citogenética
t(9;22)(q34;q11)
UGM
FISH
nuc ish(ABL1,BCR)x3(ABL1 con
BCRx2)
UGM
Biología molecular
(QPCR)
Ejemplo de amplificación y curva estándar para
la cuantificación del transcripto p210.
UGM.
El seguimiento inicial requerimiento para una
respuesta óptima
El seguimiento a los 12 meses
El seguimiento al los 18 meses
DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL
DOMINIO TIROSINA QUINASA DE
BCR-ABL EN PACIENTES COLOMBIANOS
CON LEUCEMIA MIELOIDE CRÓNICA (LMC),
RESISTENTES AL IMATINIB
GONZALO VÁSQUEZ PALACIO
Biol. Esp. MSc
Coinvestigadores
Carlos Muskus PhD
José domingo Torres MD Hematologo
DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL DOMINIO TIROSINA QUINASA DE
Proyecto
BCR-ABL EN PACIENTES COLOMBIANOS CON LEUCEMIA MIELOIDE
CRÓNICA (LMC), RESISTENTES AL IMATINIB
HIPÓTESIS
La presencia de mutaciones en el dominio Tirosina QUINASA del
gen fusión BCR-ABL confieren resistencia al tratamiento con
Imatinib en pacientes colombianos con LMC.
OBJETIVO GENERAL
Detectar las mutaciones en la región génica que codifica para
el dominio Tirosina Quinasa del gen de fusión BCR-ABL, y que se
asocian con falla en la respuesta al tratamiento con Imatinib
en pacientes colombianos con LMC
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Identificar mutaciones nuevas o informadas, mediante
secuenciamiento de la región génica ABL del gen fusión BCRABL, en pacientes que no responden a la terapia con Imatinib.
Metodología
•
Población : 50 pacientes LMC en TTO
con imatinib y resistentes.
•
Secuencia de 869-bp región de BCR –
ABL que corresponde a el sitio de unión
al ATP y horquilla de activación del
dominio TK
Punto de mutación en el sitio de unión al
ATP del dominio kinasa Abl confiere
resistencia a STI-57 en pacientes con
recaída.
PRIMER PCR ANIDADA
Metodología
Pacientes con LMC.
TTO Imatinib –
Resistencia
Consentimiento
Informado
CLC Main Workbench
MUTACIONES EN PACIENTES
COLOMBIANOS
Proyect
o
E255K
Sec. Ref
PM11
Mutación encontrada en 2
pacientes (PM11, PM40)
H396P
Sec. Ref
PM34
Mutación encontrada en
la muestra PM34
ALGUNAS MUTACIONES INFORMADAS
DETECCIÓN DE MUTACIONES EN EL DOMINIO TIROSINA QUINASA DE
BCR-ABL EN PACIENTES COLOMBIANOS CON LEUCEMIA MIELOIDE
CRÓNICA (LMC), RESISTENTES AL IMATINIB
Altamente Resistentes
Resistentes
Moderadamente resistentes
Sensibles
Brandford et al, 2009
conclusiones
CONCLUSIONES
1. Las mutaciones Y253F/H, E255V,H396P/R y T315I
confieren resistencia a inhibidores TKS.
2. La detección temprana de mutaciones de mutaciones
durante el tratamiento, puede ayudar a la
estratificación de los pacientes para la toma de
desiciones.
3. Los laboratorios de diagnóstico para malignidades
hematológicas deben implemtar las técnicas:
Citogenética, FISH y biología molecular.
4. Las publicaciones en este campo tendrán cada día un
mayor impacato en la producción científica.
Propósito
Agradecimientos
• Compañeros de la
Unidad de Genética
Médica.
• Doctores: Carlos
Enrique Muskus.
• José Domingo Torres.
• Gentica Lab
Novartis
• Pacientes
• Hospitales