Diagnóstico de microorganismos fitopatógenos mediante técnicas
Anuncio
Diagnó Diagnóstico de microorganismos fitopató fitopatógenos mediante técnicas moleculares Dra. Ing. Agr. Sandra Alaniz Unidad de Fitopatología 9 de junio de 2011 Taxonomía Clásica Hongos Estudios morfológicos: - Aspecto de la colonia - Forma del conidióforo - Conidios: forma, tamaño, color, presencia de tabiques - Presencia de clamidosporas, ubicación Estudios fenotípicos: - Crecimiento a diferentes temperaturas - Resistencia a fungicidas - Producción de metabolitos Unidades taxonómicas Dominio Orden Familia Género Especie Sub-especie Cepa Taxonomía Clásica Bacterias: - Análisis morfológicos - Análisis bioquímicos Taxonomía Clásica Taxonomía Clásica Limitantes: Virus: - Forma (microscopio electrónico) ¾ Resultados no son concluyentes a cierta subjetividad ¾ Personal entrenado ¾ Tiempo requerido alto - Síntomas en plantas indicadoras - Síntomas en huésped ¾ Sujeto Ejemplo: Identificación de especies de Colletotrichum patógenas de manzano - Forma de los conidios: - Aspecto de la colonia C. acutatum conidios fusiformes C. gloeosporioides C. gloeosporioides conidios obtusos C. acutatum ¿C. gloeosporioides? Métodos Moleculares para la identificación de fitopatógenos Se basa en el análisis del ADN o ARN Métodos Moleculares para la identificación de fitopatógenos ¿Cómo se analiza el ADN? ¾ Mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) - Análisis de genes o regiones específicas - Análisis de todo el genoma “fingerprinting” ¿Quiénes pueden ser analizados? Todos los fitopatógenos que contengan ADN o ARN - Hongos - Bacterias y Fitoplasmas - Virus y Viroides - Nemátodos ¿Que es la PCR? ¾ Mediante hibridación - Utilización de sondas ¿Como se visualiza el producto amplificado? Consiste en amplificar muchas veces una región del ADN o ARN 95ºC PCR: Teñido con bromuro de etidio 40-60ºC - ADN molde - Primer (cebador) - Enzima 72ºC Control negativo - Nucleotidos sueltos (A, T, C, G) - Buffer 500 pb Virus y Viroides (ARN): RT-PCR 35 ciclos Resultado con: Primers generales (ej: amplifican hongos) ¿Que se hace con las secuencias? 500 pb 1) Compararlas con bases de datos (genbank, otros) Secuenciar GTACCTACCTCTGTTGCTTTGGCGGGCCGCGGTCCTCCGCGGCCGGCCCC CCTCCCCGGGGGGTGGCCAGCGCCCGCCAGAGGACCATCAAACTCCAGTC AGTAAACGATGCAGTCTGAAAAACATTTAATAAACTAAAACTTTCAACAA CGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAG TAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATT Tamaño medio de las secuencias: de 100 y 1000 bases 1) Comparación de secuencias con las depositadas en el GENBANK 2) Análisis filogenéticos 2) Análisis filogenéticos Programas: MEGA, PAUP, Sequencher, otros Ejemplo: Identificación molecular de especies del género Colletotrichum MEGA Identificación de especies del género Colletotrichum: C. gloeosporioides ¿Cuáles son los genes o regiones más utilizadas para los análisis? Hongos: - Región ITS (ITS1, 5.8S, ITS2): ARN Ribosomal C. fragariae C. acutatum Programa: MEGA Método: Neighbord-Joining - Región de la β-tubulina: proteína que forma los microtúbulos (involucrados en la multiplicación celular) ¿Cómo se analiza el ADN? Mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa): - Análisis de genes o regiones específicas - secuencias: primers generales - primers específicos - Factor de elongación (Ef-1): cataliza la “traducción” en la síntesis proteica - IGS: espacios entre los ITS - COX: DNA mitocondrial Primers específicos: Bacterias: - Específicamente amplifican determinado género, especie, patovar, etc - Se diseñan en regiones dónde hay variabilidad - Región 16S: ARN Ribosomal de las bacterias Ejemplo: Identificación mediante primers específicos de Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum causantes de la “podredumbre amarga” en manzano Identificación mediante primers específicos de Colletotrichum gloeosporioides y C. acutatum C. gloeosporioides Diseño de primers específicos: Región ITS (ITS1, 5.8S, ITS2) CgInt /ITS4 500 pb CaInt-2 /ITS4 500 pb C. acutatum CaInt-2 C. gloeosporioides CgInt C. acutatum ¿? Control negativo Aplicaciones avanzadas con primers específicos Aplicaciones avanzadas con primers específicos Nested-PCR: se efectuan dos PCR continuas Multiplex-PCR: 1º PCR: primers generales para hongos (ITS1/ITS4) - Se colocan dos pares o más de primers en la reacción de PCR 2º PCR: primers específicos - Permite detectar mas de una especie Controles positivos Controles positivos