Olea europaea L

OLI-54
ESTUDIO MOLECULAR DE LA FLORACIÓN DEL OLIVO (OLEA
EUROPAEA): CLONACIÓN DE LOS GENES LEAFY Y APETALA,
CUANTIFICACIÓN DE SU EXPRESIÓN GÉNICA A LO LARGO DE
DOS AÑOS MEDIANTE PCR A TIEMPO REAL (QRT–PCR) Y
ANÁLISIS DEL POLIMORFISMO ENTRE CULTIVARES
CARMEN GARCÍA–LIMONES1, YOSELÍN BENÍTEZ1,2, PILAR HERNÁNDEZ3, ANTONIO MARTÍN3,
CARMEN DEL RÍO4, JUAN MANUEL CABALLERO4, HAVA F RAPOPORT3, JOSÉ LUIS
CABALLERO1, JUAN MUÑOZ–BLANCO1, GABRIEL DORADO1*
1
Dep. Bioquímica y Biología Molecular, Campus Rabanales C6–1–E17, 14071 Córdoba; 2Delbruck
Laboratory, Cold Spring Harbor Laboratory, One Bungtown Road, ZIP 11724, New York (USA),
3
Instituto de Agricultura Sostenible (IAS), Consejo Superior de Investigaciones Científicas (CSIC),
Alameda del Obispo s/n, 14071 Córdoba; 4Instituto de Investigación y Formación Agraria, Pesquera,
Alimentaria y de la Producción Ecológica (IFAPA), Alameda del Obispo s/n, 14071 Córdoba
*Autor para correspondencia: Gabriel Dorado, Dep. Bioquímica y Biología Molecular, Campus
Rabanales C6–1–E17, 14071 Córdoba (Spain); eMail <[email protected]>; Tel: +34 957 218689;
Fax: +34 957 218592
FORO DEL OLIVAR Y MEDIO AMBIENTE
RESUMEN
El periodo juvenil del olivo (Olea europaea) es prolongado (de 2 a 30 años, según condiciones) y está
caracterizado por la incapacidad reproductora, dificultando la mejora en este cultivo. La reducción de
la fase juvenil supondría un gran beneficio para la mejora del olivo, pero no se conocen los procesos
moleculares específicos que la gobiernan. El objetivo del presente trabajo es el uso de metodologías
moleculares para obtener información sobre la juvenilidad y floración del olivo. Además de las
técnicas clásicas de biología molecular, se ha empleado la metodología de Amplificación de cDNA
(RACE; del ingles, “Rapid Amplification of cDNA Ends”), así como la cuantificación de la expresión
génica mediante PCR en tiempo real (QRT–PCR; del ingles, “Quantitative Real–Time PCR”). De este
modo se han clonado y secuenciado los cDNAs de los genes leafy y apetala del olivo. Ello ha
permitido estudiar el patrón de expresión espacio–temporal de estos genes a lo largo de dos años.
Las proteínas deducidas muestran homología con proteínas como LEAFY y MADS–box de otras
plantas, confirmando su identidad. La expresión de ambos genes es necesaria para que se produzca
el desarrollo floral. Generalmente se encuentran mayores niveles (sobre todo de leafy) en las yemas
de los ramos no cargados (que se supone se diferenciarán en flores) que en las yemas de los ramos
cargados. Cuando las yemas se han diferenciado a flores, sólo es necesaria la expresión de apetala y
no de leafy, lo cual es lógico ya que apetala es responsable de la identidad de los órganos florales en
otras plantas. Por otro lado, hemos encontrado polimorfismo genético en los genes leafy y apétala de
diferentes cultivares de olivo.
INTRODUCCIÓN Y OBJETIVOS
El olivo (Olea europaea L.) es un árbol polimórfico, que presenta fases juvenil y adulta. El periodo
juvenil es prolongado (de 2 a 30 años, según condiciones) y está caracterizado por la incapacidad
reproductora. Cuando las semillas se establecen directamente en el campo, en condiciones normales
de cultivo, la fase juvenil puede prolongarse más de 15 años. Esto supone un problema a la hora de
abordar trabajos de mejora en este cultivo. Aunque la reducción de la fase juvenil supondría un gran
beneficio para la mejora en la agricultura, no se conocen con exactitud los procesos específicos que
gobiernan el periodo juvenil en árboles cultivados.
