Unidad 4

Unidad 6. Nutrición microbiana y caracterización de bacterias.
Unidad 8. Condiciones ambientales para el desarrollo,
inhibición y destrucción de microorganismos.
P11. Diversidad nutricional, fisiológica y
requerimientos de oxígeno.
Objetivos
A partir de una muestra natural:
 Evidenciar la diversidad nutricional de los microorganismos.
 Determinar algunas características fisiológicas de los microorganismos desarrollados.
 Observar los requerimientos de oxígeno de los microorganismos crecidos en las
diferentes zonas de la columna.
Introducción
En general los requerimientos nutricionales y de oxígeno de cada grupo microbiano están
íntimamente relacionados con el ambiente natural en que se desarrollan.
El grupo bacteriano es, desde el punto de vista estructural, el más simple de los
microorganismos (procariotes); no obstante, fisiológicamente es el más complejo. Las
bacterias obtienen su energía a través de la luz solar (fotosintéticas), o por la oxidación de
compuestos químicos inorgánicos (quimiolitotrofas) u orgánicos (quimiorganótroficas); su
fuente de carbono a partir del CO2 (autótrofas) o de compuestos orgánicos (heterótrofas).
Así mismo, su fuente de nitrógeno la obtienen a partir de compuestos orgánicos
(aminoácidos) e inorgánicos en diferentes estados de oxidación incluyendo el nitrógeno
molecular. La capacidad de reducir el dinitrógeno atmosférico es exclusiva de algunos
microorganismos procariotes (fijadores de nitrógeno).
En lo que respecta a sus requerimientos de oxígeno, algunos microorganismos crecen de
manera obligada en presencia de oxígeno (aerobios estrictos); en el extremo opuesto
existen otros que no requieren de este elemento para su desarrollo (anaerobios estrictos). Y
entre ambos grupos existen microorganismos que se desarrollan en presencia o ausencia de
oxígeno (aerobios facultativos), los que crecen en bajas concentraciones de oxígeno
(microaerofílicos) y los anaerobios que toleran pequeñas cantidades de oxígenos
(anaerobios aerotolerantes).
1ª. Sesión.
Inoculación de las muestras
Materiales
 Muestras
Agua de la columna de Winogradsky
Tierra húmeda de macetas
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 Microorganismos
Pseudomonas aeruginosa
Enterobacter sp
Micrococcus luteus
Clostridium sp
Streptococcus sp
 Material por equipo
2 mecheros
1 gradilla
1 varilla de vidrio en “L”
2 bulbos de goma
1 tripié
1 charola de metal
1 vaso de precipitados de 250mL
 Medios de cultivo
1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio mineral sin carbono.
1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio mineral con glucosa.
1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio mineral con celulosa.
1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio de Ashbey libre de nitrógeno.
1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio de Ashbey con amonio.
1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio de Ashbey con nitratos.
1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio de Ashbey con peptona.
1 caja de Petri con agar Ramos-Callao con lecitina.
1 caja de Petri con agar Ramos-Callao con fósforo precipitado.
1 tubo de 16x150mm con tapón de rosca con 10mL de medio para sulfato reductoras.
2 tubos de 16x150mm con tapón de rosca con 7mL de caldo Tioglicolato con resarzurina.
10 tubos de 22x175mm con 20mL de Agar Aneróbico de Brewer (por grupo).
 Material que deben tener los alumnos
Pipetas Pasteur estériles
Tubos con SSI estéril
1 tubo de 13x100 estéril
 Material por grupo
2 jarras de anaerobiosis
2 paquetes de Gas PacK
1 frasco grande de vidrio
1 vela
Metodología
 Preparación de las muestras (tierra húmeda o columna de Winogradsky).
1. Tomar aproximadamente 1cm3 de tierra húmeda y resuspender en un tubo con 9mL de
SSI estéril, homogenizar y dejar sedimentar.
2. Transferir con ayuda de una pipeta Pasteur estéril aproximadamente 4mL de agua (sin
partículas) en un tubo estéril de 13x100mm.
ME1515 - 2012/2 - Práctica 11 - página 2
3. Si se cuenta con una columna de Winogradsky de varias semanas, seleccionar una
zona por equipo y con ayuda de una pipeta Pasteur, extraer aproximadamente 4mL de
agua de la zona asignada y colocar en un tubo limpio.
