Separación de mezclas por cromatografía

NOMBRE DE LA PRACTICA 4
Separación de mezclas por cromatografía
Práctica 2a. SEPARACIÓN DE MEZCLAS HOMOGÉNEAS
POR CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA
1. RECOMENDACIONES PARA ANTES DE INICIAR LAS PRÁCTICAS
1. Investigar los principios de la cromatografía.
2. Investigar como se calcula el Rf.
3. Para preparar el extracto de jamaica, un día antes de la practica
deja remojar un puño de flores de jamaica en aproximadamente
50 ml de agua. el líquido resultante es el que vas a utilizar para la
práctica de separación de colorantes.
4. Estudiar y revisar los conceptos de estados de agregación de la
materia, procesos de interconversión entre los estados sólidolíquido-gas y los procesos de separación de mezclas. Se sugiere
revisar estos conceptos en la siguiente bibliografía:
•
•
•
•
Química “La Ciencia Central”, BROWN, LEMAY y BURSTEN
(1998) (7ª. Ed.), México, Edit. Prentice Hall
“Química General”, PETRUCCI, HARWOOD Y HERRING ,
(2002), (8va. Ed.), Prentice Hall.
“Química” y reactividad química, KOTZ, TREICHEL,
WEAVER (2005), (6va. Ed), Thomson.
“Química” , CHANG (2002), (7va. Ed), Mc Graw Hill.
2. INTRODUCCIÓN Y ANTECEDENTES DE CONOCIMIENTO
Cromatografía en Capa Fina (CCF)
Introducción
La cromatografía en capa fina se basa en la preparación de una capa,
uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro
soporte. Los requisitos esenciales son, pues, un adsorbente, placas de
vidrio, un dispositivo que mantenga las placas durante la extensión, otro
para aplicar la capa de adsorbente, y una cámara en la que se
desarrollen las placas cubiertas. Es preciso también poder guardar con
facilidad las placas preparadas y una estufa para activarlas.
La fase móvil es líquida y la fase estacionaria consiste en un sólido. La
fase estacionaria será un componente polar y el eluyente será por lo
general menos polar que la fase estacionaria, de forma que los
componentes que se desplacen con mayor velocidad serán los menos
polares.
Polaridad de los compuestos orgánicos en orden creciente:
hidrocarburos < olefinas < fluor < cloro < nitro < aldehído
aldehído < ester < alcohol < cetonas < aminas < ácidos < amidas
Ventajas de la cromatografía en capa fina
La cromatografía en capa fina presenta una serie de ventajas frente a
otros métodos cromatográficos (en columna, en papel, en fase gaseosa,
...) ya que el utillaje que precisa es más simple. El tiempo que se
necesita para conseguir las separaciones es mucho menor y la
separación es generalmente mejor. Pueden usarse reveladores
corrosivos, que sobre papel destruirían el cromatograma. El método es
simple y los resultados son fácilmente reproducibles, lo que hace que
sea un método adecuado para fines analíticos.
Adsorbentes
Al realizar la elección del adsorbente se debe tener en cuenta el tamaño
de las partículas del adsorbente, cuanto más finamente dividido esté
mayor será su adhesión al soporte, aunque también se le puede añadir
un adherente (yeso,...). Algunos de los adsorventes más utilizados son:
•
•
•
Celulosa
Almidón
Azucares
•
•
•
•
Gel de sílice (silicagel)
Óxido de aluminio (alúmina)
Carbón activo (carbón en polvo)
Kieselguhr
Los tres primeros se utilizan para extraer componentes polifuncionales
de plantas y animales.
Silicagel
El gel de sílice o ácido silícico es uno de los más utilizados, es
débilmente ácido, su pH oscila entre 4-5. Con lo cual no se deberá
utilizar con sustancias que se corrompan con los ácidos. Los geles de
sílice normales suelen contener impurezas de hierro y/o aluminio, este
factor también se debe tener en cuentas respecto al uso de
componentes. El tamaño del grano suele ser de 10 a 40 micras (µ) y el
tamaño de poro varía de 20 a 150Å.
Generalmente lleva incorporado un agente aglomerante, yeso (sulfato
de cálcico semihidratado), para proporcionar firmeza al adsorbente.
