técnicas de laboratorio

TECNICAS DE LABORATORIO
QBI
TÉCNICAS DE
LABORATORIO
TECNICAS DE LABORATORIO
SOLUCIONES: Concentración
Cantidades, unidades y dimensiones
El Sistema Internacional de Unidades (SI) fue creado en 1960 por la Conferencia
General de Pesos y Medidas para estandarizar las unidades de medida basadas en el
sistema métrico. De esta manera, SI permite la comunicación entre científicos de
diferentes disciplinas y diferentes países sin la necesidad de conversión de unidades de
medida. El conocimiento de las cantidades, unidades y dimensiones es esencial para
comprender cómo se llevan a cabo los cálculos biomoleculares.
Una cantidad es una propiedad medible de un sistema definido (masa, temperatura,
energía). Una unidad es una cantidad de un tamaño definido que se utiliza como
referencia para otras cantidades del mismo tipo (kilogramo, mol). Una dimensión es
una cantidad física descripta por el producto de símbolos con los exponentes apropiados
(m3, mol/dm3).
Reglas básicas para el uso correcto de unidades y dimensiones
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Indicar todos los valores con sus correspondientes unidades; la relación de valores
que tienen las mismas unidades se deben indicar sin unidades ya que las mismas se
cancelan.
Sumar o restar sólo aquellos valores que tienen las mismas unidades.
No se deben hacer comparaciones de valores con diferentes dimensiones.
Se debe asignar a una determinada variable las mismas unidades a través de todos
los cálculos.
Multiplicar o dividir unidades cuando se dividen o multiplican valores; luego incluir
el producto o cociente de las unidades con el resultado calculado.
Multiplicar o dividir unidades en cada paso de un cálculo; no esperar hasta el final
del cálculo para deducir cuales serán las unidades finales.
La pendiente de una curva tendrá las dimensiones de y dividida por aquéllas de x.
Multiplicar valores tabulados o graficados por 10 o el múltiplo más adecuado para
evitar trabajar con números muy grandes o muy pequeños.
Las dimensiones del lado izquierdo de una ecuación deben ser iguales a aquéllas del
lado derecho.
El análisis de las unidades después de cada paso de un cálculo permite detectar
errores cometidos durante el cálculo.
Los resultados deben informarse sólo con los dígitos significativos
Los cálculos llevados a cabo en computadoras habitualmente rinden resultados con 10 o
más dígitos. Sin embargo, la inclusión de tantos dígitos no implica que esos resultados
sean más precisos. Para evitar la confusión de los colegas, los informes científicos
deben incluir los resultados de cálculos sólo con los dígitos que son significativos. Los
dígitos significativos en una medición son aquellos que pueden obtenerse con cierta
precisión de un determinado aparato.
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Unidades de concentración
En SI, el uso de mol l-1 y las unidades relacionadas se acepta para la expresión de
concentraciones sobre la base de cantidades de sustancia por unidad de volumen. Un
mol se define como la cantidad de sustancia que contiene las entidades elementales
equivalentes a los átomos presentes en 0.012 kg de carbono-12. Se ha demostrado
experimentalmente que 0.012 kg de carbono-12 contienen 6.02217 x 1023 átomos. Este
número es el número de Avogadro y se utiliza para definir el mol de cualquier unidad
elemental tal como átomo, molécula, ión, protón o electrón. Un mol puede ser también
definido como el equivalente del peso molecular (más correctamente a la masa
molecular en g) de una sustancia. Por lo tanto, el peso de una sustancia (su masa) y
moles pueden ser interconvertidos como se muestra en las siguientes ecuaciones:
número de moles
peso molecular =
=
peso en g
peso molecular
peso en g
número de moles
Concentración molar, mol l-1, el número de moles por litro (M) puede
expresarse como una función de las cantidades relativas de acuerdo a las siguientes
relaciones:
Molaridad, M = moles de soluto
1 litro solución
Número de moles = volumen en l x moles l-1
Peso en gramos = número de moles x Peso molecular
Peso molecular =
peso en g
número de moles
Equivalentes y normalidad no se recomiendan en SI, sin embargo son todavía
de uso común.
Normalidad, N = número de equivalentes
1 litro de solución
Número de equivalentes = normalidad x volumen en l
Las concentraciones frecuentemente se expresan como porcentaje peso/volumen
(% p/v) y se define como el peso del soluto en gramos por 100 ml de solución. De
manera similar el porcentaje peso/peso (% p/p) se define como el peso de soluto en
gramos por 100 g de solución y el porcentaje volumen/volumen (% v/v) se define como
el volumen de un líquido activo (soluto) disuelto en un segundo líquido para dar 100 ml
de solución.
ppm: partes por millón
meq: milequilaentes
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Un principio muy simple para entender las diluciones
La cantidad total de soluto en la solución concentrada es igual a la cantidad total
de soluto en la solución diluida; sin embargo, la concentración (C) de soluto es menor
en la solución diluida que en la solución concentrada.
V1 . C 1 = V 2 . C2
AGUA, CONTROL ÁCIDO-BASE Y ELECTROLÍTICO
El control de las propiedades ácido-base es importante en bioquímica
El pH de lãs soluciones es importante en bioquímica por dos razones principales.
Primero, el correcto funcionamiento de las biomoléculas depende en un grado
importante del control de pH. Segundo, cambios de pH tan pequeños como de 0.1 ó 0.2
unidades pueden causar disturbios metabólicos en ciertas células, tejidos u órganos.
Debido a la sensibilidad al pH de muchas moléculas, el control del pH es también
importante para el éxito de muchos procedimientos utilizados en los laboratorios. Esto
incluye la separación, purificación y ensayo de actividades biológicas de muchas
biomoléculas. Por ejemplo, diferentes cromatografías, electroforesis, la medición de
actividades enzimáticas y ultracentrifugación, todos requieren el uso de soluciones
buffer.
ESPECTROFOTOMETRIA
Los métodos ópticos para analizar muestras cuanti y cualitativamente se pueden
dividir en dos grupos: 1) métodos en que la muestra emite radiación por sí misma (Ej.:
reacción biológica de óxido reducción en luciérnagas) 2) métodos en los que se usa una
fuente externa de radiación que incide sobre la muestra. La radiación incidente puede
ser absorbida (análisis espectrofotométrico) o dispersada (fluorescencia). La luz
emitida es característica de cada sustancia con o sin cambio en la longitud de onda.
La espectrofotometría es utilizada principalmente en bioquímica para determinar
la concentración de un soluto en una solución, identificar compuestos desconocidos por
su espectro de absorción. Además, se pueden seguir las reacciones catalizadas por una
enzima midiendo espectrofotométricamente la aparición de producto o la desaparición
del sustrato. La concentración de soluciones de compuestos conocidos se determina
cuantificando la absorción de la luz a una o más longitudes de onda conocidas.
Cuando un rayo de luz atraviesa un medio homogéneo de espesor b, en el cual
hay especies absorbentes que están en una concentración c, parte de la luz es absorbida
y parte transmitida.
Para una determinada longitud de onda (radiación monocromática) la relación
entre luz incidente (Io) y la luz transmitida (I) está dado por la ley de Lambert-Beer:
T (transmitancia) = I / I0 = 10-ε.c.b
Se define absorbancia (A) como:
A = log T-1 = log Io / I = ε.c.b
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También se designa A como " densidad óptica", esta magnitud varía de cero para
I = Io (absorción nula) hasta para I = 0 (absorción total).
La constante k es el coeficiente de extinción (o absortividad).Es una
característica intrínseca de cada sustancia y depende de la longitud de onda, sus
unidades dependen de las utilizadas para c y b:
b: ancho de la cubeta (camino óptico de la solución)
c : concentración
ε .coeficiente de extinción molar
coeficiente de extinción molar específico
cm
M (g/l)
M-1 cm-1
1 g-1 cm-1
Si la radiación incidente no es monocromática, la ley de Lambert-Beer no se
cumple estrictamente.
Toda sustancia absorbe luz. Cuando se mide absorbancia en función de la
longitud de onda se observan picos relativamente agudos en longitudes de onda
características de la sustancia en estudio. Así, compuestos desconocidos pueden ser
identificados por su espectro de absorción en el UV, IR o Visible. El análisis químico
fotométrico se basa en general en la medición de la cantidad de luz absorbida por una
solución coloreada Si la sustancia es incolora se puede transformar en un compuesto
coloreado mediante una reacción química conveniente.
La existencia de un color se debe a la absorción en la región visible del espectro.
Por ej. Las hojas son verdes porque la clorofila absorbe el rojo y el violeta y refleja la
mayor parte del amarillo, verde y azul. Este espectro incluye no solamente el campo
visible sino también el campo de longitud de ondas largas del IR y cortas del UV. Casi
todas las sustancias absorben en el UV, las pocas que no lo hacen se usan como
solventes, agua, etanol, metanol, etc.
Regiones del espectro electromagnético:
Rayos X
UV lejano
UV cercano
Visible
Infrarrojo
0.01-15 nm
15-200 nm
200-400 nm
400-800 nm
800-2500 nm
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ESPECTROFOTOMETRO
Instrucciones de manejo:
a) Colocar el filtro correspondiente a la longitud de onda deseada (7)
b) Seleccionar la longitud de onda “WAVELENGTH” correspondiente con la
rueda 5.
c) Encender en posición TRANS (1).
d) Apretar “ZERO SET” y llevar a 0 con “ZERO” (2) manteniendo zero set
apretado.
e) Poner un tubo con H2O (volumen mínimo de medición 3 ml) (6).
f) Pasar 1 de “TRANS” a “ABS” y llevar a 0.000 de Abs con la rueda 100% T/0A”
(3). (Tiene rueda de macro y de micro).
g) Medir la muestra.
Muy importante:
Cuando se va a poner el tubo de medición se lo debe limpiar por fuera para
eliminar las gotas de solución que pudieran haberse derramado cuando se cargó el
tubo. Esto no solo dará lecturas equivocadas por incremento de los valores de extinción
sino que provocará el deterioro del aparato. No solo las partes móviles y las fotocélulas
son dañadas por reactivos corrosivos, sino que entre los contactos de las mismas se
pueden producir corrientes de la misma magnitud que las producidas por la luz. Esto
ocurre aún con muy poca humedad.