C. macrodidymum C. liriodendri Ejemplo: Identificación de Cylindrocarpon liriodendri y C. macrodidymum causantes del pie negro de la vid Ejemplo: Identificación de Cylindrocarpon liriodendri y C. macrodidymum C. macrodidymum C. liriodendri 1ª PCR Primers generales ITS1/ITS4 2ª PCR Primers específicos Importante: tamaños de bandas deben ser diferentes Ventajas: mayores resultados en igual tiempo ¿Cómo se analiza el ADN? ¾ Mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) - Análisis de genes o regiones específicas - secuencias: primers generales - primers específicos - RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) Aplicaciones: - Cuando la calidad del ADN no es buena - Detección en plantas RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism) 1º) Se amplifica una región del genoma con primers generales 2º) Se digiere (corta) el producto amplificado con una enzima de restricción (de cero a tres cortes), el producto se corre en un gel 3º) Se analiza el patrón de bandas resultante: número y tamaño de bandas 37 ºC 2 horas Análisis del ADN: ¾ Mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) - Análisis de genes o regiones específicas Análisis de todo el genoma “fingerprinting” Se utilzan sobre todo para estudiar individuos dentro de una misma especie: “Análisis de Poblaciones” -Técnicas: - Análisis de todo el genoma “fingerprinting” RAPD (Random Amplified Polymorphic DNAs) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) RAPD (Random Amplified Polymorphic DNAs) AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphisms) - Se utilizan primers universales de corto tamaño (8 a 12 nucleotidos) que amplifican sectores de ADN al azar generando bandas de diferente tamaño Es como el RFLP pero al revés: - Se analizan los patrones de bandas generados (cantidad y tamaño de bandas) - Primero se hace una digestión del ADN y luego se amplifica selectivamente determinadas regiones (primers asociados a las zonas de corte) - Se analizan los patrones de bandas generados Ejemplo: Ejemplo - Ventaja: No requiere conocimiento previo del ADN - Principal limitante: las bandas no son reproducibles - En general hay buena reproducibilidad de las bandas ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) C. liriodendri En el ADN existen secuencias cortas repetidas varias veces llamadas “Microsatélites” Ejemplo: (CT)n, (ATT)n, (GATA)n A AAACCTAAA AAATGGAACA AGCC ATGCGC ATGGGGATTC ATTTGGTTTA ATTGAGAGAG TTGTCCCTGC CATGCACACA CACACCGGAT TAAAGAAATA ATGAAAGATG ACTTATGAGA GAGTTGTGCC TGCCATGCAC ACACACCGGA T TAAAGAAAT AATGAAAGAT GA AATAAGTC ATAGAAGGCT CATGGGGCTG CTCAAAGCCT CAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGAGA GAGAGAGTTA GTTTTTCTTT TTTTTTCTAA CTTTGAAGCT AGTCATTCAA GACTCATGGA GTTGATTGAA CATT ATGATA GAACCAAACA GTCCCTATTG C. macrodidymum (TCG)5 Ejemplo: Análisis de Cylindrocarpon liriodendri y C. macrodidymum Microsatélite (GA)47 Se diseñan primers que se pegan en el inicio de estas zonas: DHB(GA)7 ¿Cómo se analiza el ADN? - Ventaja: La reproducibilidad de las bandas es muy buena ¿Qué es una sonda? ¾ Mediante PCR (Reacción en cadena de la Polimerasa) Son moléculas de ADN de cadena sencilla marcadas mediante radiación (P32) o agentes químicos (dogoxigenina) con el fin de ser utilizadas para la detección de secuencias complementarias de DNA o RNA ¾ Mediante hibridación - Utilización de sondas Sondas: - Son de relativamente pequeño tamaño (100 a 1000 bases) - Se diseñan para especificamente detectar determinado género, especie, etc Se utilizan mucho para el diagnóstico de Virus y Viroides Técnicas: Southern blot: detecta ADN Northen blot: detecta ARN Procedimiento básico 1- Digestión y corrida en electroforesis 2- Transferencia a una membrana 3- Hibridación con la sonda y revelado Ejemplo: Técnicas: - Southern blot: detecta ADN Transferencia a una membrana (nitrocelulosa) - Northen blot: detecta ARN - Dot blot: detecta ADN o ARN - Slot-blot: detecta ADN o ARN Digestión y electroforesis Aplicación de sonda y revelado Técnicas: Dot blot: detecta ADN o ARN 1- Se coloca la muestra directamente en la membrana Slot-blot: detecta ADN o ARN 2- Hibridación con la sonda y revelado Diagnó Diagnóstico de microorganismos fitopató fitopatógenos mediante técnicas moleculares Ejemplo: Ventajas: es mucho mas rápida, permite analizar gran numero de muestras Desventaja: no hay información del tamaño de las bandas Dra. Ing. Agr. Sandra Alaniz Unidad de Fitopatología 9 de junio de 2011