También han sido incorporados dos indicadores del ultravioleta, juntos o
por separados (amarillo y/o verde), en diversos tipos de gel de sílice.
Se trata de un adsorbente polar, pero puede ser tratado con
hidrocarburos para neutralizar los grupos -OH, de forma que se haga
apto para separar componentes lipófilos (esteroides, ácidos grasos,
ceras, vitaminas liposolubles, etc). A este proceso se le denomina
cromatografía de fase reversa (silanizado).
Alúmina
La alúmina u óxido de aluminio es un adsorbente ligeramente básico
debido a que en el proceso de extracción de la alúmina a partir de la
bauxita quedan algunas moléculas de hidróxido de aluminio adheridas a
la alúmina, dándole a ésta un carácter básico. No consigue un desarrollo
tan alto de la sustancia depositada como el gel de sílice.
La alúmina puede ser tratada químicamente para conseguir alúminas
ácidas, básicas y neutras. Puede contener aglomerantes y/o indicadores
ultravioletas. Es un adsorbente de carácter polar, de tal forma que
retendrá con mayor avidez a los componentes polares.
Preparación de placas.
El adsorvente se deslíe en agua destilada. Para mezclar la papilla
homogéneamente es preferible agitar de modo mecánico. La proporción
de adsorbente y agua depende del tipo de adsorbente. Dos parte de
agua y una de adsorbente pueden tomarse como norma general, no
obstante, habrán de consultarse la instrucciones del fabricante.
Originariamente se utilizaban, como soporte del adsorbente, láminas de
vidrio, pero en la actualidad también se utilizan láminas de otros
compuestos orgánicos más flexibles. Dependiendo del tipo de separación
que se desee (cualitativa o preparativa) se utilizará un tamaño de placa
u otro. En general para realizar una separación preparativa de un gramo
de muestra es necesario una placa de vidrio de 20x20 cm., 35 gramos
de adsorbente y 80 ml. de agua destilada.
Las propiedades de la fase estacionaria pueden alterarse mediante la
adición de compuestos tales como disoluciones tamponadoras para
mantener el pH deseado. En la preparación de las placas también se
pueden adicionar indicadores fluorescentes o aglomerantes.
Cabe destacar la adición de nitrato de plata (AgNO3), a este proceso se
le denomina argentación, y se utiliza para separar componentes
insaturados.
El espesor de la placa es otro factor a tener en cuenta al preparar la
placa, en general suele ser de:
0.1-0.2 mm. para separaciones analíticas.
0.5- 2 mm. para separaciones preparativas.
La placa debe quedar libre de grumos y rugosidades, que afectarían al
desarrollo del proceso cromatográfico. Para ello existen en el mercado
extensores que se utilizan para crear de forma mecánica placas
homogéneas del espesor deseado. Si no se disponer de extensor, el
proceso a seguir es el siguiente:
1.
2.
3.
4.
5.
Mezclar en un Erlenmeyer el agua y el adsorbente.
Agitar enérgicamente.
Extender la papilla sobre el soporte de vidrio.
Hacer oscilar la papilla de un lado a otro.
Golpear con el dedo la parte inferior del soporte.
Las placas, normalmente, se dejan reposar un corto espacio de tiempo
después de cubrirlas; luego se colocan en bandejas metálicas. En este
momento puede activarse el agente adsorbente, bien dejando las placas
reposar toda la noche a temperatura ambiente, bien calentándolas
durante 30-60 minutos a 105-110 ºC (las placas de celulosa no deben
calentarse más de 10 minutos a 105 ºC) para expulsar así el aire. Es
conveniente dejar secar las placas inicialmente al aire, para evitar los
agrietamientos que se producirían por efecto del cambio de
temperatura.
Aplicación de las muestras
Los productos a examinar se disolverán, cuando sea posible, en un
disolvente orgánico no polar que tenga un punto de ebullición lo
suficientemente bajo para que se evapore después de la aplicación.. Sin
embargo a menudo se necesitan disolventes polares; la mezcla
cloroformo:metanol (1:1) es efectiva. Frecuentemente se emplean
disoluciones al 1%, de manera que al aplicar 2 µl resulta en la carga 20
µg de producto sólido. Muchos reactivos de revelado llegan a detectar
0.1 µg de material; por esto con esta carga puede llegarse a observar
un 5% de impurezas.