Si por algún accidente se rompiera un tubo dentro del aparato avise
inmediatamente.
Como el instrumento es sensible a las vibraciones y los colores pueden ser
inestables, es conveniente controlar el 0% T y el 100 % T cada tres mediciones.
No olvide restar el blanco a todas las lecturas, salvo que haya llevado a cero el
aparato con el blanco de reacción.
Para que un dato de absorbancia pueda ser utilizado en el cálculo de concentración
debe estar dentro de la zona en la cual la curva es lineal, esto es, en el rango de
concentraciones en el que se cumple la ley de Lambert-Beer.
Para conseguir esto puede ser necesario diluir la muestra problema.
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AISLAMIENTO Y PURIFICACIÓN DE PROTEÍNAS
Algunas consideraciones generales:
* Cualquier célula, tanto procariota como eucariota, contiene miles de proteínas
diferentes con un amplio rango de actividades biológicas. La purificación de una
proteína individual es una cuestión central para llevar a cabo el análisis biológico
detallado de su estructura y función. No existe un único procedimiento para poder aislar
en forma pura cada una de las proteínas, pero existen metodologías que permiten
distinguir a las proteínas en base a características estructurales y funcionales específicas.
Seleccionando procedimientos apropiados y aplicándolos en una determinada secuencia,
usualmente es posible obtener un alto grado de purificación de la proteína en estudio y
un aceptable rendimiento. No existe un orden estándar en la aplicación de los diferentes
procedimientos para obtener óptimas purificaciones. Debido a las diferencias
estructurales y funcionales entre proteínas, una secuencia ideal para una proteína puede
no tener éxito en la purificación de otra proteína. El conocimiento de las bases teóricas
de cada procedimiento permite al investigador elegir una secuencia inicial de técnicas a
aplicar para la purificación. De todas maneras, la puesta a punto de un protocolo
involucra experimentos de ensayo y error.
Independientemente del esquema de purificación elegido, es esencial tener
presente que la mayoría de las proteínas son moléculas excesivamente frágiles. La
exposición aún a temperaturas moderadas (ejemplo, 37ºC) causa desnaturalización, por
lo tanto, todos los pasos deben realizarse a bajas temperaturas (0-4ºC). Las proteínas
son también sensibles a pHs extremos por lo que todos los pasos de purificación se
realizan en soluciones buffer y se evitan los pH´s extremos.
Equipamiento requerido:
* Además del equipamiento usual en la mayoría de los laboratorios, tales como
pHmetros, balanzas y agitadores magnéticos, la purificación de proteínas requiere un
equipamiento más especializado.
* A los efectos de minimizar la desnaturalización y proteólisis algunos de los
pasos de la purificación deben llevarse a cabo a 4ºC. Se necesita un cuarto frío para
llevar a cabo la diálisis, precipitaciones y cromatografías. Para almacenar muestras por
períodos cortos se requiere hielo granizado, por lo tanto es necesaria una granizadora de
hielo. Para almacenar muestras y buffers son necesarias heladeras (4ºC), freezers (-15ºC
a -20ºC). En algunos casos, para preservar la actividad de muestras almacenadas es
necesario conservarlas en freezer a -70ºC.
* Espectrofotómetros que cubran un rango de 205 a 850 nm son esenciales para
cubrir un amplio espectro de proteínas. En algunos casos, la medición de actividad de
enzimas requiere contar con un registrador.
* Algunas proteínas específicas requieren equipamientos tales como contador de
centelleo, lector de ELISA, HPLC, etc.
* La electroforesis se utiliza habitualmente para evaluar la purificación de una
proteína. Se requieren fuentes de poder y los diferentes equipos de electroforesis, según
el tipo de separación a realizar.
* Para extraer las proteínas de su fuente son necesarios equipos de
homogenización (se discutirán mas adelante). Para clarificar los homogenatos se
necesitan centrífugas. Estas deben estar refrigeradas, y deben alcanzar fuerzas
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centrífugas de 15000 g y deben cubrir un rango de 100 ml a pocos litros. Son muy útiles
además, las centrífugas para tubos de 1.5 ml (Eppendorf)
* Para las cromatografías se requieren, colectores de fracciones, monitores y
registradores, bombas peristálticas y columnas de diferentes tamaños. El rango de
tamaño de diferentes columnas debe cubrir aquellos necesarios para intercambio iónico
y cromatografías de afinidad (relativamente cortas y gordas) y las que se usan para
filtración en gel (relativamente largas y finas).
* Dentro del equipo más especializado necesario para estudios específicos, se
pueden mencionar los analizadores de aminoácidos y secuenciadores de proteínas,
FPLC, HPLC, etc.
Buffers:
* En todos los pasos de una purificación es necesario controlar el pH de la
solución para evitar la desnaturalización o inactivación de la proteína.
* Los factores que se deben tener en cuenta para la elección de un buffer son los
siguientes:
+ El pH deseado.
+ Si el buffer es aniónico o catiónico. Por ejemplo, para una cromatografía de
intercambio aniónico se debe usar un buffer catiónico (por ejemplo, Tris y no fosfato)
+ Variación del pH con la fuerza iónica y la temperatura.
+ La reactividad química. Por ejemplo las aminas primarias como el Tris pueden
interferir con el análisis de proteínas o pueden inhibir algunas enzimas.
+ Absorción a 280 nm.
Costo. Especialmente si se utiliza en grandes escalas.
+ Solubilidad.
* Un "buen" buffer es biológica y químicamente no reactivo, no tóxico, no
absorbe en la región del UV y tiene una mínima dependencia con la temperatura y
fuerza iónica.
Métodos de extracción:
* Los primeros pasos en un procedimiento típico de extracción consisten en el
lavado del tejido y la aplicación de un método de lisis. Luego una centrifugación
permite separar la proteína soluble de las fracciones de membrana y de los restos
celulares. Finalmente, la muestra de proteína puede ser analizada, purificada o
almacenada.
* El tejido se lava con una solución salina para eliminar trazas de material
extracelular.
* El extracto obtenido luego de la lisis se denomina homogenato.
Habitualmente se centrífuga de 10 min a 15000 g a 1 hora a 100000 g. El sobrenadante
se denomina extracto crudo y el pellet contiene la fracción de membrana.
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* Las células animales están rodeadas exclusivamente por la membrana
plasmática y mantenidas por el citoesqueleto. Por lo tanto no tienen la rigidez de las
bacterias y levaduras. Esta fragilidad y su relativo gran tamaño simplifican la lisis.
* Las células vegetales tienen una pared compuesta por carbohidratos complejos
insolubles, ligninas o ceras que rodean la membrana plasmática.
Microfibrillas de celulosa cubren la membrana y le dan cierta protección contra
la ruptura, aunque el tamaño las hace algo más vulnerables. En las vacuolas hay
compuestos fenólicos que se liberan durante la extracción y que pueden inactivar
proteínas. Por lo tanto es esencial una extracción muy rápida de la proteína en interés.
* Las bacterias tienen una pared celular constituída por un péptido glicano que le
otorga fuerza y rigidez. Se utiliza frecuentemente lizosima en un medio isotónico para
romper el péptidoglicano.
* Homogenización: es una de las formas más comunes de lisarlos tejidos
blandos. Se puede llevar a cabo con una licuadora o con un homogenizador PotterElvenhjem. Es un método rápido y relativamente poco dañino para las proteínas. Las
principales precauciones que hay que tener se relacionan con la liberación de proteasas
de otros compartimientos celulares y con la liberación de calor.
* Sonicación: un sonicador lisa tejidos generando vibraciones que causan
ruptura mecánica de la pared celular. Se utiliza generalmente para bacterias.
* French Press: este método permite la lisis de las células sometiendo la
muestra a alta presión e inmediatamente liberarla a presión atmosférica. El rápido
cambio de presión causa la ruptura celular. Se utiliza fundamentalmente para bacterias y
levaduras.
* Moler con arena: La molienda de células con abrasivos se utiliza
frecuentemente para organismos unicelulares y tejidos vegetales. Los materiales son
económicos (mortero, arena u otro abrasivo).
* Tratamiento enzimático: la digestión de la pared celular con enzimas
(lisozima, por ejemplo) se utiliza generalmente para microorganismos ya que las células
en suspensión permiten un tratamiento relativamente uniforme.
* Otros métodos de lisis: + lisis de células animales en cultivo con detergentes.
+ Lisis por shock osmótico, sometiendo a las células a una solución hipotónica. Se
utiliza comúnmente para glóbulos rojos y otras células sin pared celular. + Lisis por
congelado y descongelado: se puede lograr la lisis mediante la aplicación de varios
ciclos de congelado y descongelado. Este método se puede aplicar si la proteína es
estable y resiste la desnaturalización. Se debe proteger contra la proteólisis.
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Fraccionamiento subcelular:
El fraccionamiento subcelular implica dos procesos:
a- ruptura de la estructura celular
b- separación de las distintas
centrifugación diferencial.
subestructuras
con
El esquema típico empleado para un fraccionamiento
subcelular es el que se representa a continuación:
Precipitado a 1000 g: Es la fracción nuclear cruda.
Contiene núcleos y células sin romper.
Precipitado a 10000 g: es la fracción mitocondrial cruda.
Contiene mitocondrias, cloroplastos, lisosomas, etc.
Precipitado a 100000 g: Es la fracción microsomal.
Contiene ribosomas, polisomas y microsomas (artificios
formados a partir de la ruptura de estructuras membranosas
como aparato de Golgi, membranas celulares, etc.)
Sobrenadante de 100000 g: es el citosol. Está
constituido principalmente por proteínas solubles, RNA y
otras moléculas como aas, proteínas, hidratos de carbono,
sales, etc. No contiene estructuras membranosas.
