técnicas de extracción y purificación de proteínas

METODOLOGÍA DE EXTRACCIÓN Y PURIFICACIÓN DE INHIBIDORES DE
PROTEASAS EN Opuntia streptacantha
Estudiante: Jannet Alejandra Vargas Sánchez
Instituto Tecnológico de Roque
[email protected]
Asesor: Dr. Alejandro Blanco Labra
CINVESTAV – IPN Campus Guanajuato
RESUMEN
Existen ciertas moléculas de proteínas llamadas inhibidores de proteasas (IP), las
cuales son capaces de impedir la actividad proteolítica de las enzimas; el conjunto
de técnicas que aquí se presentan, muestran de manera práctica las bases para
lograr la extracción y purificación de los IP utilizando tejido de Opuntia
streptacantha, y así continuar su estudio.
INTRODUCCIÓN
La proteolisis consiste en la degradación de proteínas en forma parcial o total, la
cuál puede llevarse a cabo por vía química o enzimática (proteasas). La proteolisis
enzimática puede ser impedida o regulada por otras proteínas llamadas
inhibidores de proteasas (IP), que se unen a la enzima, formando el complejo
enzima-inhibidor.
Los IP actualmente han adquirido gran importancia por su aplicación en procesos
biológicos y biotecnológicos. Por lo anterior, es que el desarrollo de las
metodologías y técnicas de extracción y purificación son fundamentales en el
inicio de cualquier trabajo de investigación con IP. En el presente trabajo se
desarrollaron las técnicas en la extracción y purificación de IP presentes en nopal
(Opuntia streptacantha).
OBJETIVO
Adquirir los conocimientos teóricos para poner en práctica las técnicas de
extracción y purificación de IP utilizando tejido de Opuntia streptacantha.
METODOLOGÍA
1. Extracción de proteínas
El primer paso consiste en obtener un extracto crudo del tejido del cual se
pretende aislar la proteína de interés. En el extracto se encuentran mezclados
todos los componentes celulares, como proteínas, lípidos, carbohidratos, sales,
metabolitos secundarios, etc. El proceso consiste en la extracción acuosa de
algunos componentes celulares. Se realiza dependiendo del tejido a trabajar, del
cladodio se extrae el jugo por trituración y por molienda se obtiene harina de la
semilla. Ambas muestras son sometidas a agitación por un tiempo determinado a
baja temperatura; al terminar esta etapa la muestra se centrifuga y se recupera el
sobrenadante con la finalidad de desechar el precipitado que contiene algunas
impurezas, y descartar restos de tejido.
2. Precipitación con Sulfato de Amonio
Al obtener un extracto crudo se debe de tener en cuenta que nuestras proteínas
de interés se encuentran en solución acuosa a una baja salinidad. Al incrementar
la concentración de sales en la solución incorporando lentamente sulfato de
amonio, (entre 20-95% de saturación), la proteína comienza a ceder intercambios
iónicos con los iones amonio y sulfato, y sustituye los sitios de intercambio que
compartía con el agua y pasado un tiempo de esta manera, la proteína disminuye
su solubilidad y “precipita”.
Por lo general las moléculas de mayor peso molecular se precipitan primero [1].
Esta nueva solución se centrifuga y el precipitado que contiene las proteínas se
recupera.
El éxito de la precipitación depende del tiempo de contacto y de la concentración
de la solución [1].
3. Redisolución y Diálisis
El siguiente paso en la purificación de proteínas consiste en tomar una alícuota del
precipitado y dializar mediante el flujo selectivo de materia de una zona de mayor
concentración a otra de menor concentración con ayuda de presión osmótica, es
decir, separando dos disoluciones de concentraciones diferentes por una
membrana semipermeable (una membrana que permite el paso selectivo de las
moléculas del disolvente, pero impide el paso de compuestos de mayor peso
molecular).
De ésta manera se puede concentrar un producto o separarlo de una mezcla de
moléculas.1 Es necesario realizar éste paso a baja temperatura y en agitación
constante, ya que la diálisis es un proceso molecular que depende exclusivamente
de los movimientos aleatorios de las moléculas individuales.
4. Calentamiento
Este tipo de IP, posee la propiedad de ser altamente resistentes a la temperatura.
Por lo tanto, al aplicar una temperatura alta, la mayoría de las proteínas se
desnaturalizan y disminuyen, permitiendo purificar el IP de interés. Además, se
disminuye la proteolisis, ya que la estabilidad de las enzimas disminuye por
inactivación térmica [1].
