Pruebas bioquimicas

Universidad Interamericana !
Recinto Bayamón
Pruebas bioquímicas para la
identificación de bacterias GramNegativas
Capítulo #9
José Ángel Pérez !
Coral M. Rivera !
Johnathan J. Rodríguez!
!
Objetivos
❖
Discutir diversas pruebas bioquímicas para identificar
bacterias Gram-negativas:!
✓
Utilización de carbohidratos!
✓
Metabolismo de glucosa y sus productos metabólicos!
✓
Utilización de aminoácidos!
✓
Pruebas Variadas
Utilización de carbohidratos
Prueba de oxidación-fermentación!
Dextrosa, Sucrosa, Lactosa!
Triple Sugar Iron Agar & Kligler lron Agar!
Prueba Ortho-Nitrophenyl-β-DGalactopyranoside!
MacConkey
Utilización de carbohidratos
❖
Diversidad de bacterias tienen la habilidad de utilizar
carbohidratos.!
❖
Importancia principal de las pruebas de carbohidratos.!
✓
Determinar la utilización de lactosa.!
-
Fermentadoras de lactosa (LFs)!
-
No-fermentadoras de lactosa (NLFs)
Prueba de oxidación-fermentación
❖
Bacterias utilizan carbohidratos por oxidación o fermentación.!
❖
La diferencia es la necesidad de oxígeno. !
❖
Bacterias anaerobias los utilizan vía fermentación !
❖
Bacterias aerobias estrictas solo pueden oxidarlos.
Oxidación
Microorganismos se
inoculan en dos tubos de
agar OF. 1 - parafina o
aceite , 2- permanecerá
abierto.
Fermentación
Fig. 1 Resultados prueba O/F
http://microbitos.wordpress.com/2011/09/27/pruebas-bioquimicas-primarias/
Dextrosa, Sucrosa, Lactosa
❖
Capacidad metabólica para degradar carbohidratos: glucosa, lacotosa y sucrosa.!
❖
Producción de gas o no producción de gas y posible producción de ácido sulfhídrico (H2S).!
❖
Interpretación:
A
B
C
D
Fermentación
Glucosa
+
+
+
+
Fermentación
Lactosa/ Sucrosa
-
+
-
-
Producción H2S
+
-
-
+
Producción gas
-
+
+
-
Tabla 1: Interpretación de resultados
Triple Sugar Iron Agar (TSI) &
Kligler Iron Agar (KIA)
❖
Detectan fermentación de carbohidratos, producción de
gas y H₂S. !
❖
Detección de H₂S con sulfato ferroso y tiosulfato de
sodio.!
❖
Patógenos intestinales.
Triple Sugar Iron Agar (TSI) &
Kligler Iron Agar (KIA)
❖
Composición del medio!
✓
✓
TSI !
-
[Lactosa 1%], [glucosa 0.01%], [sucrosa 1%]!
-
Sulfato ferroso y/o Tiosulfato de sodio!
-
Fenol rojo (indicador de pH)!
-
Tubo de agar inclinado!
KIA (no sucrosa)
Triple Sugar Iron Agar (TSI) &
Kligler Iron Agar (KIA)
❖
Se inocula con la técnica de “Fish tailing”.!
❖
Tapa suelta!
❖
Incubación de 18-24 hrs. a 37°C!
❖
Resultados: Inclinado/ Fondo
Triple Sugar Iron Agar (TSI) &
Kligler Iron Agar (KIA)
•
Posibles resultados:!
✓
No fermentación!
✓
Fermentación de glucosa!
✓
Fermentación de lactosa !
✓
Producción de H₂S!
✓
Producción de Gas
Prueba Ortho-Nitrophenyl-β-Δ-Galactopyranoside (ONPG)
❖
Diferenciar organismos dLF y verdaderos NLF.!
❖
ONPG!
✓
❖
No requiere β-Galactoside permeasa.!
Inoculación:!
✓
Suspención de bacteria en solución salina estéril y se
añade tableta de ONPG. !
✓
Incubación: 4 hrs a 35°C.
Prueba Ortho-Nitrophenyl-β-Δ-Galactopyranoside (ONPG)
❖
Resultados
Prueba Ortho-Nitrophenyl-β-Δ-Galactopyranoside (ONPG)
MacConkey
❖
Utilizado para el aislamiento y diferenciación de bacilos
entéricos gram-negativas. !
❖
Los organismos que fermentan lactosa crecen como
colonias de color rosa con o sin una zona de bilis
precipitada. Los organismos que no son fermentadores
de lactosa crecen como colonias incoloras o
transparentes.
Metabolismo de glucosa y sus
productos metabólicos
Prueba rojo de metilo!
Prueba Voges Proskauer
Prueba de Rojo Metilo/Prueba Voges Proskauer
❖
Capacidad de fermentación de glucosa con:!
❖
Producción de ácido vía ácido mixta.!
❖
Producto neutro vía Butanodiólica!
❖
Después de 48 hrs de incubación previa en el caldo para determinar:!
❖
Presencia de productos neutros (prueba VP)!
❖
Fermentación vía ácido mixta (prueba MR)!
Se utiliza: caldo RM/VP!
Sustrato: glucosa!
Reactivos: rojo de metilo, alfa naftol y KOH 40%
Utilización de Aminoácidos
Prueba decarboxilasa
Prueba decarboxilasa
❖
Determina si las bacterias poseen enzimas capaces de
decarboxilar el aminoácido añadido.!
❖
Aminoácidos más comunes para esta prueba son la
lisina y la ortinina.
Prueba de decarboxilasa
❖
❖
❖
Para detectar decarboxilación se utiliza un medio base en caldo llamado
Moeller decarboxilasa. Este medio contiene.!