Figura: Centrifugaciones repetidas a velocidades progresivamente mayores
fraccionarán los extractos celulares en sus componentes. En general cuanto menor
es el tamaño del componente subcelular tanto mayor será la fuerza centrífuga
necesaria para sendimentarlo. Los valores típicos de los diversos pasos de
centrifugación mostrados en la figura son los siguientes:
Vel baja: 1.000 veces
la gravedad (g), 10 min.
Vel media: 20.000 g, 20 min
Vel. alta: 80.000 g , 1 hora
Vel muy alta: 150.000 g, 3 horas
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Determinación de la concentración de proteínas:
* Muchas veces es útil, aunque no esencial, determinar la concentración total de
* Es importante recordar que todos los métodos empleados para la
determinación de la concentración de proteínas son semicuantitativos. La respuesta de
las proteínas, por ejemplo en el desarrollo del color en un ensayo espectrofotométrico,
varía con la composición de aas y puede ser influenciado por la presencia de grupos
prostéticos no proteicos, tales como carbohidratos. De tal forma que, si bien la
seroalbúmina bovina (BSA) se utiliza universalmente como proteína standard para las
cuantificaciones, es preferible, cuando esto es posible, calibrar el ensayo usando una
muestra de la proteína purificada o una proteína que rinda una coloración similar.
* Absorbancia a 280nm: La mayoría de las proteínas exhiben un máximo de
absorción a 280nm que se atribuye al grupo fenólico de la tirosina o al grupo indólico
del triptofano. El coeficiente de extinción a 280 nm varía de proteína en proteína en el
rango de 0.4 a 1.5 dependiendo de la composición de aas. Existen casos extremos en el
que el coeficiente de extinción es 0 (proteínas que ligan calcio) y 2.5 (lisozima). Se
trata, por lo tanto, de un método poco preciso. Esta técnica es relativamente poco
sensible y requiere entre 0.05 y 2 mg de proteína. Es particularmente sensible a las
interferencias de otros compuestos que absorben a 280 nm, especialmente ácidos
nucleicos. La ventaja de éste método es que es muy rápido y no destructivo, por lo tanto
la muestra puede ser usada para otras determinaciones. Se requieren cubetas de cuarzo.
* Método de Biuret y µBiuret: bajo condiciones alcalinas el ión cobre (II) se une
al nitrógeno del enlace peptídico de proteínas y péptidos desarrollando una coloración
violeta con un máximo de absorción a 540-560 nm. No da interferencia con aas libres y
tiene poca dependencia de la composición de aas. Ya que el reactivo de cobre reacciona
con el enlace peptídico y no con las cadenas laterales de los aas la mayor desventaja del
método es su baja sensibilidad (1-10 mg/ml de proteínas). Algunos buffers (Tris, por
ejemplo) pueden interferir con la reacción.
* Se logra más sensibilidad leyendo a 330 nm (rango 0,1-1 mg)
* Método de Lowry: es el método más utilizado. El fundamento del método se
basa en la reducción del reactivo de Folin por la oxidación de aas aromáticos en una
reacción catalizada por cobre. La reacción da una fuerte coloración azul y es más
sensible que el método de Biuret (0.1 a 1 mg/ml). La eacción depende del pH (10-10.5).
La reacción tiene una moderada dependencia con la composición de aas pero tiene
muchos compuestos que interfieren (aas, buffers, lípidos, azúcares, ácidos nucleicos).
* Método de Bradford: Bajo apropiadas condiciones, los grupos acídicos y
básicos de las proteínas interaccionan con grupos disociados de colorantes orgánicos
para formar precipitados coloreados. En éste método se utiliza el colorante Coomasie
Blue G-250. La unión del colorante a la proteína causa un cambio en el máximo de
absorción del colorante de 465 nm (rojo) a 595 nm (azul). Es un método rápido y
simple. Es muy sensible (5-100 µg/ml). Tiene una significativa dependencia con la
composición de aas debido a la unión primaria a grupos básicos (especialmente
argininas) y a residuos aromáticos.
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Elección de los métodos de purificación:
* Hay numerosos métodos de purificación disponibles, aunque algunos se
utilizan mucho más frecuentemente que otros. A continuación se mencionan algunos
criterios para la aplicación de una determinada secuencia de los métodos.
a) Los primeros pasos en un esquema de purificación son frecuentemente
aquellos que tienen menor poder de resolución tales como la precipitación con sulfato
de amonio o para algunas proteínas, la desnaturalización por calor. Estos métodos tienen
la ventaja de reducir notablemente la cantidad de proteína total en la muestra.
Los métodos de alta resolución pero baja capacidad (ejemplo isoelectroenfoque) se
aplican en la parte final del esquema de purificación, cuando la cantidad de proteína
total es baja y las proteínas contaminantes están en muy bajas concentraciones.
b) En general es más eficiente utilizar una serie de métodos que exploten
propiedades físicas y funcionales de las diferentes proteínas, más que una serie de
métodos que exploten las mismas propiedades. Así, cuando se utilizan técnicas
cromatográficas, se debe incluir al menos un fraccionamiento por peso molecular
(filtración en gel) y al menos un paso de fraccionamiento por carga (cromatografía de
intercambio iónico).
c) Durante la cromatografía es común sacrificar algo de rendimiento para
aumentar la pureza. En otras palabras, no hay que tratar de recuperar toda la proteína en
estudio si esto significa incluir cantidades relativamente grandes de proteínas
contaminantes.
d) Algunas técnicas, en particular SDS-PAGE (electroforesis en geles de
poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes), isoelectroenfoque y geles
bidimensionales, no se emplean comúnmente como métodos preparativos para la
purificación de proteínas, sino que usualmente se emplean para analizar el progreso de
la purificación. Son técnicas analíticas de gran resolución.
Procedimientos experimentales:
Desnaturalización por calor: La purificación de proteínas se lleva a cabo
habitualmente a bajas temperaturas ya que la mayoría de las proteínas son estables entre
0 y 4ºC. A medida que la temperatura se incrementa desde 0 a 37-40ºC su estabilidad
decrece significativamente. Sobre los 40ºC la mayoría de las proteínas son altamente
inestables, se desnaturalizan y usualmente precipitan. Sin embargo, cada proteína
individual difiere en la sensibilidad al calor. La estabilidad a la temperatura de una
enzima se determina experimentalmente en extractos después de la incubación a
diferentes temperaturas a varios tiempos. Si la proteína en estudio es resistente a
relativamente altas temperaturas, este tratamiento podrá ser utilizado como paso de
purificación.
Precipitación con sulfato de amonio: La solubilidad de las proteínas varía de acuerdo
a la fuerza iónica y por lo tanto de acuerdo a la concentración de sales de la solución. Se
pueden observar dos efectos diferentes. A bajas concentraciones de sales, la solubilidad
aumenta cuando se incrementa la concentración de sales. Este fenómeno se denomina
"salting-in". Sin embargo cuando la concentración de sales aumenta mucho la
solubilidad de las proteínas decrece y en un punto determinado toda la proteína
precipita. Este fenómeno se denomina "salting-out". Las bases teóricas del "Salting-out"
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son complejas pero un factor es probablemente la competencia entre la proteína y los
iones por el agua disponible. A altas concentraciones de sales, no hay suficientes
moléculas de agua disponibles para una completa solvatación de las proteínas y por lo
tanto las interacciones proteína-proteína son predominantes sobre las interacciones
agua-proteína y ocurre la precipitación. Ya que las proteínas difieren marcadamente en
su solubilidad a alta fuerza iónica, salting-out es un procedimiento muy útil para la
purificación de proteínas. La precipitación con sulfato de amonio se emplea
frecuentemente como uno de los primeros pasos en el esquema de purificación.
Filtración en gel: Un amplio rango de biomoléculas pueden separarse sobre la base de
sus diferencias de tamaño y forma. Este procedimiento se conoce con el nombre de
cromatografía de exclusión molecular o filtración en gel. Se pueden utilizar una amplia
gama de matrices formadas por bolitas porosas de material inerte y altamente hidratado.
Las matrices comerciales más comunes son Sephadex (bolitas de dextrano), Sepharosa y
Bio Gel A (agarosa) y Bio Gel P (poliacrilamida). Cada matriz tiene un rango de de
fraccionamiento que está determinado por el tamaño del poro de las bolitas. Así por
ejemplo, Sephadex G-50 tiene un límite de exclusión de 30.000, lo que significa que
todas las proteínas cuyo PM sea superior a 30.000 no podrán penetrar en el interior de
las bolitas y serán eluídas primero, en lo que se denomina volumen muerto de la
columna. Las proteínas de menor PM quedarán incluidas en la matriz. Cuanto menor
sea su PM tendrán mayor facilidad para penetrar en el interior de gel lo que determinará
un mayor número de intercambio y una menor velocidad de elusión. Se denomina
volumen de elusión al volumen en el que eluye una proteína en particular.
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Vo
Vo-Vt
Vt
Kav = Ve-Vo / Vt-Vo
Kd = Ve-Vo / Vt-Vo-Vmatriz = Ve-Vo / Vi
R = coeficiente de retención = Vo-Ve
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Cromatografía de intercambio iónico: una resina de intercambio iónico es una matriz
insoluble con grupos cargados unidos covalentemente. Se disponen comercialmente de
matrices cargadas positiva y negativamente. Las matrices cargadas negativamente ligan
iones cargados positivamente (cationes). Las resinas pueden ligar un tipo de catión
pero, ante la presencia de un segundo tipo de catión lo desplazan o intercambian con el
primero. De manera similar, las resinas de intercambio aniónico están cargadas
positivamente y ligan (e intercambian) iones cargados negativamente. El
fraccionamiento de proteínas por columnas de intercambio iónico depende de la
diferencia en las cargas de las distintas proteínas. La carga de una proteína depende del
número y tipo de grupos ionizables. Para cualquier proteína al pH correspondiente a su
punto isoeléctrico no se unirá a ningún tipo de intercambiador aniónico. Por encima de
ese pH la proteína estará cargada negativamente y se unirá a un intercambiador
aniónico. Por debajo de ese pH, estará cargada positivamente y se unirá a un
intercambiador catiónico. Para eluir las proteínas retenidas en la matriz se puede
modificar el pH del medio o bien modificar la fuerza iónica aumentando la
concentración de sales. Esta última es la condición frecuentemente utilizada.
