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MANUAL DE LA ASIGNATURA INMUNOFISIOLOGÍA - Práctica 2: Observación de células sanguíneas y
recuento de leucocitos
Práctica 2
1
Obsevación y recuento de células sanguíneas
Semestre B-2010
Introducción
En la sangre se encuentran los leucocitos o glóbulos blancos que son las células móviles del
sistema inmunitario. Todos ellos difieren en cuanto a su función y morfología. Los leucocitos
no desempeñan sus funciones cuando se encuentran en sangre, sino cuando abandonan
ésta y entran a los tejidos linfoides o a las zonas donde hay inflamación intensa. En este
sentido, la sangre es un medio de transporte, que le permite a las células sanguíneas
recircular entre los diferentes tejidos del cuerpo. Normalmente en sangre se encuentran
cinco tipos de leucocitos: monocitos, linfocitos, neutrófilos, eosinófilos y basófilos. Además
de estas células, se encuentran presentes las plaquetas, que son fragmentos
citoplasmáticos de los megacariocitos que se asientan en la médula ósea.
Los leucocitos se estudian en preparaciones coloreadas por dos razones: a fin de
determinar la apariencia normal o anormal de las células y sus porcentajes relativos en el
diagnóstico de ciertas enfermedades. El recuento de eritocitos y eucocitos es uno de los
métodos de rutina
Objetivos:
1. Adiestrarse en la preparación y tinción de frotis sanguíneo
2. Describir la morfología de los diferentes tipos de células sanguíneas observadas en
el microscopio óptico
3. Adiestrarse en el manejo y uso del hemocitómetro
TÉCNICA DEL FROTIS DE SANGRE
Las células de la sangre se estudian comúnmente en el laboratorio mediante preparaciones
denominadas “frotis sanguíneo” o “extendido sanguíneo”. Para ello se prepara una fina
película de células sanguíneas sobre un portaobjeto a fin de obtener una capa delgada de
células. Después de colorear las preparaciones se observa su morfología al microscopio
óptico.
Materiales requeridos para el frotis
3 Portaobjetos limpios.
Lanceta estéril
etanol (para limpiar las láminas)
metanol (para fijar la muestra de sangre)
Gasa
Lápiz de diamante
Colorante Giensa
Buffer Sorensen
Para colorear 2 láminas con frotis sanguíneo, mezcle en un recipiente de vidrio, 9 ml de
Buffer Sorensen pH 7.2 y 1ml de colorante Giensa. Tiempo de coloración 20 minutos.
PROCEDIMIENTO
1. Lave muy bien tres portaobjetos. Si es necesario límpielos con etanol/éter utilizando un
trozo de gasa.
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2. Ubique el sitio de toma de la muestra en la parte lateral del dedo medio o anular de la
mano izquierda donde es menos sensible que en la punta, como lo indica el esquema.
3. Limpie el sitio donde se tomará la muestra de sangre, utilizando una gasa empapada
con etanol y luego séquelo con gasa.
4. Con una lanceta con un movimiento firme y rápido realizar una pnución en un pulgar.
5. Limpie la primera gota de sangre con gasa.
6. Con la mano derecha tome un portaobjeto y sosténgalo por los bordes. Con la mano
izquierda presione el dedo y deje fluir una gota pequeña de sangre (2mm de diámetro).
Coloque una gota de sangre sobre el portaobjeto en el centro de uno de los extremos de
la lámina.
7. Coloque un segundo portaobjeto apoyado sobre el otro por delante de la gota de sangre
en ángulo de 45º, y se hace retroceder hasta que el borde coincida con la gota, que se
extenderá por capilaridad por todo el borde. Antes de que la sangre se extienda por los
extremos del porta, se hace deslizar por el porta hacia delante con movimiento firme y
rápido, elevando la mano derecha antes de que el porta que se desliza llegue al final.
Mientras mayor sea el ángulo que forman las dos láminas, mayor será el espesor de la
capa de células.
gota de
sangre
Figura 1:Esquema de la disposición de los portaobjetos para realizar el extendido sanguíneo
8. Deje secar la muestra durante 5 minutos. Fije con metanol (1 minuto). Deje secar
nuevamente (10 minutos). Coloree con colorante Giensa (20 minutos).
Estudio del frotis
Examinar la muestra con objetivo de pequeño aumento observando la distribución de la
muestra, que debe ser homogénea. Cambiar a objetivo de inmersión (100x), subir el
condensador, abrir el diafragma y usar aceite de inmersión. Visualizar los eritrocitos,
leucocitos y plaquetas.