Existen una gran variedad de micropipetas y microjeringuillas para
realizar el proceso de siembra de la muestra a analizar. También pueden
usarse tubos capilares. El proceso de siembra se realiza tocando con la
punta del capilar (micropipeta, jeringuilla, etc) sobre la placa preparada.
Dejando una distancia al borde inferior de un centímetro
aproximadamente. El punto de aplicación de la muestra se denomina
toque.
Una vez colocado el toque se deja secar para evaporar el disolvente, de
forma que en la placa solo quedará la muestra a analizar.
Elección del eluyente
La elección del eluyente dependerá lógicamente del componente que se
va a separar y del material en que la separación se lleva a cabo.
Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:
Eter de petróleo.
Eter dietílico.
Ciclohexano.
Acetato de etilo.
Tetracloruro de carbono.*
Piridina.
Benceno.*
Etanol.
Cloroformo.*
Metanol.
Diclorometano.
Agua.
Ácido acético.
*compuestos cancerígenos.
En la elección del eluyente influyen varios factores:
•
•
•
•
•
Precio.
Pureza.
No utilizar mezclas de eluyentes (reproducibilidad).
No utilizar compuestos muy volátiles.
Evitar que contengan trazas de metales (catalizadores).
La elección del eluyente se realiza de forma empírica. Hay que estudiar
la polaridad del componente y probar con eluyentes cada vez menos
polares.
a) Toque de la muestra sin aplicar ningún eluyente.
b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente más polar.
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir
utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes más polares,
hasta dar con el más apropiado.
Otra técnica para realizar la elección del eluyente consiste en sembrar
varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo
capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto
permite desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma
que se aprecie el eluyente con el cual la separación se realiza de una
manera más eficaz.
Desarrollo de la cromatografía
El desarrollo de los cromatogramas en capa fina se realiza normalmente
por el método ascendente, esto es, al permitir que un eluyente ascienda
por una placa casi en vertical, por la acción de la capilaridad. La
cromatografía se realiza en una cubeta. Para conseguir la máxima
saturación posible de la atmósfera de la cámara, las parades se tapizan
con papel impregnado del eluyente. A veces pueden obtenerse
separaciones mejores sin poner papeles en las paredes, cosa que no
debe olvidarse.
Generalmente el eluyente se introduce en la cámara una hora antes del
desarrollo, para permitir la saturación de la atmósfera. El tiempo de
desarrollo, por lo general, no llega a los 30 minutos. El tiempo de una
cromatografía cualitativa suele ser de un par de minutos, mientras que
el tiempo de una cromatografía preparativa puede llegar a un par de
horas.
Las placas pueden desarrollarse durante un tiempo prefijado, o hasta
que se alcance una línea dibujada a una distancia fija desde el origen.
Esto se hace para estandarizar los valores de RF. Frecuentemente esta
distancia es de 10 cm.; parece ser la más conveniente para medir
valores de RF. Después del desarrollo, las placas pueden secarse
rápidamente con una corriente de aire caliente.
La mejor posición de desarrollo para un componente es el punto medio
entre el origen y el frente del eluyente, ya que permite separar las
impurezas que se desplazan con mayor y menor velocidad. El frente del
eluyente nunca debe llegar a tocar el borde de la placa.
Si la placa se estropea por acción del aire o de la luz, se secará en una
cámara que contenga un gas inerte o aislada de la luz.
Localización de sustancias
Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la
posición de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de métodos:
•
•
Métodos químicos.
Métodos físicos.
Métodos químicos
Consisten en ralizar una reacción química entre un reactivo revelador y
los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los
reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una
pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire
comprimido.
Es preferible pulverizar con las placas en posición horizontal. Si el
reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverización deberá
realizarse en una vitrina de gases bien ventilada.
La pulverización se realizará poco a poco. En cromatografía en capa fina
no puede realizarse el bañado del cromatograma (en cromatografía en
papel sí).