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Cromatografía de afinidad: este tipo de cromatografía es la más específica. La matriz
es usualmente agarosa, poliacrilamida o dextrano, a la cual se une covalentemente un
ligando específico. La naturaleza química del ligando está determinada por alguna
propiedad específica y conocida de la proteína en estudio. En el caso de una enzima, el
ligando elegido es generalmente el sustrato o un inhibidor o activador que se unen
reversiblemente a la enzima. En teoría, la cromatografía de afinidad permitiría la
purificación de una proteína en un único paso. Sin embargo en la práctica esto casi
nunca se logra, aunque el grado de purificación que se alcanza es muy bueno.
Desafortunadamente en muchos casos no se conoce ninguna propiedad de la proteína en
estudio o no se dispone de algún ligando que permita la preparación de una columna de
afinidad.
ELECTROFORESIS
PAGE: cualquier ión o grupo cargado si es sometido a un campo eléctrico migra a una
velocidad determinada. Ya que las proteínas tienen una carga neta a cualquier pH
diferente a su punto isoeléctrico, ellas también migrarán y su velocidad de migración
dependerá de la densidad de carga (relación carga/masa). A mayor relación carga / masa
mayor velocidad de migración. El medio más frecuentemente utilizado las para
electroforesis es poliacrilamida. La poliacrilamida resulta de la polimerización de
monómeros de acrilamida en cadenas largas y entrecruzamiento de estas cadenas por
compuestos bifuncionales como la bis-acrilamida. Esta reacción crea una matriz porosa
con un tamaño de poro controlado. La forma de controlar el tamaño del poro es
modificando la concentración de acrilamida y bis-acrilamida. Así, durante la
electroforesis en geles de poliacrilamida, las proteínas están sometidas a un efecto de
filtrado molecular, por el cual las proteínas más grandes migran más lentamente en
relación a las proteínas menores. Por lo tanto la separación de proteínas nativas en
buffers no disociantes depende tanto de la carga como de la masa de proteína.
Aunque la electroforesis, en condiciones nativas o desnaturalizantes, es útil en un
número de situaciones, especialmente cuando se desea detectar una proteína particular a
través de su actividad biológica, en la mayoría de los estudios se utilizan condiciones
que disocian a las proteínas en sus subunidades. El agente de disociación mas
frecuentemente utilizado es SDS (sodium dodecyl sulfate). La electroforesis en PAGESDS permite un rápido análisis de la composición de una mezcla de proteínas y es
extremadamente útil para monitorear la pureza de la muestra durante su purificación.
TECNICAS DE LABORATORIO
Para el análisis en PAGE-SDS, la muestra se desnaturaliza por calor a 100 ºC durante 2
a 5 min, en presencia de un exceso de SDS y 2-β-mercaptoetanol (para clivar los
puentes disulfuro). Bajo estas condiciones, la mayoría de los polipéptidos se unen al
SDS en una relación 1.4 g de SDS por gramo de polipéptido. Como consecuencia de
esto el detergente le otorga a la proteína una carga neta negativa que hace insignificante
la carga intrínseca del polipéptido. Ya que la distancia de migración de los
polipéptidos es inversamente proporcional al log del peso molecular, la proteína de
interés puede ser identificada en el gel si se conoce el PM de las subunidades que la
constituyen, o inversamente, puede determinarse el PM de cada subunidad.
Parámetros de purificación: Tabla de Purificación.
Muestra
Homog.
Vol Proteínas Proteínas Actividad Actividad Actividad Purificación Rendimiento
Totales
Total
Específica
ml mg/ml
mg
U/ml
U
U/mg
%
A
1
Paso de
Purificación
(PP)
A
A:
Activdad total
Masa de Proteínas
C:
Actividad total PP
Actividad total Homog
B:
B
Actividad específica PP
Actividad específica Homog
C
TECNICAS DE LABORATORIO
ESPECTROMETRÍA DE MASAS
La espectrometría de masas (MS) permite analizar la composición de diferentes elementos químicos e
isótopos atómicos, separando los núcleos por su relación masa-carga. En el caso de la identificación de la
estructura primaria de las proteínas, la MS presenta numerosas ventajas frente al método de Edman: es
más sensible, permite analizar directamente las mezclas proteicas y ofrece un mayor rendimiento por
muestra. Por ello, es el método utilizado en las dos técnicas de identificación de proteínas más comunes:
la identificación por huella peptídica y el análisis MS/MS (solo veremos el primero).
Identificación por huella peptídica
Se puede partir de proteínas separadas en gel o proteínas en solución. En cualquiera de los casos, se añade
una proteasa con un patrón de corte conocido (típicamente, tripsina), generándose una colección o
conjunto de péptidos. Habitualmente, esta colección de péptidos será lo suficientemente específica como
para poder identificar la proteína con la que estamos trabajando.
Los péptidos trípticos son analizados por MS en un equipo denominado MALDI-TOF (MALDI por sus
siglas en inglés Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization y TOF por el nombre en inglés del detector:
time of flight). En este equipo cada péptido tiene un tiempo de permanencia o “tiempo de vuelo”
inversamente proporcional a su masa.
Por último se realiza la comparación del espectro de masas con la información almacenada en bases de
datos de secuencias conocidas, como Swiss-Prot o nr-GenBank. Para ello existen motores de búsqueda
como MASCOT (http://www.matrixscience.com/search_form_select.html) que ordenan las proteínas
identificadas asignándoles puntos en función del número de coincidencias entre las masas de los péptidos
de la proteína a identificar, con la masa de los péptidos trípticos teóricos de las proteínas de la base de
datos.
TECNICAS DE LABORATORIO
ESTRUCTURA DE PROTEÍNAS
Amino ácidos - Notas claves
Amino ácidos Todas las proteínas están formadas por el mismo juego estándar de 20
aas. Un aa típico tiene un grupo amino primario, un grupo carboxilo, un átomo de
hidrógeno y una cadena lateral (grupo R) unidos a un átomo de carbono α central (Cα).
La prolina es la excepción a esta regla por poseer un grupo amino secundario.
Enantiómeros Los 20 aas, excepto la glicina, tienen cuatro grupos diferentes ordenados
tetraédricamente alrededor del átomo de Cα y por lo tanto pueden existir en
configuración D o L. Estos dos enantiómeros son imágenes especulares que sólo pueden
distinguirse sobre la base de su diferente rotación de la luz polarizada en el plano. Sólo
los isómeros L se encuentran en las proteínas.
Los 20 aa’s estándar tienen diferentes grupos R y muestran diferentes propiedades
físico-químicas (polaridad, acidez, basicidad, aromaticidad, tamaño, inflexibilidad
conformacional, habilidad de formar puentes hidrógeno, habilidad de entrecruzamiento
y reactividad química).
Glicina (Gly, G) tiene un átomo de hidrógeno como grupo R.
Alanina (Ala, A); valina (Val, V); leucina (Leu, L); isoleucina (Ile, I) y metionina
(Met, M) tienen grupos R alifáticos de diferentes estructuras, hidrofóbicos y
químicamente inertes.
Fenilalanina (Phe, F); tirosina (Tyr, Y) y triptofano (Trp, W) tienen grupos R
aromáticos de naturaleza hidrofóbica.
Prolina (Pro, P) tiene un grupo R alifático unido al grupo amino (imino ácido). Es
conformacionalmente rígida.
Cisteína (Cys, C) tiene un grupo R que contiene azufre. Es un grupo R hidrofóbico,
altamente reactivo, que puede formar un enlace disulfuro con otro residuo de cisteína.
Arginina (Arg, R) y lisina (Lys, K) son aas básicos con grupos R
cargados
positivamente, mientras que el grupo R de la histidina (His, H) puede estar cargado
positivamente o sin carga a pH neutro.
Acido aspártico (Asp, D); ácido glutámico (Glu, E) tienen grupos R ácidos, cargados
negativamente a pH neutro.
Asparagina (Asn, N) y glutamina (Gln, Q) tienen amidas como grupos R. Serina (Ser,
S) y treonina (Thr, T) tienen hidroxilos en sus grupos R. Todos estos aas son polares y
sin carga y pueden formar puentes hidrógeno.
Datos útiles:
* El β-mercaptoetanol reduce las cistinas rompiendo los puentes disulfuro y el SDS
otorga carga homogénea a las proteínas determinando que corran exclusivamente por su
tamaño.
* PM promedio de un aminoácido = 120; de la glucosa libre = 180; de la glucosa
formando parte de la cadena = 162.
* tripsina corta dejando libre el carboxilo de Arg y de Lys.
* Quimotripsina corta dejando libre el carboxilo de Phe, Tyr y Trp.
* Bromuro de cianógeno rompe enlaces peptídicos con carbonilo aportado por met.
* Cistina = Cys (S-S)Cys
TECNICAS DE LABORATORIO
Disociación de grupos ionizables de aminoácidos
GRUPO
- carboxilo (Ct)
- amino (Nt)
- carboxilo (Glu,Asp)
- amino (Lys)
- OH fenólico (Tyr)
- Imidazol (His)
- Guanidinio (Arg)
- Sulfidrilo (Cys)
aa libre
1.8-2.5
8.9-9.7
3.8-4.3
10.5
10.1
6
12.5
8.3
RANGO de pK
En polipéptido
1.8-2.5
7.5-8.5
3.0-4.7
9.4-10.6
9.8-10.4
5.6-7.0
11.6-12.6
9.4-10.8
CATALISIS BIOLÓGICA: ENZIMAS
Notas claves
Termodinámica
Energía de activación y estado de transición
Cambio en energía libre: La diferencia en el nivel de energía entre sustratos y productos se
denomina cambio en la energía libre de Gibbs (∆G). Un ∆G negativo indica que la reacción es
termodinámicamente favorable en la dirección indicada, mientras que un ∆G positivo indica
que la reacción no es termodinámicamente favorable y requiere la entrada de energía para que
la reacción proceda en la dirección indicada.. Si el cambio en energía libre (∆G) de una
reacción es negativo, dicha reacción puede ocurrir espontáneamente. Una reacción
energéticamente desfavorable es conducida frecuentemente por el acoplamiento a una
reacción energéticamente favorable, como por ejemplo la hidrólisis de ATP.