Una vez alcanzada la fase adulta, las plantas presentan la capacidad de reproducirse. Sin embargo,
la mayoría de ellas requieren además un estímulo medioambiental apropiado, para la transición de un
estado vegetativo a reproductor. El estímulo necesario para inducir la floración en árboles de cultivo
ha sido investigado, evaluando la respuesta al tratamiento con fitohormonas, condiciones del cultivo
(fotoperiodo, nutrición, temperatura, etc) e injertos (Lynn et al., 2004). Sin embargo, la información
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acerca de los mecanismos genéticos que gobiernan la transición del estado vegetativo al reproductivo
en árboles de cultivo es relativamente limitada (Lynn et al., 2004).
En plantas modelo como Arabidopsis han sido identificados numerosos genes involucrados en la
transición de fase vegetativa a reproductiva y en el desarrollo del meristemo floral. Entre ellos, leafy
(LFY) y apetala (AP1) forman parte de los denominados genes de identidad del meristemo floral
(Mandel y Yanofsky, 1995; Pelaz et al., 2001). Mutaciones en pérdida de función en LFY y AP1 en
Arabidopsis resultan en la sustitución de flores por tallos o estructuras como tallos, mientras que la
sobreexpresión de dichos genes genera una floración temprana y una transformación de tallos a
flores (Mandel y Yanofsky, 1995; Blazquez et al., 1997). En numerosas especies vegetales se han
aislado genes homólogos de LFY y AP1 que generan fenotipos similares cuando se sobreexpresan
en Arabidopsis (Coen et al., 1990; Berbel et al., 2001; Carmona et al., 2002; Wada et al., 2002;
Calonje et al., 2004), indicando una conservación de la función de estos genes entre especies.
La floración en el olivo ocurre en yemas axilares de brotes con crecimiento vegetativo del año previo
a la floración. La escasa información sobre los fenómenos de la floración y la alternancia en el olivo
(vecería) ha llevado a muchos autores a estudiar la yema por ser el órgano de diferenciación
(Rapoport, 2004). En este cultivo no se distingue fácilmente entre una yema vegetativa o una
reproductora hasta su brotación (pasado el periodo invernal), aunque se han demostrado ciertas
diferencias histoquímicas o morfogenéticas antes del invierno. El estudio de la expresión de leafy y
apetala durante el desarrollo de la yema en olivo puede ayudar a esclarecer los mecanismos
involucrados en la diferenciación de las mismas a vegetativas o reproductoras.
Por otro lado, como se ha indicado, el olivo presenta un prolongado periodo juvenil, lo que supone un
problema a la hora de realizar trabajos de mejora en este cultivo. Aunque actualmente existen
procedimientos que permiten el acortamiento de la fase juvenil a unos dos años, siguen siendo muy
costosos. En este sentido el aislamiento de leafy y apetala y su posterior clonación en olivo, pueden
representar un método útil que permita acortar la fase juvenil, además de solventar el problema de la
alternancia en este cultivo.
El objetivo del presente trabajo es el uso de metodologías moleculares para obtener información
sobre los aspectos anteriormente mencionados. Además de las técnicas clásicas de biología
molecular se ha empleado la metodología de Amplificación de cDNA (RACE; del ingles, “Rapid
Amplification of cDNA Ends”), así como la cuantificación de la expresión génica mediante PCR en
tiempo real (QRT–PCR o QRT; del ingles, “Quantitative Real–Time PCR”). De este modo se han
clonado y secuenciado los cDNAs de los genes leafy y apetala del olivo. Ello ha permitido estudiar el
patrón de expresión espacio–temporal de estos genes a lo largo de dos años, mediante la
metodología QRT–PCR.