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma
complejos coloreados con los componentes orgánicos (con tonos
amarillo-marrón), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo
que es conveniente señalar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el ácido sulfúrico, que
reacciona con los componentes orgánicos produciendo manchas negras.
El tamaño de las manchas no está relacionado con la cantidad de
componente separado.
Además de estos reveladores generales, existen otros específicos:
•
•
•
•
2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).
Verde de bromocresol (para ácidos carboxílicos).
Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).
Ninhidrina (para aminoácidos).
Métodos físicos.
El más común consiste en añadir al adsorbente un indicador
fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lámpara
ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda,
aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay
componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente
excepto donde hay componentes.
Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal)
con lo que pueden ser detectados directamente en una lámpara de
ultravioleta.
Constantes Rf Y Rx
La constante RF (Ratio of Front) es simplemente una manera de
expresar la posición de un compuesto sobre una placa como una
fracción decimal, mide la retención de un componente. Se define como:
La distancia recorrida por el compuesto se mide generalmente desde el
centro de la mancha, los cálculos se simplifican si el denominador es 10.
Para que los RF sean reproducibles deben ser fijadas una serie de
condiciones (Espesor de la placa, fase móvil, fase estacionaria, cantidad
de muestra). El máximo valor de RF que se puede alcanzar es de 1, lo
ideal es un RF entre 0.65 y 0.7.
Para averiguar si dos compuestos son iguales, se colocan ambos sobre
la misma placa y se desarrolla con varios eluyentes. Una vez
desarrollados se calculan los RF y si son distintos, puede deducirse con
toda seguridad que no se trataba del mismo compuesto. Por el contrario
si los RF son iguales los compuestos pueden ser iguales o no serlo.
Si se sospecha que dos compuestos son muy parecidos se eluyen sobre
la misma placa con el mismo eluyente u otros de menor polaridad, hasta
apreciar una separación mínima. En este caso no se pueden usar
reveladores químicos, ya que alterarían los compuestos, sino indIcador
ultravioleta.
También se puede operar de la manera siguiente: Se selecciona un
compuesto (X), que tenga una posición de desarrollo conveniente; todos
los demás compuestos sobre la placa se relacionan con éste. De esta
manera se tiene el , RX , ya que:
La polaridad es el mayor efecto que afecta la Kc en una columna
cromatogáfica, o TLC.
La polaridad es la separación de cargas generadas por la diferencia de
electronegatividad entre dos atomos, lo que genera un dipolo.
Cuando un compuesto es muy polar es porque tiene mayor afinidad por
la fase estacionaria polar que aquellos compuestos que son menos
polares (atraccion polar con polar).
Compuestos no polares tienen gran afinidad por fases estacionarias no
polares mas que los compuestos polares (atracción no polar con no
polar).
La polaridad relativa esta en relación con los frupos funcionales. La serie
elutrópica siguiente:
RCO2H > ROH > RNH2 > RR`C=O > RCO2R`> ROR`> C=C > R-X
Acido carboxilico > alcohol > amina> cetona > éster > éter > alqueno > halogenuro de alquilo
De Izquierda a derecha: 
Disminuye la polaridad 
Disminuye el tiempo de retención en una columna o TLC 
Invrementa el factor de retención o Rf de columna o TLC 
Disminuye la afinidad 
3. MATERIAL REACTIVOS Y EQUIPO
CANTIDAD
1
2
2
MATERIAL Y EQUIPO
Embudo simple
Papel filtro
Vaso de precipitado
de 100 ml
Matraz erlenmeyer
Espátula
Papel filtro
Mortero
REACTIVOS
Acetona
Etanol
Agua
CANTIDAD
Suficiente
Suficiente
Suficiente
Hexano o eter Suficiente
de petroleo
Acetato de etilo Suficiente
Tinta de pluma
roja, negra y
azul
Extracto
de
jamaica
Chocolates
confitados
de
marca
extranjera
Chocolates
confitados
de
marca nacional
c. s. : Cantidad Suficiente
4. PARTE EXPERIMENTAL
Práctica 3a. CROMATOGRAFÍA EN CAPA
COLORANTES NATURALES Y ARTIFICIALES.