Equilibrio químico: Una reacción química frecuentemente existe en un estado de equilibrio
dinámico. La constante de equilibrio (K) define la relación de las concentraciones de sustrato
y productos en el equilibrio. Las enzimas no alteran el equilibrio sino que aceleran el logro
del equilibrio aumentando la velocidad de las reacciones en ambos sentidos.
Introducción a las enzimas
• Catalizadores
• Sitio activo
• Especificidad por sustrato
• Clasificación
• Medición de actividad
• Isoenzimas.
Cinética enzimática
Velocidad de la reacción enzimática. La actividad enzimática se expresa comúnmente como
la velocidad inicial (V0) de la reacción catalizada. Las unidades de V0 son umol min-1, que
puede ser también representada por la unidad (U) o el katal (kat) (1 umol min-1 = 1U = 16.67
nanokat). El término actividad (actividad total) se refiere a las unidades totales de enzima en
la muestra, mientras que la actividad específica es el número de unidades por miligramo de
proteína (U mg –1).
TECNICAS DE LABORATORIO
Relaciones entre diferentes concentraciones de sustratos y las velocidades de reacción
Relaciones entre diferentes concentraciones de la enzima y las velocidades de reacción
Efecto de la Temperatura y el pH sobre la velocidad de reacción
Modelo de Michaelis-Menten: Supuestos en los que se basa el modelo, significado de los
parámetros de la ecuación de Michaelis y su relación con los parámetros que describen las
siguientes ecuaciones:
V0 =
Vmax [S]
Km + [S]
Lineweaver-Burk y la determinación experimental de Km y Vmax
Inhibición enzimática Inhibición reversible e irreversible, competitiva y no competitiva. Características y análisis de
los parámetros cinéticos
Regulación de la actividad enzimática
Regulación feedback y moléculas efectoras. En algunas vías metabólicas, los productos
finales son frecuentemente inhibidores “feedback” de las primeras etapas de la misma vía
para evitar la acumulación de intermediarios y el uso innecesario de metabolitos y energía.
Enzimas alostéricas, propiedades: Modificaciones covalentes reversibles, Activación
proteolítica Síntesis y degradación.
ESTRUCTURA DE HIDRATOS DE CARBONO
Monosacáridos y disacáridos – Notas claves
•
Aldosas y cetosas
•
Estereoisómeros
•
Estructuras cíclicas
•
Disacáridos
•
Derivados
•
Nomenclatura
Polisacáridos y oligosacáridos – Notas claves
•
Polisacáridos
•
Glucógeno
•
Almidón
•
Dextrano
•
Celulosa
•
Oligosacáridos
Método de identificación y secuenciación
TECNICAS DE LABORATORIO
Determinación de azúcar reductor
Uno de los problemas más importantes en la investigación bioquímica es la necesidad de
contar con métodos analíticos adecuados.
Los materiales biológicos con los que se trabaja normalmente distan mucho de ser simples, lo
que determina que los métodos empleados para la determinación de una sustancia en
particular tengan en cuenta las probables interferencias.
Uno de los métodos analíticos sumamente importante en la resolución de muestras de
azúcares es la determinación de azúcares reductores.
El tratamiento de glucosa con álcali diluido, rinde una mezcla en equilibrio de glucosa,
fructosa y manosa. Esta reacción tiene lugar con intervención de formas enólicas
intermediarias, llamadas enodioles (isomerización en el C1 y C2)
H
O
C
H
H
C
OH
H
C
OH
Aldosa
H
H
C
OH
C
OH
C
OH
Enodiol
H
H
C
OH
C
O
C
OH
Cetosa
Isomerización de azúcares por tratamiento con álcali.
Los azúcares con el grupo carbonilo libre son los capaces de formar el enodiol intermediario
en medio alcalino, y por ende son reductores ya que es ese intermediario la forma reactiva de
los azúcares en una reacción de óxido-reducción.
Uno de los métodos más utilizado para la determinación de azúcar reductor es el de SomogyNelson.En este método se produce la reducción del ion Cu2+ a Cu2O por acción de los
azúcares en medio alcalino y caliente. Luego por acción del Cu2O sobre el reactivo de Nelson
(arsenomolíbdico) se forma un complejo coloreado, en el que el Mo se ha reducido. Este
complejo se determina espectrofotométricamente a 540 nm.
SECUENCIACIÓN DE OLIGOSACÁRIDOS
Para analizar un oligosacárido se deben tener en cuenta los siguientes puntos:
a) composición de azúcares.
b) sitios de unión glicosídica.
c) configuración anomérica de los enlaces glicosídicos.
a) Composición
El primer paso en la secuenciación es determinar la composición de monosacáridos. Para
hidrolizar la cadena de oligosacáridos se utilizan principalmente dos métodos:
1) Se puede utilizar una solución acuosa ácida para liberar los monosacáridos (ClH 2-4 N
durante 3-6 horas a 100 ° C).Luego de la hidrólisis ácida, los monosacáridos liberados se
transforman en derivados (acetatos) y se los analiza por cromatografía gaseosa con
espectrometría de masas.
2) Un método alternativo al método anterior es utilizar cloruro de metilo anhidro, que es
menos destructivo.
TECNICAS DE LABORATORIO
b) Uniones glicosídicas
Otro paso importante en la secuenciación de un oligosacárido es conocer el tipo de enlace
entre cada monómero. Cada monosacárido está unido a uno de sus vecinos a través del C1
anomérico y por otro átomo de C a otro monosacárido. En el caso de las cetosas la unión se
hace a través del C2. La posición de las uniones glicosídicas se determina por metilación
exhaustiva.
En esta reacción se metilan los hidroxilos libres, es decir aquello que no están involucrados en
uniones.Luego el oligosacárido metilado se hidroliza para romper las uniones glicosídicas y
los nuevos hidroxilos libres son acetilados.
H2 COH
OH
O
H2 COH
+
H3 COH H
OH
OH
OH
α-D-glucopiranosa
OH
O
OH
OCH 3
OH
Metil-α-D-glucopiranósico
(CH3)SO4
NaOH
(a) Metil a 2,3,4,6, tetra-O-metilD-glucopiranósido
(b) 2,3,4,6, tetra-O-metil-Dglucopiranosa
H COCH
2
3
(a)
OMe
MeO
O
OMe
OMe
H2COMe
H CL
diluido
(b)
MeO
OMe
O
OH
OMe
c) Configuración anomérica y secuenciación
Para la secuenciación se pueden utilizar métodos enzimáticos y químicos. Para las
determinaciones enzimáticas se utilizan exoglicosidasas específicas para tipos de uniones y
tipo de azúcares.
Para ello el oligosacárido se trata en forma secuencial con una serie de enzimas específicas
para uniones y azúcares. Cada enzima puede liberar los azúcares terminales, dependiendo de
la secuencia y del tipo de enlace ( y ).
La información que se obtiene con el tratamiento de las exoglicosidasas se confirma por los
análisis de metilación exhaustiva.
La ventaja del uso de las exoglicosidasas es que es una técnica muy sensible y debido a la
especificidad de las enzimas es posible conocer en gran detalle la estructura de oligosacáridos
complejos
Acción del ácido periódico
El ácido periódico produce oxidación de dioles vecinales, hidroxi vecinales y carbonilos
vecinales. De acuerdo a los productos obtenidos se puede determinar el tamaño del anillo
(anillo de 6 C o 5 C), o el lugar de las ramificaciones.
La acción del IO4H produce liberación de ácido fórmico o formaldehído, según la estructura
del azúcar. El ácido fórmico liberado es titulado con NaOH para cuantificarlo.
Los moles de ácido fórmico liberado dan una medida de los extremos no reductores que
presenta el oligosacárido.
TECNICAS DE LABORATORIO
1
1
mol oligosacárido
mol oligosacárido oxidado
3  moles ácido fórmico
1
mol fomaldehído
En el caso particular de analizar un oligosacárido con enlaces 1Æ 4 se obtendrían los
siguientes compuestos
H2 COH
OH
H2 COH
O
OH
O
O
OH
C
O
H
C
O
H
C
O
H
O
H
C
OH
C
O
O
H
N
C
O
N
C
O
OH
H2 COH
O
O
3H
C
OH
+7 HIO4
H2COH
O
CH
OH
OH
O
OH
H2COH
O
O
H2 COH
O
OH
O
H2 COH
O
OH
O
+1 HC
O
C
O
H
H
+ 7 HIO3
Si las uniones fueran diferentes hay que analizar los sitios de acción del periodato y los
productos obtenidos
Determinación de la estructura de mono- di - y polisacáridos
Método
Uso de enzimas específicas:
Maltasa (uniones alfa)
Emulsina (uniones beta)
Información obtenida
Uniones alfa o beta
Reacción con agua de bromo
(Br2 /H2O)
Aldosa libre
Reducción de Cu 2+ o Ag +
Azúcar reductor
Metilación exhaustiva
Tratamiento con IO4H
Hidrólisis ácida (H+ /H2O)
Estudio de las unidades
Por separado
Tamaño del anillo (mono)
N° e identidad de unidades
(di- y poli-)
Oxidación de aldehídos libres
Metilación exhaustiva
Sitios de unión entre unidades
e hidrólisis.
Tratamiento con IO4H
_______________________________________________________________
TECNICAS DE LABORATORIO
METABOLISMO ENERGÉTICO:
Los problemas propuestos para contribuir al conocimiento y comprensión del
metabolismo energético de células animales y vegetales se han organizado en cuatro guías
que se detallan a continuación. Finalizada cada una de ellas se recomienda al estudiante
integrar los conceptos aplicados con los utilizados previamente dentro del bloque. Para
realizar esta integración se propone seguir el esquema de las figuras 1 y 2.