✓
Glucosa!
✓
Peptonas!
✓
2 indicadores de pH (púrpura de bromocresol y rojo cresol)!
✓
El aminoácio especifico en una concentración del 1%. !
✓
Con un pH inicial de 6.0!
La decarboxilación se da bajo dos condiciones:!
✓
pH ácido!
✓
Ambiente anaerobio!
Incubado a 35°C
Prueba de decarboxilasa
Pruebas Variadas
Utilización de Citrato!
DNasa!
Liquefación de Gelatina!
Producción indole!
Motilidad!
Reducción de nitrato y nitrito!
Ureasa!
Agar inclinado de Lisina Hierro!
Agar de motilidad-indole-ornitina!
Agar sulfato- indole- molitidad
Utilización de Citrato
❖
Diferencia entre capacidad de usar Citrato como única fuente de Carbono.!
❖
Sales de amonio del medio como fuente de nitrógeno.!
❖
Provocan alcalinización del medio.!
❖
Se utiliza el agar Citrato de Simons. !
❖
Bromotimol azul como indicador de pH.
Prueba de DNAsa
❖
Endonucleasas de las bacterias que rompen enlaces fosfodiester. !
❖
DNAsa extracelular Staphilococos aureus y Serratia marcescens.!
❖
El medio contiene 0.2% de ADN .!
❖
Inoculación lineal!
✓
Pueden ser evaluados varios organismos al mismo tiempo.!
✓
Incubar 35°C 18- 24 hrs.!
✓
Añadir HCl al plato.
Prueba de DNAsa
Acción DNAsa→ Disuelve oligonucleótidos→Forma un halo
Liquefación de Gelatina
Capacidad de producción de enzimas tipo proteolítico (gelatinasas).!
Hidrolizan o licúan la gel.!
Existen varios medios con los que se puede realizar la prueba entre
ellos:!
❖
Medio sólido nutritivo (hidrólisis)!
❖
Medio basal líquido (licuefacción)!
❖
Tiras de crabón, gelatina (hidrólisis)!
❖
Película radiográfica (degradación de gelatina)!
❖
Agar de gelatina (alcalinización)
Producción de Indole
❖
Indole es un producto de degradación de triptofano.!
❖
La utilidad de esta técnica es detectar productos de indole. !
❖
El medio es un caldo de triptofano al 1% o peptonas.!
❖
Se inocular bacterias al caldo.!
❖
Incubar a 35°C por 48 hrs.
Producción de Indole
❖
Se detecta el indole por dos pruebas: !
✓
Ehrilich indole test !
-
❖
Se añade xileno para extraer el indole, menearlo,
esperar que suba el xileno, añadir reagente que
contiene PDAB.!
Reagente Kovac.!
✓
Contiene PDAB, no utiliza xileno, 5 gotas de
reagente, menear.
Producción de Indole
❖
Presencia de indole= rojo
Motilidad (gota colgante)
❖
Se utiliza para observar si el organismo posee motilidad.
Reducción de nitrato y nitrito
❖
Determina si un organismo es capaz de reducir nitrato a
nitrito, y nitrito a N₂ gaseoso.!
❖
Compuesto de caldo con fuente de nitrógeno.!
❖
Inocular bacteria con el asa estéril.!
❖
Incubar por 24 hrs. y añadir ácido sulfúrico y N,Ndimethyl-∝-naphithylamina.
Reducción de nitrato y nitrito
❖
Resultados:!
✓
Rojo= presencia de nitrito!
✓
Incoloro= no reducción de nitrato a nitrito o exceso de
reducción hasta N₂, NO o N₂O.!
-
El Zinc reduce nitrato a nitrito para corroborar si los
resultados son realmente negativos o hubo exceso
de reducción.!
-
Tubo Durham, atrapa N₂.
Ureasa
❖
Micobacteria capaz o no de
producir la enzima ureasa.!
❖
Ureasa degrada la urea.!
❖
Capacidad de utilizar Urea
como fuente de Nitrógeno.!
❖
Enzima ureasa alcaliniza el
medio al liberar amonicao
cuando degrada la urea.
Agar inclinado de Lisina Hierro
❖
Se utiliza principalmente para determinar si la bacteria
decarboxila o deamina la lisina, y en este medio se
puede detectar H₂S.!
❖
El medio está compuesto de Lisina, glucosa, citrato de
amonio férrico, tiosulfato de sodio, púrpura de
bromocresol.
Agar inclinado de Lisina Hierro
Agar de motilidad-indole-ornitina
❖
Detecta motilidad de bacterias, indole y producción de
ornitina decarboxilasa.!
❖
Diferencia especies de Klebsiella con Enterobacter y
Serratea. !
❖
Medio agar semi-sólido.!
❖
Inocular haciendo punción linear en el centro del agar
semi-sólido.
Agar de motilidad-indole-ornitina
❖
Resultados:!
✓
Motilidad= produce un “cloudness” del agar con
crecimiento esparcido por la línea de inoculación.!
✓
Producción de indole= añadiendo reagente Kovac.!
-
Rosa→Rojo= positivo!
* Se debe leer la decarboxilación de ornitina, la
motilidad y luego añadir el reagente Kovac.
Agar sulfato-indole-motilidad
❖
Diferencia bacterias gram-negativas en enterobacterias.!
❖
Medio de agar semi-sólido.!
❖
Inocula una línea vertical en el centro del agar.
Agar sulfato-indole-motilidad
❖
Resultados !
❖
Motilidad= “cloudness” en la línea de inoculación
(positivo).!
❖
Producción de H2S= precipitado negro (positivo).!
❖
Producción de indole= reagente Kovac. cambio de
rosa→rojo (positivo).
Agar sulfato-indole-motilidad