Se observan los diferentes leucocitos: Polimorfos nucleares ó granulocitos (PMN) debido a
la diferente forma de su núcleo y Mononucleares ó agranulocitos.
Eritrocitos: Color rosa pálido.
Plaquetas: Color violeta pálido o púrpura.
Neutrófilos: Núcleo azul oscuro. Citoplasma rosado con granulaciones rojo violeta.
Eosinófilos: Núcleo azul. Citoplasma azul, con gránulos rojo anaranjado.
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Basófilos: Núcleo azul oscuro. Gránulos púrpura casi negros.
Linfocitos: Núcleo violeta. Citoplasma azul celeste.
Monocitos: Núcleo laxo violeta. Citoplasma azul celeste.
•
•
•
•
Observe el tamaño y la forma de los núcleos (redondeado, lobulado, endentado) en
relación con el volumen total de la célula.
Observe la apariencia del citoplasma, de los gránulos citoplasmáticos y el color de estos
(incoloro, rosado, celeste, azul oscuro). Note la apariencia de la cromatina del núcleo,
densamente teñida o pálida. También la posición del núcleo en la célula: (central o
excéntrica).
Realice dibujos de las células observadas. Para obtener información más completa de la
morfología y función de estas células consulte textos de histología disponibles en el
laboratorio.
¿Cuales son las funciones de cada una de estas células?
TÉCNICA DEL RECUENTO DE ERITROCITOS Y LEUCOCITOS EN CÁMARAS
CUENTAGLÓBULOS (HEMOCITÓMETRO)
El número total de eritrocitos o leucocitos en sangre se determina mediante el recuento
celular en un volumen de sangre conocido. Cualquier método de recuento celular incluye la
dilución de la sangre total capilar o venosa (tratada con EDTA) con una pipeta graduada
(pipeta de dilución) y el recuento mediante el hemocitómetro y un microscopio óptico
convencional. Los recuentos de células se expresan como concentraciones; número de
células por unidad de volumen de sangre (céulas/L)
Materiales para el recuento celular
Líquido de dilución
Solución de Hayem (solución isotónica) para el recuento de glóbulos rojos.
- Sulfato de Sodio
12,5 g
- Acido acético glacial
33,5 ml
- Agua destilada
200 ml
Solución de Turk para recuento de glóbulos blancos (lisa los eritrocitos).
- Acido acético glacial
3 ml
- Agua destilada
100 ml
Se colorea ligeramente la solución de Turk con azul brillante de Cresil.
Pipetas de dilución:
1 Pipeta de Thomas (101) de mezcla para eritrocitos
1 Pipeta de Thomas (11) de mezcla para leucocitos
Las pipetas de dilución son pipetas de cristal que consta de un tubo capilar graduado
marcado con 0,5 en la quinta señal y con 1 en la décima señal, seguido en su extremo
proximal de una dilatación o bulbo que lleva una perlita en su interior para facilitar la mezcla.
Por encima del bulbo lleva un capilar corto por donde se introduce el tubo aspirador y con
una señal 101 en la pipeta de eritrocitos y una señal 11 grabado en la pipeta de dilución de
los leucocitos. La pipeta de recuento de los eritrocitos es roja y la de leucocitos es blanca.
La pipeta de dilución de eritrocitos tiene una capacidad de 100 veces el volumen del capilar
y la de los leucocitos 10 veces el volumen del capilar. En la pipeta de eritrocitos cuando la
sangre es aspirada, hasta la señal de 0'5 y el líquido de dilución es aspiración hasta la señal
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101, la dilución resultante es de 1/200. En caso de las pipetas de dilución de leucocitos
cuando el enrase de la muestra de sangre se hace en la marca 11, se realiza una dilución
1/10.Una vez que se llena la ampolla el capilar no contiene células ya que han sido
arrastradas por el líquido de dilución. Para observarlo en la cámara de recuento habrá que
vaciar su contenido antes.