Conocimientos y conceptos a utilizar para la resolución de las guías de problemas:
a- Estructura de Hidratos de carbono: métodos para su análisis
b- Enlaces de alta energía: ATP, transporte de electrones: fosforilación oxidativa,
fotosíntesis: Fase lumínica y fase oscura
c- Ciclo de Krebs: reacciones de oxidorreducción y coenzimas de nicotinamida,
localización y función biológica. Termodinámica, sistemas acoplados
d- Glucólisis y Gluconeogénesis: regulación, balance energético.
Figuras 1, 2 y 3obtenidas de “Molecular Cell Biology” Albert y col.
Figura 1
TECNICAS DE LABORATORIO
Figura 2
Figura 3
TECNICAS DE LABORATORIO
LÍPIDOS
Estructura y función de los ácidos grasos
Notas claves
Estructura y propiedades
Nomenclatura
Funciones
Prostaglandinas
Introducción
Los lípidos son compuestos primarios en las células, donde funcionan como elementos
estructurales de las membranas y de tejidos especializados como el nervioso, reserva
energética, activadores específicos de enzima, transportadores de restos carbohidratos
en la síntesis de glicoproteínas y como reguladores de funciones orgánicas (vitaminas
liposolubles o el grupo de hormonas esteroides).
Con el nombre de lípidos se agrupan compuestos biológicos químicamente
heterogéneos caracterizados por la presencia, en su estructura, de compuestos
parafínicos como son principalmente los ácidos grasos o cadenas similares, que por su
carácter hidrofóbico les confieren la característica solubilidad en solventes neutros
/orgánicos) y la insolubilidad en agua. También integran la estructura de distintos
lípidos compuestos tan variables como el glicerol, aminoalcoholes (etanolamina),
aminoácidos (serina), ácido fosfórico, monosacáriodos y oligosacáridos, que introducen
en los lípidos grupos polares hidrofílicos que les imparten propiedades químicas y
físicas características. Con estructuras tan diferentes la solubilidad de los lípidos es muy
variada ofreciendo las bases para su fraccionamiento.
Preparación de extractos lipídicos
1) Extracción: Debido a las características estructurales de los lípidos su extracción de
diferentes materiales biológicos se realiza con mezclas de solventes orgánicos
adecuadas.
Un método general para extraer lípidos de tejido húmedo consiste en el uso de la mezcla
cloroformo:metanol en proporción 2:1, seguido de una filtración y posterior lavado.
2) Partición: La fracción no lipídica se remueve particionando con un solvente polar. El
filtrado obtenido se mezcla con 0,2 volúmenes de agua o una solución salina (Cl2Ca
0,003 N). Se obtienen entonces dos fases que se separan por centrifugación . La fase
superior con el material contaminante no lipídico se descarta y la fase inferior que
contiene los lípidos se lava con una mezcla de solventes.
Una vez obtenida la fracción lipídica se procede a su concentración por evaporación del
solvente bajo una atmósfera de nitrógeno.
3) Separación: uno de los principales métodos utilizados para separar e identificar las
distintas clases de lípidos es la cromatografía en capa delgada (TLC). Con este método
se pueden separar sustancias hidrófilas y sustancias hidrófobas (lípidos).
TECNICAS DE LABORATORIO
La TLC usa generalmente sílica gel como adsorbente, esta fase fija se suspende en agua
y deposita sobre placas de vidrio ( o metálicas o plásticas) que luego de secarse queda
adherida como una capa delgada de 0,1 a 2 mm de espesor. El disolvente o fase móvil
es en general una mezcla de solventes elegido de acuerdo a los lípidos que se vaya a
separar.
Se deja correr el cromatograma y los compuestos presentes en el extracto estarán a
distintas distancias desde el origen. Esto dependerá de su estructura química, de la
naturaleza del adsorbente y la composición del solvente.
Dado que los compuestos separados son incoloros, el cromatograma se revela con algún
reactivo especial de manera de detectar las manchas.
Se deben sembrar en el mismo cromatograma compuestos standard para comparar la
posición (Rf) de estos compuestos con las distancias de las manchas correspondientes a
los compuestos del extracto.
Rf : Relación de frente: Movimiento relativo de un compuesto con respecto al frente
alcanzado por el solvente. Es una propiedad característica y reproducible.
d) Revelado: uno de los reactivos más utilizado para revelar los lípidos es el vapor de
iodo, debido a su propiedad de unirse a los dobles enlaces de los ácidos grasos
insaturados. (Aparecen manchas marrones sobre un fondo amarillo). FIG. 1
e) Densitograma: Una vez realizado el análisis cualitativo del cromatograma se realiza
su cuantificación mediante un densitograma.
Luego de identificar los compuestos se puede raspar la zona de la mancha del
cromatograma y eluirla para su posterior cuantificación.
Cromatografía de ácido silícico
Otra técnica ampliamente usada para la separación de los compuestos lipídicos de un
extracto es la cromatografía en columna de ácido silícico.
Según este método los lípidos están generalmente más fuertemente adsorbidos a medida
que la polaridad aumenta, desde hidrocarburos hasta los fosfolípidos.
Para eluírlos de la columna se va incrementando la polaridad del solvente. FIG 2
Cromatografía en fase gaseosa
La cromatografía en fase gaseosa es particularmente apropiada para la separación de
gases y líquidos volátiles o sólidos en estado gaseoso. se emplea para analizar cuali y
cuantitativamente mezclas de ácidos grasos de esteroles, de hidrocarburos así como de
otros compuestos que son volátiles o pueden convertirse químicamente en derivados
volátiles. La cantidad de muestra necesaria para el análisis está en el orden de los
microgramos.
Las separaciones son función distribución diferencial de las moléculas del soluto entre
el flujo de gas inerte (nitrógeno, argón) que es la fase móvil y un sólido o un líquido
dispuesto sobre un sólido que constituye la fase estacionaria. Los compuestos que van
siendo separados abandonan la columna a determinados y diferentes tiempos (tiempo de
retención de cada componente) y son medidos a la salida de la columna por un detector.
El detector más empleado y de mayor sensibilidad es el detector de ionización de llama.
TECNICAS DE LABORATORIO
Fig.1
Fig.2
TIPOS DE CENTRIFUGACIÓN
a) Centrifugación diferencial: Se emplea comúnmente como metodología inicial para
el aislamiento de fracciones celulares (mitocondrias, núcleos, etc.)
b) Centrifugación isopícnica diferencial de equilibrio: Separa las partículas por su
densidad. Generalmente para la preparación del gradiente se usan sales de metales
pesados, como por ejemplo cesio o rubidio, si bien también puede utilizarse
sacarosa. La muestra se mezcla homogéneamente con una disolución concentrada de
CsCl. La centrifugación de la misma produce un gradiente de concentración de sal
y por lo tanto un gradiente de densidad que se forma debido a la gran masa del ión
cesio. Entonces tiene lugar la redistribución de las moléculas en el gradiente y el
campo centrífugo las lleva hacia una región en la que la densidad de la disolución es
igual a su propia densidad de flotación.
TECNICAS DE LABORATORIO
c) Centrifugación zonal: El principio se separación es por el coeficiente de
sedimentación (S) de las partículas. Implica la formación de una capa de la muestra
en un gradiente de densidad líquido continuo. La muestra se somete a
centrifugación hasta que se haya efectuado la separación deseada, esto es, antes de
su sedimentación completa, pero después del tiempo suficiente para que las
partículas se hayan trasladado por el gradiente para formar zonas o bandas discretas.
Centrífugas preparativas
a) De uso general máxima: 6.000rpm (6.000 g). Los rotores pueden ser de ángulo
fijo o de ángulo móvil. Difieren solamente en su capacidad de carga (tubos de 10,
50 y 100 ml).
b) De alta velocidad: velocidad máxima 25.000rpm (89.000 g). La cámara del rotor
está refrigerada para eliminar el calor producido por la fricción entre el aire y el
rotor.
c) Ultracentrífuga preparativa: velocidad máxima 75.000rpm (510.000 g). Las
cámaras del rotor están a la vez refrigeradas y evacuadas para así minimizar la
producción de calor por fricción.
TECNICAS DE LABORATORIO
MÉTODOS DE SECUENCIACIÓN
Método de Maxam y Gilbert (Método Químico): Este método usa reactivos químicos
que reaccionan con bases especificas para romper el ADN preferencialmente en
determinados nucleótidos. Primeramente las cadenas de ADN se marcan
radiactivamente en el extremo 5´, y se separan (solamente una se va a secuenciar).
Luego, la cadena a secuenciar se trata con cuatro reactivos químicos diferentes que
tienen la capacidad de cortar la cadena en uno o dos nucleótidos específicos. El
tratamiento no es exhaustivo, de manera que reacciona un solo residuo de la/s base/s
susceptibles. Por consiguiente, en cada mezcla de reacción, se generan un conjunto de
fragmentos radiactivos. Finalmente, estos fragmentos son separados por tamaño
utilizando una electroforesis en gel de poliacrilamida. El revelado del gel por
autorradiografía, permite visualizar las bandas radiactivas correspondientes a los
distintos fragmentos, y a través de ellos se va armando la secuencia.
TECNICAS DE LABORATORIO
Método de Sanger (Método Enzimático): En este método se usa la enzima ADN
polimerasa I para producir fragmentos de ADN de diferentes tamaños, que luego al ser
separados mediante electroforesis, permite como en el método químico, leer el orden de
los nucleótidos.
Se usa ADN de simple cadena como templado para la síntesis de cadenas de ADN
complementarias usando como sustratos 2´3´ dideoxinucleótidos y los cuatro
nucleótidos normales. Los dideoxinucleótidos se incorporan a la cadena de ADN, pero
no permiten su elongación posterior, dado que no pueden formar uniones fosfodiéster
con el siguiente precursor. Se producen entonces, una serie de cadenas de ADN
incompletas que terminan específicamente en el dideoxinucleótido. Para determinar la
secuencia se realizan por separado cuatro reacciones de síntesis de ADN, cada una con
un nucleótido finalizador de cadena diferente, sus productos de separan por
electroforesis en gel de poliacrilamida y se detectan posteriormente por
autorradiografía.