Columna de
Winogradsky
Muestra de
tierra húmeda
Zonas
Tierra
Alta
Media alta
4mL
4mL
Media baja
SSI estéril
Baja
Diversidad nutricional
Medio mineral
Medio Ashbey*
Diversidad fisiológica
Medio Ashbey*
Medios Ramos Callao
Medio para SO4= reductoras
Requerimientos de oxígeno
Caldo Tioglicolado
Agar anaeróbico de Brewer
 Siembra de cultivos de diversidad nutricional.
1. Etiquetar los tubos de medio Mineral y el medio de Ashbey de acuerdo a la muestra
empleada.
2. Con la pipeta Pasteur inocular cada uno de los tubos con tres gotas (150L) de la
muestra e incubar a temperatura ambiente en presencia de luz durante 5 días.
 Siembra de cultivos de diversidad fisiológica (sulfato reductoras y transformaciones del
fósforo).
1. Etiquetar el tubo de medio para sulfato reductoras, de acuerdo a la muestra
empleada.
2. Con la pipeta Pasteur inocular con tres gotas (150L) de la muestra e incubar a
temperatura ambiente en condiciones reducidas de oxígeno (usar jarra de anaerobiosis
o jarra con vela) durante 5 días.
3. Etiquetar los medios de Ramos-Callao con lecitina (mineralizadores) y con fósforo
precipitado (solubilizadores), de acuerdo a la muestra empleada.
4. Con la pipeta Pasteur inocular con dos gotas (100L) de la muestra sobre la superficie
del agar y con la ayuda de una varilla de vidrio en “L” estéril (flamear con alcohol y
dejar enfriar al lado de la flama), extender la muestra sobre la superficie del agar.
Flamear la varilla antes de ser usada nuevamente y flamear después de ser usada.
5. Incubar a temperatura ambiente en condiciones aeróbicas, por 5 días.
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 Siembra para observar los requerimientos de oxígeno.
1. Someter a ebullición los dos tubos con caldo Tioglicolato hasta la reducción (observar
el indicador de resarzurina).
2. Sin agitar, colocar los tubos en una gradilla y dejar enfriar sin mover.
3. Etiquetar uno de los tubos con el nombre de la bacteria control que le corresponda al
equipo: Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter sp, Micrococcus luteus, Clostridium sp
o Streptococcus sp (un control por equipo), y el otro tubo indicando la muestra.
4. Inocular cada uno de los tubos con dos gotas (100L) del cultivo bacteriano control o
con dos gotas de la muestra.
Ebullir (reducir)
Dos gotas de
la cepa
control
Cepa control
Dos gotas a
partir del agua
de la muestra
Muestra de la
columna o
tierra húmeda
Medio fluido
de tioglicolato
5. Incubar 5 días a 37°C dependiendo de la muestra
Condiciones de incubación
Aerobiosis
Control
Pseudomonas aeruginosa
Micrococcus luteus
Enterobacter sp
Muestra
Columna superficial
Columna intermedia
Muestra de tierra húmeda
Microaerofília
Micrococcus luteus
Enterobacter sp
Columna intermedia
Columna profunda
Muestra de tierra húmeda
Anaerobiosis
Enterobacter sp
Streptococcus sp
Clostridium sp
Columna intermedia
Columna profunda
Muestra de tierra húmeda
6. Por grupo, fundir los medios de Agar Anaeróbico de Brewer (10 tubos de 22x175) hasta
su disolución total y la reducción del indicador azul de metileno.
7. En cada mesa seleccionar una de las muestras ya sea proveniente de la columna o
de tierra húmeda e inocular por duplicado dos gotas en una caja de Petri vacía y
estéril.
8. Cuando el medio de cultivo esté fundido, fluido y a una temperatura de 45ºC, verter
en cada una de las cajas, y homogenizar.
9. Los dos tubos restantes vaciarlos en cajas sin inóculo y dejar solidificar. Dividir en dos e
inocular por cuadrante radial a P. aeruginosa y a Clostridium sp.
10. Incubar una caja de cada muestra en condiciones aeróbicas y la otra en condiciones
anaeróbicas.
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Muestra de
agua
Mesa 1
Agar anaeróbico de Brewer
2 gotas
a
b
a
Mesa 2
2 gotas
a
a. Incubar a 37ºC
durante 48horas en
condiciones
aeróbicas.
b
a
Mesa 3
2 gotas
a
b. Incubar a 37ºC
durante 48horas en
condiciones
anaeróbicas.
b
a
Mesa 4
4
2 gotas
a
b
a
Control
a
b
a
Dividir en dos e inocular
por cuadrante radial a
P. aeruginosa y a
Clostridium sp.