METODOLOGÍA DE TRABAJO EMPLEADA
Se han utilizado árboles de olivo de la variedad ‘Picual’ ubicados en el campo de experimentación del
“Instituto de Investigación y Formación Agraria, Pesquera, Alimentaria y de la Producción Ecológica”
(IFAPA; antiguo CIFA) de Córdoba. En los árboles, se seleccionaron ramos no cargados y ramos
cargados, de los que se tomaron muestras de yemas durante dos años. La yemas axilares fueron
aisladas de la parte distal, intermedia y basal (en el caso de los brotes de ramos no cargados) y de la
parte distal (desde el fruto hasta el ápice) en los ramos cargados. También se tomaron muestras de
yemas apicales y de chupones como controles, debido a la baja o nula probabilidad de floración de
las mismas, respectivamente. Durante los meses de marzo y abril (una vez producida la floración) se
tomaron muestras de flores y de yemas retrasadas (que no habían florecido), de ramos que
presentaban crecimiento vegetativo y de ramos con crecimiento floral.
Los cDNAs de los genes leafy y apetala han sido aislados a parir de RNA total obtenido de yemas de
olivo mediante la estrategia RACE, usando el sistema “SMART RACE cDNA Amplification Kit” (BD
Biosciences/ Clontech).
Los estudios de expresión de los genes leafy y apetala se han realizado mediante QRT–PCR a
tiempo real en un termociclador iCycler (Bio–Rad). Para ello se aislaron muestras de RNA de los
diferentes tipos de yemas utilizando el sistema “Total RNA Mini Kit” (BioRad), siguiendo las
instrucciones de la casa comercial. Las muestras de RNA fueron retrotranscritas utilizando cebadores
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reversos específico que hemos diseñado. Como gen control interno (“housekeeping”) para normalizar
la expresión de los genes diana se utilizó un interespaciador 16S–23S del rRNA de olivo.
INNOVACIÓN Y RELEVANCIA DEL TRABAJO
El presente trabajo representa el primer estudio moleculares sobre la floración del olivo. Dicha
información es esencial no sólo para conocer mejor la biología de la floración, sino también para
poder diseñar una estrategia eficiente para reducir el periodo juvenil del olivo. Éste es un fenómeno
que tiene un elevado costo económico, ya que hay que esperar al menos dos años –y típicamente
seis años– para obtener flores a partir de una semilla. Los conocimientos sobre la biología molecular
de la floración pueden ser muy útiles para acelerar, racionalizar y optimizar los programas de mejora
genética del olivo. A tal fin, se han aplicado por primera vez en el olivo dos técnicas moleculares
poderosas y complementarias (RACE y QRT–PCR) para clonar y cuantificar la expresión génica de
los genes leafy y apetala. Ello ha permitido determinar el patrón de expresión de estos genes en
diferentes yemas vegetativas y florales a lo largo de dos años. Estos estudios han demostrado la
importancia de dichos genes como marcadores de floración y en futuros proyectos de mejora
genética tradicional o de ingeniería genética de Olea europaea. La cuantificación mediante QRT–PCR
de los niveles de expresión de estos genes “marcadores” de floración clonados en este estudio
permite pronosticar a priori el comportamiento de yemas y variedades de olivo respecto a la floración,
en función de los niveles basales o superiores de expresión que posean. Ello representa una valiosa
herramienta para el mejorador de esta especie, ya que hasta la fecha no había sido posible —
evitando así los problemas de tiempo requerido y costo que ello representa— en dichas evaluaciones.
Adicionalmente, también posibilita la utilización de tales genes inducibles para caracterizar las
variedades en estadíos muy tempranos. Por otro lado, se pueden utilizar los genes descritos para
evaluar y cuantificar la capacidad inductora de cualquier agente o tratamiento de floración, así como
para determinar las dosis y tiempos óptimos de aplicación.
RESULTADOS, DISCUSIÓN Y CONCLUSIONES
Los cDNAs de los genes leafy y apetala de olivo han sido aislados mediante la técnica RACE a partir
de RNA de yemas de olivo. Las proteínas deducidas de las secuencia de cDNA mostraron una
elevada homología con proteínas tipo LEAFY y MADS–box de otros organismos, confirmando su
identidad.