5. Liofilización
Este paso consiste en la eliminación del solvente mediante el proceso de
sublimación, en el cuál, la muestra es congelada y sometida a una cámara de alto
vacío para favorecer que los solventes pasen del estado sólido a vapor, lo que
permite la concentración de la muestra (liofilizado), eliminando el solvente.
.
6. Cuantificación de proteína
El contenido proteico dependiendo de la naturaleza de nuestra molécula puede ser
determinado mediante el “Método de Bradford” el cual se basa en la unión del
colorante azul de Comassie G250, a los residuos Arginil y lisil (de aminoácidos
arginina y lisina respectivamente) de la proteína [2]. Esto es usualmente realizado
para medir la absorbancia de la solución en el espectrofotómetro a 595 nm. El
contenido proteico es una función de la concentración de la proteína, y estará
dado en unidades de µg de proteína por mg de liofilizado.
7. Electroforesis de proteínas en gel de poliacrilamida
Es un método analítico que permite la migración de proteínas a través de un
soporte (poliacrilamida) sujeto a un campo eléctrico, su movilidad estará dada en
función principalmente de su peso molecular. La separación de mezclas de
proteínas permite analizar la pureza de la solución en estudio.
8. Determinación de actividad inhibitoria de proteasas utilizando geles de
poliacrilamida.
Realizada la electroforesis, el gel con las bandas de proteína se sumerge en una
solución amortiguadora compuesta por Tris Hcl- CaCl2 con pH 8 y la proteasa
Tripsina a una concentración de 1 mg/ml. El gel sumergido se mantiene en
incubación a 30oC por 2 horas, después se enjuaga con agua común y se somete
a fijación y tinción.
Las proteínas que no son degradadas por la tripsina pueden ser posibles
inhibidores de proteasas.
9. Determinación de actividad Inhibitoria de proteasas
Una proteasa es una enzima capaz de cortar un enlace peptídico que constituye la
base estructural de las proteínas; existen varias técnicas para medir la actividad
proteolítica. Una de ellas es una técnica espectrofotométrica la cuál emplea un
sustrato sintético que permite monitorear la actividad de proteasa con una alta
sensibilidad. La técnica para determinar actividad inhibitoria de proteasas se basa
en establecer un blanco de actividad proteolítica, usando un sustrato sintético
llamado BAEE (N-benzoil-L-arginina etil ester) y leyendo su hidrólisis a 253 nm. El
blanco es usado como referencia. La actividad inhibitoria en sí, consiste en
incubar la proteasa blanco con la muestra con
terminada la reacción se agrega el sustrato
espectrofotómetro, la absorbancia obtenida se
blanco de actividad proteolítica y la alícuota de
unidades de actividad inhibitoria.
inhibidor de proteasas, una vez
y se hace una lectura en el
relaciona a la absorbancia del
la muestra, para así obtener las
RESULTADOS
Actividad inhibitoria de proteasas
Alícuota de enzima: 18.5 µl
Abs 253 nm: 0.0518 act
Act/ml= Abs 253nm/0.01* alícuota (ml)
= .0518/.000185= 280 Act/ml
Cuantificación de proteína
1.5 mg de liofilizado
3 repeticiones Abs 595 nm
a) 3.6067 µg
b) 4.1990 µg
media: 3.7934 µg
c) 3.5747 µg
1.5 mg
3.7934 µg
cálculos
1.0 mg
x
X= 2.528 µg de proteína por mg
Electroforesis de proteínas en geles de poliacrilamida de semilla de O.
streptacantha.
1
2
3
Carriles:
1: Marcadores
de peso
molecular
2: Extracto
proteico
precipitado
95% con
(NH4)2SO4
3: Extracto proteico precipitado al 95% con sulfato de amonio y calentado a 95°C
por 10 minutos (Paso de purificación de inhibidores de proteasas).
zimograma
1
2 3
Inhibidor de
proteasa
CONCLUSIONES Y DISCUSIÓN
Gracias a la biotecnología de plantas, hoy en día es posible purificar y caracterizar
una molécula específica (inhibidor de proteasas), lo cuál hace posible su estudio y
abre camino para descubrir los beneficios potenciales que pueden brindar en un
futuro.
NOTAS
[1] Ver Quintero R. (1981)
[2] Consúltese Walter J, (2002)
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Quintero R, Ingeniería Bioquímica Teoría y Aplicaciones (1981), Alambra
Mexicana, México.
2. Walker J, The Protein Protocols Hand Book (2002), Humana Press. 2da
Ed. New Jersey.