TECNICAS DE LABORATORIO
TECNOLOGÍA DEL ADN RECOMBINANTE
La Tecnología del ADN recombinante constituye una mezcla de técnicas, entre las que
podemos citar:
1) Corte específico del ADN mediante nucleasas de restricción 2) Amplificación y
clonado del ADN que posibilita integrar un fragmento específico de ADN en un
elemento genético de replicación rápida (plásmido) para que pueda ser reproducido en
bacterias o levaduras 3)Secuenciación del ADN 4) Hibridización de los ácidos
nucleicos, que permite identificar secuencias específicas de ADN o ARN con gran
exactitud, debido a la capacidad de los ácidos nucleicos de unirse a secuencias
complementarias.
1)Nucleasas de Restricción
Muchas bacterias producen estas enzimas, que son capaces de cortar al ADN en sitios
determinados, ya que reconocen secuencias específicas de cuatro o seis nucleótidos.
Una nucleasa de restricción determinada cortará cualquier doble hélice de ADN en una
serie de fragmentos conocidos como fragmentos de restricción.
Muchas nucleasas de restricción producen cortes escalonados, que dejan fragmentos
cortos de una sola hebra en ambos extremos. Estos extremos se denominan "extremos
cohesivos", ya que son complementarios con cualquier otro extremo producido por la
misma enzima.
Cuando los dos extremos se han unido gracias al apareamiento de bases
complementarias, pueden sellarse por la acción de una enzima conocida como ligasa,
que forma enlaces fosfodiester covalentes entre los extremos opuestos de cada hebra de
ADN.
2) Amplificación y clonado del ADN
La obtención de fragmentos específicos de ADN para diversos fines (secuenciación,
clonado, expresión) se ha simplificado enormemente a partir del desarrollo de la
reacción en cadena de la polimerasa (“PCR”). Este proceso permite obtener grandes
cantidades de ADN sin necesidad de clonar. La PCR requiere un par de cebadores que,
por lo general, son fragmentos cortos de ADN sintetizados químicamente
(oligonucleótidos) que tienen secuencias de nucleótidos específicamente
complementarias a aquellas en las hebras opuestas que flanquean la región blanco. Estos
cebadores definirán los extremos del segmento de ADN que se duplicará. La fuente
original del molde o templado de ADN no tiene que estar altamente purificada y aun
una cantidad muy pequeña del templado puede servir como iniciador de la PCR. La
muestra de ADN se calienta, permitiendo que las hebras complementarias se separen.
Entonces se añaden los cebadores junto con una enzima polimerizante del ADN. Los
cebadores se unen a las cadenas de una sola hebra durante la fase de enfriamiento, y la
enzima polimerizante extiende al cebador a lo largo del resto del fragmento, creando
moléculas de ADN doble hebra. Entonces el proceso se repite, es decir se calienta la
mezcla nuevamente y durante las sucesivas fases de enfriamiento, los cebadores
sobrantes se unen a las hebras molde y se alargan mediante la enzima polimerizante
para producir mas moléculas de doble hebra. Teóricamente, después de 20 de estos
ciclos una molécula sencilla de ADN puede amplificarse a un millón de copias. Con
esta cantidad de ADN se pueden fabricar sondas, realizar secuencias, etc.
Fragmentos de ADN procedentes de cualquier fuente también pueden ser amplificados
mas de un millón de veces insertándolos en un plásmido o en un virus bacteriano
(bacteriófago) y luego cultivándolo en células bacterianas o de levaduras. Este proceso
se denomina clonado del ADN. Los plásmidos son pequeñas moléculas circulares de
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ADN duplex que se presentan en forma natural en bacteria y levaduras, donde se
replican como unidades independientes cuando prolifera la célula huésped. Estos
vectores a menudo confieren resistencia a antibióticos. Estas propiedades y su reducido
tamaño los hace muy útiles como herramientas de clonado y multiplicación del ADN.
Pueden ser cortados con enzimas de restricción y luego se les puede ligar el fragmento
de ADN que se desee clonar. Luego, las moléculas híbridas (Vector + ADN insertado)
se introducen nuevamente en bacterias que transitoriamente se han hecho permeables a
las macromoléculas. Solo algunas de las células tratadas incorporarán el plásmido. Estas
células pueden seleccionarse mediante la resistencia a antibióticos que les habrá
conferido el plásmido, ya que sólo estas células crecerán en presencia de antibióticos.
Al dividirse estas bacterias, también se replicará el plásmido, produciéndose así un
enorme número de copias del mismo.
ADNc
Una estrategia alternativa al proceso anteriormente descrito consiste en empezar el
proceso de clonado seleccionando sólo aquellas secuencias de ADN que fueron
transcriptas ( es decir, que produjeron ARN). Esto se lleva a cabo extrayendo el ARNm
de las células y haciendo una copia de ADN de cada molécula de ARNm presente (la
cual se denomina ADN copia o ADNc). Esto es posible gracias a la enzima transcriptasa
reversa que cataliza el proceso de síntesis de una cadena complementaria de ADN
sobre un patrón de ARN. Las moléculas de ADNc de una sola hebra sintetizadas
mediante la transcriptasa reversa pueden ser amplificadas por PCR (obteniéndose una
molécula doble hebra) o ser convertidas en moléculas de ADNc doble hebra por la ADN
polimerasa. Estos fragmentos pueden insertarse en los plásmidos y clonarse.
Es posible construir plásmidos de tal manera que el ADNc clonado dirija la síntesis
dentro de una célula de grandes cantidades de la proteína codificada por el ADNc
(recordar que se originó a partir de un ARNm). Se puede inducir a bacterias a producir
cantidades enormes de proteínas útiles como la insulina o el interferón.
3) Secuenciación
Es de suma utilidad conocer la secuencia exacta de un determinado fragmento de ADN,
ya que partir de este dato se pueden fabricar oligonucleótidos para amplificaciones por
PCR o saber cuales enzimas de restricción pueden ser útiles para clonar ese ADN. El
método más usado en la actualidad es una variante del método enzimático ideado por
Sanger. Gracias a la automatización de este proceso, y combinando varias técnicas de
Biología Molecular se ha llegado a determinar la secuencia completa del genoma de
varias especies, (entre ellas la humana). Todas las secuencias de genes conocidos
forman parte de bancos de datos de libre acceso en Internet. Esto permite identificar
secuencias desconocidas por comparación con estos bancos, como así también obtener
datos acerca de secuencias de interés.
4) Hibridización
Las hebras complementarias del ADN, producto de su desnaturalización pueden formar
de nuevo una doble hélice si se mantienen a 65ºC durante un período prolongado;
proceso denominado hibridización del ADN. Se producen reacciones de hibridización
similares entre dos cadenas cualquiera de ácido nucleico de una sola hebra (ADN/ADN;
ARN/ARN, ADN/ARN) siempre que tengan una secuencia de nucleotidos
complemenaria.
Puesto que la velocidad de formación de la doble hélice está limitada por la velocidad a
la que chocan dos cadenas complementarias de ácido nucleico, es posible medir la
concentración de las moléculas de ADN que presentan una secuencia particular de
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nucleótidos a partir de la velocidad con que la preparación del ADN en cuestión se
hibridiza con una sonda de ADN clonado marcada radiactivamente de secuencia
complementaria al ADN problema. Se trata de una prueba tan exacta que puede detectar
incluso secuencias complementarias cuya concentración sea una molécula por célula. A
partir de estas mediciones se puede determinar el número de copias de la secuencia de
ADN contenida en la sonda clonada que existen en el ADN de una célula.
También se pueden realizar estudios de hibridización con el ARN aislado de las
células, para determinar si la secuencia de ADN que se ha clonado es una de las que se
transcriben a ARN, y en caso afirmativo, cuantas copias del ARN se producen por
célula y en que tipos de células y tejidos .
Las sondas radiactivas de ADN clonado se utilizan ampliamente para localizar
secuencias determinadas de ácido nucleico en mezclas de fragmentos de restricción de
ADN separados por electroforesis sobre gel.
Se realiza una copia del gel, transfiriendo todos los fragmentos de ADN a una
membrana cargada (nitrocelulosa o nylon) mediante difusión, proceso denominado
“transfer”. Luego, mediante autorradiografía, se identifican las localizaciones de los
fragmentos que se hibridizan con la sonda de ADN radiactivo.
Si el material contenido en la membrana es ADN, el estudio se denomina "Southern
blot"
Este proceso también puede realizarse sobre ARN. Si el material transferido a la
membrana es ARN, el estudio se denomina "Northern blot"
Estas denominaciones son independientes del tipo de sonda usada (ARN, ADN o
ADNc)
RADIACTIVIDAD
Los átomos existentes en la naturaleza pueden dividirse en dos grupos: estables e
inestables. Estables son aquellos que no cambian su identidad espontaneamente en el
tiempo. Los átomos inestables pierden su identidad por transformación en otros. La
mayoría de los elementos conocidos existen como mezclas de isótopos, es decir átomos
que contienen el mismo número de protones, pero no de neutrones.
Se llama nucleido a una especie atómica que está definida por su masa, su carga nuclear
y el estado energético de su núcleo (combinación particular de neutrones y protones).
Cuando la combinación es inestable con respecto a la desintegración nuclear se los
denomina radionucleido. Tanto los isótopos estables como los radiactivos son
utilizados en investigaciones biológicas.
Cómo se desintegran los nucleidos?
El fenómeno mediante el cual el nucleido de un átomo se transforma espontáneamente
en otro, recibe el nombre de desintegración radiactiva. En cada desintegración
radiactiva el núcleo pierde aproximadamente una milésima parte de su masa en forma
de radiación. Los nuevos elementos originados como productos finales del proceso de
desintegración suelen no ser radiactivos. Se pueden identificar tres tipos de radiaciones:
alfa (α), beta (β) y gama (γ).
Rayos alfa: son núcleos de Helio, o sea átomos de Helio que han perdido sus dos
electrones, adquiriendo una doble carga positiva. Los átomos recorren en el aire entre 3
y 7 cm antes de chocar con otros átomos que encuentran a su paso. Estas partículas son
retenidas por una hoja de papel o una lámina de aluminio de 0,05 mm de espesor.