El análisis de los niveles de expresión de leafy y apetala en los distintos tipos de yemas durante dos
años reveló diferencias en los patrones de expresión de dichos genes.
En el caso de leafy, los cambios más significativos en los niveles de mRNA se encontraron en las
muestras de enero, del 2 de febrero y de abril. En los meses de enero y febrero, los mayores niveles
de expresión de leafy aparecieron en las yemas de los ramos no cargados (RNC), que presuntamente
se diferencian posteriormente en flores (RNC distal en las muestras de enero y RNC distal, intermedio
y basal en las del 2 de febrero) que en las yemas de los ramos cargados (RC). Una vez que se
produjo la floración (marzo), se encontraron niveles elevados de leafy en yemas retrasadas de ramos
de dos tipos: con desarrollo vegetativo (retrasadas de RV) y con desarrollo floral (retrasadas de RF),
encontrándose niveles bajos de expresión tanto en las flores de marzo como las de abril. Este patrón
diferencial de expresión de leafy entre los distintos tipos de yemas sugiere la necesidad de su
expresión génica para la transición de estado vegetativo a reproductivo. Una vez que se ha
desarrollado la inflorescencia, sólo sigue expresándose en las yemas retrasadas que no han llegado
a diferenciarse a flores.
El comportamiento de apetala es algo diferente. En este caso no se encuentra ningún cambio
significativo en la expresión durante los meses noviembre–enero. Sin embargo, en febrero, al igual
que leafy, se encontraron mayores niveles de expresión de apetala en las yemas de ramos no
cargados (RNC basales) que en las de ramos cargados. Los mayores niveles de expresión de apetala
se mostraron en flores tanto de marzo como de abril, lo cual está de acuerdo con su papel en el
desarrollo de los distintos órganos florales encontrado en otras plantas.
Por otro lado se han amplificado y secuenciado secuencias genómicas de leafy y apetala de
diferentes cultivares de olivo (‘Arbequina’, ‘Dolceagoia’, ‘Domat’, ‘Frantoio’, ‘Gordal de Sevilla’,
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‘Hojiblanca’, ‘Leccino’, ‘Lechín de Sevilla’, ‘Manzanilla de Sevilla’ y ‘Picual’), habiéndose encontrado
polimorfismos de un solo nucleótido (SNPs; del inglés “Single Nucleotide Polymorphisms”).
Las principales conclusiones de este trabajo son:
1. Se han aislado los cDNAs de los genes leafy y apetala de olivo. Las proteínas deducidas
muestran homología con proteínas como LEAFY y MADS–box de otras plantas, confirmando su
identidad.
2. La expresión de ambos genes es necesaria para que se produzca el desarrollo floral.
Generalmente se encuentran mayores niveles (sobre todo de leafy) en las yemas de los ramos no
cargados (que se supone se diferenciarán en flores), que en las yemas de los ramos cargados.
3. Cuando las yemas se han diferenciado a flores, sólo es necesaria la expresión de apetala y no de
leafy, lo cual es lógico ya que apetala es responsable de la identidad de los órganos florales en
otras plantas.
4. Existe polimorfismo genético en los genes leafy y apétala de diferentes cultivares de olivo.
REFERENCIAS
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Berbel et al. (2001). Plant Journal, 25: 441–451.
Blazquez et al. (1997). Development, 124: 3835–3844.
Calonje et al. (2004). Plant Physiology, 135: 1491–1501.
Carmona et al. (2002). Plant Physiology, 130: 68–77.
Coen et al. (1990). Cell, 63: 1311–1322.
Lynn et al. (2004). Plant Physiology, 135: 1540–1551.
Mandel y Yanofsky (1995). Nature, 377: 522–524.
Rapoport (2004). En: Barranco et al. (eds). “El Cultivo del Olivo”. Mundi–Prensa (Madrid).
Wada et al. (2002). Plant Molecular Biology, 49: 567–577.
AGRADECIMIENTOS
Financiado por Proyecto CAO00–018–C7–3 (Consejerías de Agricultura y Pesca/Innovación Ciencia y
Empresa) y Grupo PAI CTS–413, Junta de Andalucía.
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