2ª. Sesión.
Diversidad nutricional, fisiológica (nitrógeno, fósforo y azufre) y
requerimientos de oxígeno
Materiales
 Material por equipo
1 microscopio
1 juego de colorantes de Gram
2 mecheros
1 gradilla
2 bulbos de goma
2 tubos de 13x100
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 Reactivos
4 frascos gotero con reactivo de Nessler.
4 frascos gotero con reactivo de Griess A.
4 frascos gotero con reactivo de Griess B.
Zinc en polvo.
4 frascos goteros con solución de BaCl2 al 5%
Metodología
 Revisión de los resultados de diversidad nutricional
1. Revisar el crecimiento en cada uno de los tubos después de la incubación, describir el
desarrollo en cada uno y las características nutricionales de cada grupo que pudiera
estar presente.
Medio
Desarrollo
Características nutricionales
y grupos microbianos
MM sin carbono
MM con glucosa
MM con celulosa
Medio Ashbey libre de nitrógeno
Medio Ashbey con amonio
Medio Ashbey con nitritos
Medio Ashbey con peptona
 Revisión de los resultados de diversidad fisiológica
 Trasformaciones del nitrógeno.
1. Del tubo con medio de Ashbey libre de nitrógeno, transferir unas gotas en dos
portaobjetos con una pipeta Pasteur estéril.
2. En uno de los portaobjetos agregar una gota de reactivo de Nessler para determinar la
presencia de amonio. Una coloración naranja (puede presentarse un precipitado)
indica la presencia de amonio en el medio.
3. En el segundo portaobjetos agregar una gota de reactivo A de Griess y 1 gota del
reactivo B. Una coloración roja indica la presencia de nitritos en el medio.
4. Si el resultado de los nitritos es negativa, agregar una pizca de polvo de zinc al medio
con los reactivos de Griess. Si el medio se torna rojo hay presencia de nitratos en el
medio de cultivo.
5. Realizar un frotis y tinción de a cada uno de los tubos. Registrar los resultados.
6. Identificar los cambios en el ciclo del nitrógeno.
Medio Ashbey
NH4
NO2 NO3
Transformaciones y grupos
microbianos
Observación
microscópica
(esquema)
S/nitrógeno
C/amonio
C/nitritos
C/peptona
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Determinación de Amonio
El amonio reacciona en condiciones alcalinas con yoduro mercúrico dipotasico(1) (reactivo
de Nessler) para formar un precipitado color naranja(2).
(1)
(2)
HgI2 + KI → K2HgI4
K2HgI4 + KOH + NH3 → Hg2O(NH2I) + 7 KI + 2H2O
(anaranjado)
Determinación de nitritos y nitratos
Reducción de nitratos:
N03- → NO2- → NO → N2O → N2
El nitrito reacciona con dos reactivos: ácido sulfanílico y dimetil--naftilamina (o naftilamina). La reacción de color se debe a la formación de un compuesto diazonio, psulfobenceno-azo--naftilamina.
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N
NH2
N
+
SO3H
HNO2
+ H2 O
Acido nitroso
+
NH2
SO3H
Acido sulfanílico
(incoloro)
-naftilamina
(incolora)
Acido sulfanílico diazotizado
(sal de diazonio)
N
N
Acoplamiento
+ H2 O
NH2
SO3H
p-sulfobenceno-azo--naftilamina
(colorante rojo azo hidrosoluble)
Cuando la prueba resulta negativa para nitritos se utiliza la prueba del zinc para reducir
químicamente los nitratos presentes a nitritos y formar con los reactivos de Griese el
compuesto colorido.
 Transformaciones del azufre
1. A partir del tubo con medio TT transferir con una pipeta Pasteur aproximadamente 1mL
en cada uno de 2 tubos de 13x100.
2. En el primer tubo determinar la presencia de tiosulfato agregando unas gotas de la
mezcla de almidón-yodo. La presencia de tiosulfato se interpreta como la desaparición
del color.
3. En el segundo tubo determinar la presencia de sulfatos agregando una gota de HCl
0.1N y posteriormente gota a gota de la solución de BaCl 2 al 5%, la aparición de un
precipitado blanco indica la presencia de sulfatos.