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Rayos beta: son electrones. Un neutrón nuclear se convierte en un protón nuclear y un
electrón. la emisión de una partícula beta (electrón) resultará e un isótopo estable con un
N atómico mayor en una unidad y un peso atómico idéntico al radioisótopo original.
0
14
Ej.: 146 C
-1  7N
Las partículas son emitidas en una escala continua de energía desde cero hasta el valor
máximo (E max). Dicho valor es característico de cada radioisótopo.
Los rayos beta recorren distancias mayores que los alfa, tienen mayor poder penetrante
que los anteriores ya que atraviesan fácilmente el papel y de acuerdo a sus energías,
hasta unos mm del aluminio. Cuando las partículas beta atraviesan la materia, su energía
se disipa principalmente por ionización y/o excitación de los átomos con los que
chocan. Estas interacciones se detectan con los contadores Geiger-Muller (ionización) y
de centelleo (excitación).
Rayos gamma: son ondas electromagnéticas como la luz visible o los rayos X pero de
menor longitud de onda. Tienen valores discretos de energía y no es una escala
continua. No varía ni el número atómico ni el másico. El nucleido simplemente sufre
una transición desde un estado más alto de energía hasta uno más bajo. Un rayo gamma
no presenta carga y por lo tanto no ioniza directamente átomos en su trayectoria.
Los rayos gamma son penetrantes y para detenerlos se precisa una pared gruesa de
plomo o cemento.
La mayoría de los radioisótopos usados en estudios bioquímicos son emisores beta y/o
gamma.
De los isótopos producidos artificialmente los que se emplean más frecuentemente son:
3
H, 14C, 24Na, 32P, 35S, 40K, 59F, 131I. Todos ellos emiten radiaciones de partículas beta
cargadas negativamente y los isótopos 24 Na, 59Fe y 131I emiten al mismo tiempo
radiaciones gamma.
La radiactividad es la transformación atómica en la que un elemento se convierte en
otro, con la emisión de radiaciones. La desintegración radiactiva obedece a las leyes de
la probabilidad y es independiente de influencias externas como presión, gravedad,
temperatura, campos eléctricos o magnéticos y tratamientos químicos.
La intensidad de la radiactividades proporcional a la masa del nucleido
La actividad decrece con el tiempo y es característica de cada nucleido
λ= constante de desintegración radiactiva (tiempo–1)
N= número de átomos en el tiempo t
- dN = número de átomos que decaen (desintegran por unidad de tiempo)
dt
En cualquier momento dado, el número de átomos de un material radiactivo que se
desintegran por unidad de tiempo es proporcional al número de átomos presentes en ese
tiempo.
A este valor se lo conoce generalmente como: actividad y es la velocidad de
desintegración de una fuente activa al tiempo t.
Aunque
es una constante de proporcionalidad su significado físico puede verse
rearreglando la ecuación.
por lo tanto
Es decir que es la fracción de átomos radiactivos que decaen por un incremento de
tiempo. Integrando entre los límites de N0 (número original de átomos radiactivos y N
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(número de átomos radiactivos a cualquier otro tiempo) y entre los límites de t0 y
cualquier otro tiempo t se obtiene:
N
No
dN = - λ
N
ln No = λ t
N
t
ln N = - λ t
N0
dt
to
2,3 log No = λ t
N
Periodo de semidesintegración.
Es el tiempo necesario para que el número inicial de átomos disminuya a la mitad.
N = No / 2
t = ln No/N
λ
t1/2 = ln No/No/2 = ln2 = 0,693
λ
λ
λ
Vida media: es el promedio de vida de sus átomos. τ = 1
λ
La relación entre el período de semidesintegración y vida media es:
t1/2 = 0,693 τ τ = 1,444 t1/2
Unidades de radiactividad.
La unidad estándar de decaimiento radiactivo es el Curie (Ci). Se lo define como la
cantidad de cualquier nucleido radiactivo en el cual el número de desintegraciones por
segundo es 3,7x1010
Para la mayor parte de las aplicaciones biológicas se necesita normalmente cantidades
mucho menores de un Ci y se emplea el miliCurie (mCi) y el microCurie ( Ci) que
equivalen a 10-3 y 10-6 Ci respectivamente.
La unidad estándar de tiempo es el minuto, por lo tanto: 1 Ci=2,2x106 dpm.
Normalmente la actividad se indica por cuentas detectadas por minuto (cpm) y no como
desintegraciones por minuto (dpm), dado que es difícil determinar el número absoluto
de dpm. Esto se debe a que la eficiencia de la mayoría de los contadores es menor del
100%, es decir, solo detectan una fracción del total.
Para experimentos cuantitativos muy precisos el valor de cpm se convierte en dpm
dividiendo por la eficiencia del contador.
Actividad específica.
Los isótopos radiactivos y los compuestos marcados radiactivamente con isótopos, son
por lo general isotópicamente puros. La abundancia relativa de un isótopo se describe
por su actividad específica, que es una manera de designar la fracción de moléculas
totales presentes que es radiactiva. Este valor se expresa generalmente como actividad
(mCi o Ci) por milimol o micromol (mmlo o mol) o como Ci/gr, dpm/mol,
cpm/ mol, etc.
Dilución isotópica.
Los trazadores radiactivos pueden usarse para determinar la cantidad de una sustancia
simple en una muestra, agregando a la misma una cantidad conocida del mismo
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compuesto "marcado" (radiactivo). Así, el compuesto no marcado (frío) y el mismo
compuesto marcado se mezclan sin que sea posible distinguirlos entre si. La actividad
específica de la solución resultante se puede calcular mediante la siguiente fórmula:
Donde:
a2: actividad específica en el diluyente + radiactivo agregado
x1: masa radiactiva agregada
x2: masa del diluyente (compuesto no marcado)
z: actividad (cpm) del radiactivo agregado
La actividad específica del radiactivo agregado (a1) será:
Luego, se reaisla una pequeña cantidad del compuesto y se mide la radiactividad del
mismo. De la actividad específica del mismo y conociendo el número total de cuentas
originariamente agregado, se puede calcular la cantidad del compuesto no marcado
presente desde un principio en la mezcla.
Aplicaciones de radioisótopos en biología y bioquímica.
Un gran número de los análisis bioquímicos requieren la detección de cantidades
mínimas (10-14 a 10-6 moles) de material. Ahora bien, las pruebas químicas rara vez son
sensibles a cantidades menores de 10-7 moles. Esta limitación se ha superado por el
desarrollo de una tecnología de marcadores radiactivos, cuya extraordinaria sensibilidad
en la detección de material marcado con isótopos radiactivos ha permitido que los
estudios con muchas sustancias en cantidades del orden de 10-12 moles sean de rutina.
Además el uso de radiactividad ha permitido el desarrollo de aproximaciones
experimentales de gran alcance a diversos tipos de problemas.
Estas aproximaciones emplean la técnica de marcado doble, que permite el
seguimiento de dos sustancias al mismo tiempo, la técnica de un seguimiento de un
pulso radiactivo y el análisis de intercambio.
En una molécula marcada al menos un átomo esta presente como radioisótopo.
Este radioisótopo no modifica las propiedades químicas de la molécula. Los
radioisótopos se pueden utilizar para seguir las actividades de moléculas marcadas dado
que estos átomos pueden detectarse cuando emiten partículas.
Se
encuentran
disponibles comercialmente aminoácidos y nucleótidos marcados con 14C o 3H, así
como cientos de intermediarios metabólicos marcados. El 125I puede estar unido en
forma enzimática o química a una proteína si afectar la macromolécula. La metionina
marcada con 35S se utiliza para marcar proteínas ya que posee una alta actividad
especifica. La magnitud de la actividad específica depende de la relación de átomos
inestables (potencialmente radiactivos) a átomos estables (no radiactivos), y de la
probabilidad de decaimiento de los átomos inestables, indicado por su vida media.
Existen principalmente dos métodos para detectar la radiactividad incorporada. I) En la
autorradiografía se marca una célula o componente celular y lego se cubre con una
emulsión fotográfica sensible a la radiación. El desarrollo de la emulsión revela la
distribución del material marcado. Por ejemplo la incorporación de 3H timidina
identifica el núcleo como el mayor sitio de síntesis de ADN. En oposición, la
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incorporación de uridina marcada a ARN muestra este se sintetiza primero en el núcleo
pero la gran mayoría se localiza en el citoplasma.
II) En los ensayos cuantitativos, las células se pueden marcar tanto in vivo
como in vitro y sus componentes celulares se pueden aislar y purificar de diversas
maneras. Se mide entonces la cantidad o tipo de radiactividad en estos componentes
mediante un contador Geiger (para detectar iones producidos en un gas por las
emisiones radiactivas) o por un contador de centelleo (que cuenta los flashes de luz
generados por una sustancia fluorescente que absorbe la energía de la muestra
radiactiva).
A menudo se emplean una combinación de técnicas de marcado y bioquímicas, como
por ejemplo el experimento de "pulso-caza" (pulse-chase) . En este caso el material
radiactivo (el pulso) se añade únicamente durante un periodo muy corto de tiempo y
luego se elimina por lavado, siendo substituido por moléculas no radiactivas (caza).
Tras diversos períodos de tiempo se toman muestras y en cada momento se identifica la
forma química o la localización de la radiactividad.
Ejemplo: se pueden crecer células en un medio de cultivo que contenga aminoácidos
marcados y se incorporan al pool general de aminoácidos, que constituyen la fuente para
la síntesis de proteínas. La actividad específica de los aminoácidos en el pool alcanza un
máximo en los primeros cinco minutos, sin embargo la acumulación de radiactividad en
las proteínas comienza mas lentamente. Sin embargo si se agregan al medio
aminoácidos no marcados (caza), se frena en pocos minutos la incorporación de
radioactividad a la proteína, debido al rápido equilibrio entre los aminoácidos que están
dentro de la célula y los del medio de cultivo.