Cámara hemocitómetro
1 Cámara hemocitómetro (Camara de Neubauer)
El hemocitómetro o cámara de contaje celular
adaptada al microscopio de campo claro se
trata de un grueso portaobjetos de cristal en
cuyo tercio medio están fijadas 3 plataformas
paralelas que se extiende a lo ancho de su
superficie. La plataforma central está
subdividida por una ranura transversal en 2
mitades cada una más ancha que las 2
laterales y separadas de ellas y entre sí por
fosos. Las plataformas centrales o piezas de
fondo están exactamente 0'1mm más bajas
que las plataformas laterales y tienen una
regla de Neubaver mejorada de 3X3 ml y está
subdividida en 9 cuadrados secundarios de
2
1X1 mm (1mm ). Los 4 cuadrados de las
esquinas denominados 1, 3, 7 y 9 se utilizan
para el recuento de leucocitos y estos están a
su vez subdivididos en 16 partes llamados
terciarios. El cuadrado central, se utiliza para
contar los eritrocitos, y está dividido en 25
cuadrados terciarios, cada uno de los cuales
mide 0'2 X 0'2 mm (0'04mm2) y cada uno de
estos se dividen en 16 cuadrados más
pequeños.
Figura 2: Fotografía del hemocitómetro de
Neubauer
Microscopio óptico
PROCEDIMIENTO
Muestra de sangre
Tome una muestra de sangre del dedo medio o anular como se describe en el
procedimiento del frotis de sangre. Presione el dedo para obtener una gota de sangre
grande (muestra de leucocitos).
Llenado de la pipeta
Aspire la gota de sangre en una pipeta Thomas (11), de mezcla para leucocitos calibrada
hasta la marca 0,5 y seguidamente aspirar sin formación de burbujas el reactivo de Turk
hasta la marca 11. Agite la pipeta vigorosamente durante 1-2 minutos. En la pipeta de
mezcla se produce una dilución 1:20.
Presione nuevamente el dedo para dejar fluir una gota de sangre grande (muestra de
eritrocitos). Aspire la gota de sangre utilizando la pipeta Thomas (101) hasta la marca 0,5 y
seguidamente aspire sin formar burbujas, el reactivo de Hayem (para recuento de glóbulos
rojos) hasta la marca superior 101. Agite durante 1 o 2 minutos. En la pipeta de mezcla se
produce una dilución 1:200.
Llenado de la cámara de Neubauer
1. Coloque el cubreobjeto sobre la cámara de Neubauer.
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2. Deseche las tres primeras gotas de la sangre diluida en la pipeta.
3. Coloque la muestra de leucocitos en uno de los compartimientos de la cámara y la
muestra de eritrocitos en el otro compartimiento, cuidando de no rebosar el
compartimiento calibrado. Si son visibles burbujas de aire o ha entrado líquido en las
ranuras a través de los bordes, entonces debe limpiarse a cámara y llenarse de nuevo.
4. Deje reposar las muestras de 2 a 3 minutos para permitir la sedimentación de los
glóbulos.
Recuento en el microscopio óptico y cálculo de la concentración de células
1. Coloque la cámara de Neubauer sobre la platina del microscopio. Utilice el objetivo 10X
para ubicar el cuadrado central de la cámara.
2. Se hace el recuento utilizando el objetivo 40X. Se cuentan los leucocitos en los cuatro
cuadrantes de las esquinas (cuadrantes 1, 3, 7 y 9 de la Figura 3) de 1mm de lado cada
uno. El cálculo del número de leucocitos por mm3 se realiza como sigue:
Leucocitos por mm3= N x 20 x 10
4
donde N=número de leucocitos contados
20 = Factor de dilución
3
10 = Factor para convertir a mm
4 = Número de áreas contadas.
3. Se hace el recuento de los eritrocitos utilizando el objetivo 40X, en 80 cuadrados
mínimos =1/5 mm2, del cuadrado central de la retícula; es decir, en los cuatro cuadrantes
de los ángulos y el cuadrado central, los cuales constituyen los 80 cuadrados pequeños.
El cálculo se efectúa como sigue:
Eritrocitos por mm3= N x 200 x 400 x 10 = N x 104
8
donde:
N = número de leucocitos contados
200 = Factor de dilución
400 = Factor para convertir a mm3
3
10 = Factor para convertir a mm
80 = Número de áreas contadas.
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Figura 3: Esquema de la retícula de la
cámara hemocitómetro de Neubauer
•
Valores de referencia de adultos:
Leucocitos
4 - 9 x 109/L
Linfocitos
30%
Monocitos
5-9%
Neutrófilos
60%
Eosinófilos
4%
Basófilos
0-1%
•
En valor absoluto:
Linfocitos
Monocitos
Neutrófilos
Eosinófilos
Basófilos
1-2 x 109/L
0,3 x 109/L
4 x 109/L
0,2 x 109/L
0,1 x 109/L
Resultados de la concentración de células en sangre
Realice los cálculos de la concentración de eritrocitos y leucocitos en la muestra de sangre,
exprese la concentración en céulas por litro de sangre
MC/mc septiembre 2010