practicas de laboratorio identificacion bacteriana ii

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA
FACULTAD DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE MICROBIOLOGIA
PRACTICAS DE LABORATORIO
IDENTIFICACION BACTERIANA II
Maye Bernal Rivera
PARTE II.
LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS
Para la lectura, interpretación e identificación del crecimiento bacteriano, primero que
todo se sigue un estudio cualitativo que comprende los siguientes parámetros:
1. Características Macroscópicas de las colonias
a. Medios Líquidos
i.
ii.
iii.
iv.
Enturbiamiento: parejo, en ondas, cordones suspendidos.
Capas superficiales.
Precipitados: polvoriento, granuloso, viscoso.
Pigmentos di fusibles.
b. Medios Sólidos. Estudio de Colonias:
i. Tamaño : puntiforme, pequeño, mediano, grande, extendidas en
velo, invadiendo toda la superficie del medio.
ii. Forma:
circular, alargada, irregular, filamentosa, rizoide,
fusiforme.
iii. Bordes: enteros, dentados, lobulados, rizoides.
iv. Superficie: lisa, rugosa.
v. Levantamiento: plana, convexa, acuminada, umbilical
vi. Consistencia: mucoide, friable, seca, viscosa
vii. Transparencia: transparente, traslucida, opaca
viii. Color: blanco, amarillo, gris, verde, rojo, etc.
2. Cambios Producidos en el medio
a. Pigmentos difusibles (bacterias pancromóforas) que cambian el color del
medio: verde, amarillo, rojo, marrón, etc.
b. Olor: algunas bacterias emiten olores característicos, como a frutas,
chocolate, queso, etc.
c. Hemólisis: alfa, beta, beta prima y gamma o no hemolíticas.
d. Metabolismo
3. Características Microscópicas de la Colonia
Las características microscópicas de las colonias se
estudian mediante la coloración de Gram, una
coloración compuesta, que permite clasificar las
bacterias en dos grandes grupos: Gram Positivas y
Gram Negativas.
La coloración fue desarrollada en 1884 por Hans
Christian Joachim Gram, farmacólogo, patólogo y
eminente profesor de Medicina Interna. Esta coloración
posiblemente es el procedimiento más trascendental
para el diagnóstico bacteriológico jamás desarrollado.
Además de la afinidad, esta coloración permite establecer:
Hans Christian Joachim
Gram. 1853 - 1938
a. Morfología (cocos, bacilos, espirilos, cocobacilos, vibrios, etc.)
b. Agrupación (en pares, cadenas, tétradas, racimo, sarcina, empalizada,
caracteres, etc.)
c. Afinidad: Gram positiva o Gram negativa
d. Otras estructuras: A veces la coloración de Gram permite observar
cápsulas, pero hay coloraciones específicas para determinar la
presencia de otras estructuras bacterianas, como por ejemplo:
i.
ii.
iii.
iv.
Cápsula ( Tinta China, Hiss )
Esporos ( Shaeffer Fulton )
Flagelos ( Leiffson )
Gránulos metacromáticos ( Van Stoltemberg, Loeffler )
Coloración de Gram
Procedimiento:
1. Cristal Violeta
-
Lavar con agua corriente
2. Lugol
-
5 segundos
Lavar con agua corriente
4. Safranina
-
1 minuto
Lavar con agua corriente
3. Alcohol Acetona
-
1 minuto
30 segundos
Lavar con agua corriente
4. Pruebas bioquímicas
5. Pruebas Biológicas
El uso de animales para el aislamiento y la identificación de agentes
patógenos está limitado a laboratorios de experimentación, ya que hoy en día
se cuenta con equipos automatizados y pruebas inmunológicas y moleculares
para llegar al diagnóstico etiológico del agente infeccioso.
6. Pruebas Inmunológicas
Se basan en la utilización de anticuerpos específicos para la detección de
antígenos presentes en las bacterias (polisacáridos capsulares, proteínas
flagelares y otros varios componentes de la pared celular). La detección puede
hacerse en la bacteria completa o libre, en antígenos solubles
7. Pruebas de Biología Molecular
Estas pruebas se han convertido hoy en día en el criterio principal para la
clasificación taxonómica, la identificación bacteriana, el diagnóstico etiológico
en enfermedades infecciosas y estudios epidemiológicos; basadas en el grado
de relación entre las secuencias de los ácidos nucleicos, mediante análisis
bien sea del DNA o RNA de los microorganismos.