FINA
DE
EXPERIMENTO 1: SEPARACIÓN DE COLORANTES ARTIFICIALES.
1. Consiga un paquete de chocolates confitados de marca extranjera,
y quítele muy cuidadosamente la capa de color, poniendo en 1 ml
de agua varias lentejas de chocolate confitado hasta quitarle el
color. Cuidando que no salga una capa blanca.
2. Recortar papel filtro de 5 cm de ancho por 12 cm de largo, dibujar
una linea a 1 cm del origen y poner sobre la línea 5 puntos
equidistantes.
3. Aplicar cuidadosamente la muestra de colorante en un punto, y
hacer así con cada color.
4. Antes de meter el papel filtro dobla el papel en la parte superior y
ponle un palillo con el fin de sostener el papel)
5. Meter el papel filtro en un vaso de precipitado con agua pero el
agua debe de tener unos 0.5 cm de alto y tapar con un vidrio de
reloj (No debe de rebasar la línea de aplicación de las muestras y
el papel no debe de doblase y tampoco debe de tocar las paredes
del vaso de precipitado).
6. Y dejar correr el disolvente hasta que llegue 0.5 cm antes de que
acabe el papel. (Ver figura 1)
7. Observa que es lo que ocurre y dibuja lo que obtuviste.
8. Realizar el mismo procedimiento desde el paso 1 hasta el 6, pero
ahora utiliza los chocolates confitados nacionales.
9. Observa que es lo que ocurre y dibuja lo que obtuviste.
10.
Realizar el mismo procedimiento desde el paso 1 hasta el 6,
pero ahora utiliza el extracto de jamaica. Prepara 3 muestras de
papel filtro con la muestra de extracto de jamaica, la aplicación de
la muestra hazlo a todo lo ancho del papel y utiliza para la primera
cromatografía agua, para la segunda cromatografía utiliza una
mezcla de H2O:AcAc (10:1), y para la tercer cromatografía utiliza
una mezcla de H2O:AcAc (1:1). (ver figura 2)
11.
Observa que es lo que ocurre y dibuja lo que obtuviste.
NOTA: LA RELACIÓN (1:1) INDICA QUE SE HACE UNA MEZCLA DE
IGUAL CANTIDAD, EJEMPLO 1 ML DE AGUA Y 1 ML DE ACIDO
ACÉTICO, PARA UNA RELACIÓN (10:1) IMPLICA UNA RELACION DE
10 ML DE AGUA Y 1ML DE ÁCIDO ACÉTICO.
Figura 1
Rf = distancia recorrida del inicio al final/ distancia recorrida por la
muestra
Figura 2
EXPERIMENTO 2: SEPARACIÓN DE CLOROFILA DE ESPINACAS.
1. Poner las hojas de espinacas con acetona y etanol en un mortero y
moler las hojas.
2. Filtrar el liquido sobrenadante, y ese líquido es el que se usará
para aplicar en papel.
3. Del experimento anterior realizar los mismos pasos, correr el
cromatograma en EtOH.
4. El la figura de abajo representan cromatogramas de clororofila.
5. CUESTIONARIO
1. Qué significa cromatografía?
2. ¿Qué significa Rf y para que nos sirve conocer el Rf de una
sustancia?
3. Calcula el Rf de cada una de las muestras
4. ¿Cual muestra tiene un Rf mayor y cual un Rf menor?
5. ¿Que tipo de cromatografía se llevó acabo?
6. ¿Qué es un cromatograma?
7. ¿Que es adsorbente y eluente?
8. Para el experimento que realizaste: ¿quien es tu adsorbente y
quien es tu eluente?
9. ¿Para muestras inorgánicas que tipo eluente se utiliza? ¿Se
utilizarán los mismos disolventes para muestras orgánicas?
10.
¿Que significa la polaridad de un disolvente?
11.
¿Para que nos sirve la constante dieléctrica?
12.
¿Si el cromatograma es transparente que se hace para
identificarlo?
13.
Investigue que reactivos existen para revelar cromatografía
en capa fina.
14.
Cuantos métodos cromatográficos existen.
15.
Cual es la diferencia de hacer cromatografía en columna y
cromatografía en capa fina?
16.
Tipos de Cromatografía en columna.