PRACTICA DE LABORATORIO
PARTE II. LECTURA E INTERPRETACION DE LOS CULTIVOS
Objetivos específicos
-
Observar el desarrollo bacteriano en los diferentes medios de cultivo
Estudiar las características macroscópicas de una bacteria en un medio de
cultivo
Estudiar los cambios producidos en los diferentes medios
Preparar frotis en láminas portaobjetos, a partir de cultivos bacterianos en
medio líquido y en medio sólido
Aprender a realizar la coloración de Gram
Conocer las diferentes características morfológicas bacterianas
Conocer los diferentes tipos de agrupación bacteriano
Diferenciar las bacterias Gram positivas de las Gram negativas.
Conocer cultivos mixtos
Aprender a distinguir los tipos de hemólisis
Materiales
- Cultivos bacterianos
- Láminas, asas, mecheros, marcador de vidrio, papel absorbente
- Colorantes para Gram
- Microscopio y aceite de inmersión
- Faringocultivo
Procedimiento
1. Estudio Macroscópico
Observar cada uno de los seis medios de cultivo sembrados:
a. Caldo: Estudiar las características, de acuerdo a las especificaciones
de arriba
b. Agar Nutritivo inclinado: Observar si hubo o no crecimiento en la
superficie
c. Agar semisólido: Especificar si hubo o no crecimiento y si creció,
determinar si es móvil o inmóvil
d. Agar Nutritivo: Observar si hubo crecimiento y si se produjo cambios en
el medio.
e. Agar Sangre: Observar si el cultivo está puro (un solo tipo de colonias) o
mixto (más de un tipo de colonias). Escoger una colonia aislada y
estudiar sus 8 características macroscópicas, cambios producidos en el
medio (hemólisis), aspecto, olor, etc.
f. Agar Mac Conkey: Establecer si hubo o no crecimiento bacteriano. Si
hubo crecimiento, especificar si se trata de una bacteria lactosa positiva
o lactosa negativa.
2. Estudio Microscópico
Hacer frotis a partir del caldo y a partir de una colonia del agar sangre.
Procedimiento
1. Identificar la lámina: Destinar un tercio de la lámina para identificarla,
utilizando marcador de vidrio o cinta de enmascarar (si la lámina es
esmerilada, usar lápiz)
Solución salina +
colonia del agar sangre
Caldo
Pedro López
170305001
Gram
2. Hacer el frotis:
A partir de caldo: esterilizar el asa, enfriarla dentro del caldo,
sacudirla contra la pared del tubo, sacar una “asada” y distribuirla en
forma circular, cerca al sitio de identificación de la lámina.
A partir de agar: colocar una gota de solución salina estéril en el
costado distal de la identificación, esterilizar el asa, enfriarla en el
borde del agar, tocar la superficie central de la colonia y
homogenizar con la gota de solución salina, en forma circular.
3. Dejar secar a temperatura ambiente
4. Fijar al calor: flamear unas dos o tres veces, controlando la temperatura
de la lámina en el dorso de la mano para evitar que se quemen las
células bacterianas
5. Colorear con Gram (ver técnica arriba)
6. Secar con papel absorbente: secar el reverso de la lámina, colocar el
papel sobre la mesa de trabajo, voltear la lámina y hacerle una ligera
presión
7. Dejar secar completamente: colocar en posición vertical hasta que esté
completamente seca.
8. Adicionar aceite de inmersión: dejar caer una gota sobre el área de la
preparación.
9. Observar al microscopio: enfocar en 10X y observar en 100X
10. Dibujar e Informar la morfología, afinidad y agrupación en caso de ser
específica y predominante.
3. Conocer y dibujar las diferentes morfologías, agrupaciones y diferenciar gram
positivos de gran negativos; para ello debe revisar las preparaciones
coloreadas de sus compañeros de mesa.
4. Faringocultivo: Lectura e interpretación.
Mirar la superficie del agar sangre para determinar si es un cultivo mixto o
puro.
Observar a trasluz para buscar colonias beta hemolíticas
Discutir con su profesor los hallazgos
Informar el resultado.
Actividad
1. Dibuje las diferentes morfologías, tipo de agrupación y afinidad con respecto al
Gram, de las bacterias
2. Investigue por qué algunas bacterias no crecieron en Agar Mac Conkey y las
que crecen, por qué se diferencian en lactosa positivas y lactosa negativas?
3. Escriba 5 medios de cultivo utilizados en el Laboratorio de Microbiología para
el aislamiento bacteriano en el diagnóstico de enfermedades infecciosas y, la
utilidad de cada uno de ellos.
4. Defina qué es un “portador sano”