17.
¿Que tipos de reveladores existen para revelar cromatografía
en capa fina?
18.
¿Como funciona una Cromatografía de intercambio ionico?
19.
¿Como funciona una Cromatografía de filtración en gel?
20.
¿Como funciona una Cromatografía de afinidad y de
inmunoafinidad?
21.
Electroforesis en geles de poliacrilamida
22.
En donde son empleados los geles de poliacrilamida
23.
¿De que tamaño deben ser el diámetro de las partículas del
soporte en cromatografía?
6. EXPERIMENTOS COMPLEMENTARIOS
Usa las siguientes muestras para hacer cromatografía en papel:
1) Chocolates confitados de marca nacional.
2) Tinta de pluma: roja, azul y negra
3) Flores de jamaica y (Pon unas cuantas flores en 10 ml de agua
para obtener los colorantes)
a) Pon un punto de tinta de cada color y haz la cromatografía
b)
c)
d)
e)
f)
g)
h)
Haz la cromatografía con sólo agua, y con sólo etanol.
Prueba con diferentes mezclas de agua y etanol (1:1 y 5:1)
¿Que observaste?
Calcula el Rf de cada muestra.
¿Cuantos componentes tienen las muestras?
¿Están puras las muestras?
Escribe tus conclusiones
Práctica 3b. CROMATOGRAFÍA
COMPUESTOS ORGÁNICOS
EN
CAPA
FINA
DE
Para la siguiente práctica se recomienda:
Para el profesor:
1. Deberá de solicitar los reactivos, y empleará la cantidad que se marca
para cada equipo de alumnos. Es decir, si son 4 equipos deberá de
considerar entonces 0.05 g de cada reactivo.
2. Colocar cada reactivo en un tubo de ensayo con una etiqueta del
nombre del reactivo.
3. Diluir cada tubo con la muestra con 2 ml de EtOH y llenar a ¾ del
tubo con CH2Cl2, para asegurar la completa dilución de las muestras.
4. Para el caso del acido salicílico y del ácido benzoico diluir solamente
con EtOH. Considerar que para cada 0.01 g de muestra se emplearán 4
ml de volumen total de disolventes.
5. Repartir a cada equipo de alumnos una cantidad proporcional más
uno, ya que éstas muestras contendrán las soluciones patrón de las
muestras conocidas.
6. Colocar las muestras patrón para que todo el grupo tome sus
muestras de alli.
7. NO DESECHAR LAS MUESTRAS YA QUE ESTAS SERÁN EMPLEADAS EN
LA PRACTICA DE CRISTALIZACIONES PARA OBTENER LOS PUNTOS DE
FUSIÓN DE LAS MUESTRAS SÓLIDAS (PRACTICA 4)
3. MATERIAL REACTIVOS Y EQUIPO
CANTIDAD MATERIAL Y EQUIPO
5
Placas
de
cromatografía
5
Vaso de precipitado
de 100 ml
8
Tubos de ensaye
Papel alumninio
2
Pipetas pasteur
REACTIVOS
ACETONA
CANTIDAD
Suficiente
ETANOL
Suficiente
AGUA
HEXANO O
ETER DE
PETROLEO
ACETATO DE
Suficiente
Suficiente
Suficiente
1
1
1
Lampara de UV-vis
Cámara de UV-vis
Gradilla para tubos
de ensaye
ETILO
Fenol
Benzaldehido
Acido benzóico
Anilina
Naftaleno
Acetanilida
Acido salicílico
Cloruro de
paratoluensulfonilo
Alcohol
bencílico
Anhidrido
succinico
0.01 g
0.01 g
0.01 g
0.01
0.01
0.01
0.01
0.01
g
g
g
g
g
0.01 g
0.01 g
Para el alumno:
1. Cada vez que vayas a aplicar tu reactivo a la placa cromatografica en
capa fina, hacerlo con un ligero toque, en el punto de aplicación.
2. No es neceario apoyarse firmemente en la placa con la punta de la
pipeta, ya que se corre el riesgo de descascarar la placa de
cromatografía, ya que no te darán más para la práctica. CUIDALAS!
3. La cantidad de muestra con disolvente es solamente la necesaria que
suba por capilaridad por la punta de la pipeta, si la succionas, corres el
riesgo de que tu placa se manche con exceso de reactivo, y heches a
perder tu placa cromatográfica.
4. Cada vez que vaya a aplicar nueva muestra, deberás lavar tu pipeta
pasteur sumergiendola en un tubo de ensaye que solamente contenga
una mezcla de etanol-CH2Cl2 (1:1), para ello sumerges tu pipeta
pastuer, la sacas y la secas con un trozo de papel secante o algodón, y
repites este proceso por lo menos tres veces antes de aplicar
nuevamente una muestra a tu placa cromatografica.
5. Cuando hayas terminado tu cromatografía, para lavar las placas
cromatograficas , es decir, recuperarlas para ser utilizadas nuevamente;
deberás de sumergirlas en MeOH, y esperar a que suba el disolvente
hasta el tope de la placa. Sacar la placa para que se seque, y repetir ese
procedimiento
6. No se te olvide usar guantes durante toda la practica ya que estarás
empleando la lampara de UV-vis.
7. NO DESECHAR LAS MUESTRAS YA QUE ESTAS SERÁN EMPLEADAS EN
LA PRACTICA DE CRISTALIZACIONES PARA OBTENER LOS PUNTOS DE
FUSIÓN DE LAS MUESTRAS SÓLIDAS (PRACTICA 4)
Actividades a realizar dentro de la practica: Identificación de Rf
de muestras conocidas.
1. Los alumnos deberán de poner 5 muestras por placa de
cromatografía de las muestras conocidas y etiquetadas (muestras
patrón).
2. Los alumnos deberán de correr las placas de cromatografía en
Hexano, AcOEt, CH2Cl2, acetona, etanol y metanol (en ese orden,
ya que van en orden creciente de polaridad) para ir revisando la
polaridad de cada muestra e ir realizando las anotaciones
correspondientes de Rf de cada muestra.
3. Puede el alumno realizar las anotaciones en milímetros o realizar
directamente su conversión a Rf.
4. En caso de que las muestras hayan llegado al tope, se sugiere
realizar pruebas con mezcla hexano: AcOEt (1:1)
5. Se muestra a continuación una tabla con las relaciones entre
disolventes para probar la polaridad y Rf de las muestras, en la
parte superior se considera no polar la mezcla, hacia la parte
inferior se considera una mezcla polar.
Disolvente no
polar
HEXANO
9
5
2
Disolvente
polar
AcOEt
1
1
1
1
1
1
1
1
2
5
9
Actividades a realizar dentro de la practica: Identificación de Rf
de muestras desconocidas.
1. El profesor reacomodará los tubos de ensaye de tal forma que
solamente él sepa a que muestras corresponden.
2. La tarea del alumno será identificar cada muestra a partir del
conocimiento previo de las muestras conocidas por su Rf.
3. Al final de la práctica el alumno deberá de darle al profesor la
relación correcta de las muestras y con ello se calificará el número
de aciertos de la misma.
4. Contestar:
i. Dibuje una escala relativa de eluyentes de una fase
mobil (donde se tiene una fase estacionaria polar) y la
serie elutrópica de grupos funcionales.
ii. ¿Que ocurre si la fase movil y la fase estacionaria
estan en equilibrio (Kc=0) en una mezcla de solutos?
iii. ¿Qué ocurre si la fase movil tiene un Kc menor que la
fase estacioria en una mezcla de solutos?
iv. ¿Qué ocurre si la fase movil tiene un Kc mayor que la
fase estacionaria enuna mezcla de solutos?
v. ¿Qué ocurre si en una mezcla de solutos A y B ; el
soluto A migra mas rápido que B?
5. Basado en la realización de ésta práctica:
a) Determine el color de cada pigmento derivados de la espinaca en
base en los grupos funcionales.
b)Determine el orden de polaridad de los nueve pigmentos: clorofila
a, clorofila b, feofitina a, feofitina b, carotenos, β-carotenos,
xantofilas, luteina, licopeno.
6. Con respecto, a la cromatografía obtenida en la práctica, determine
y señale cada uno de los anteriores pigmentos y determine los Rf de
cada uno.