4. Observar en el medio para bacterias sulfato reductoras la aparición de un precipitado
negro debido al gas incoloro H2S se forma en condiciones ácidas y reacciona con el
citrato de amonio férrico para producir un precipitado negro insoluble de sulfuro ferroso
metálico.
5. Realizar un frotis y tinción de a cada uno de los tubos. Registrar los resultados.
Medios
Bacterias oxidantes
del azufre (Medio TT)
Bacterias sulfato
reductoras
H2S S2O32-
SO42-
Transformaciones y
grupos microbianos
Observación
microscópica
(esquema)
XX
XX
XX
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Reacciones
Bacterias Quimiolitótrofas del azufre
H2S + 2O2 → SO42- + 2H+
HS- + H+ + ½O2 → Sº + H2O
Sº + 1½O2 + H2O → SO42- + 2H+
S2O32- + 2O2 + H2O → SO42- + 2H+
Bacterias sulfato reductoras
SO42- → SO32- → H2S
Determinación de tiosulfato
El yodo en presencia de yoduro y la -amilosa de una solución de almidón forma un
complejo colorido azul intenso. En presencia de tiosulfato el yodo es reducido a yoduro en
una disolución débilmente ácida lo que provoca la desaparición del complejo colorido.
I2 + 2S2O32+ → 2I- + S4O62+
Determinación de sulfato
El ión sulfato en solución se determina por precipitación con cloruro de bario en una solución
caliente, débilmente acidificada con ácido clorhídrico. Se originan cristales blancos
relativamente grandes.
SO42++ BaCl2 → BaSO4 + 2Cl-
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 Trasformaciones de fósforo
1. Revisar el medio de Ramos-Callao con lecitina (mineralizadores), observar la formación
de halos de desaparición de lecitina.
2. Realizar una tinción de Gram a cada tipo de colonia formadora de halos.
3. Revisar el medio de Ramos-Callao con fósforo precipitado (solubilizadores), observar la
formación de halos de desaparición del precipitado de fosfato.
4. Realizar una tinción de Gram a cada tipo de colonia formadora de halos.
5. Registrar los resultados en la tabla.
Medios
Descripción de colonias con
halo
Observación microscópica
(esquema)
Ramos-Callao con lecitina
(mineralizadores)
Ramos-Callao con fósforo
precipitado
(solubilizadores)
 Resultados de requerimientos de oxígeno.
1. De manera grupal Comparar el crecimiento en medios sólidos en condiciones aerobias
y anaerobias
de las columnas. Revisar las cajas control para descartar la
contaminación externa.
2. Revisar el crecimiento en cada uno de los tubos a las 48 horas de incubación y registrar
el desarrollo en cada uno de ellos en la tabla.
Columna
Muestra
Desarrollo en aerobiosis
Desarrollo en anaerobiosis
Control
3. Revisar el crecimiento en cada uno de los tubos a las 48 horas de incubación y registrar
el desarrollo en cada uno de ellos en la tabla.
Microorganismo o muestra
Clasificación
Condiciones de
incubación
Pseudomonas aeruginosa
Aerobio estricto
Enterobacter sp
Aerobio facultativo
Micrococcus luteus
Microaerofílico1
Streptococcus sp
Anaerobio
aerotolerante
Anaerobio estricto
Clostridium sp2
Esquema y descripción
del desarrollo
Muestra
1 esta reportado como de aerobio estricto
2 la cepa empleada resiste ciertas concentraciones de oxígeno
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 Composición de medios de cultivo.
Medio Ahsbey’s libre de nitrógeno
Manitol
CaCl2.2H2O
K2HPO4
MgSO4.7H2O
MoO3 (sol’n 10%)
FeCl3 (sol’n 10%)
pH
15.0 g
0.2 g
0.2 g
0.2 g
0.1 mL
0.05 mL
7.0+0.2
Disolver cada uno de los componentes en un
litro de agua destilada, ajustar el pH a 7 y
distribuir. Esterilizar a 121ºC, 15 lb de presión
durante 15 minutos. Adicionar las fuentes de
nitrógeno en una proporción de 0.5-1.0% previo
a la esterilización.
Thiobacillus / Thermophilus medium pH 6.5 (TT)
Na2S2O3.5H2O
NaHCO3
Na2HPO4
MgCl2
NH4Cl
Agua destilada
pH
5.0 g
1.0 g
0.2 g
0.1 g
0.1 g
1000 mL
6.5
Disolver cada uno de los componentes en 900
mL de agua, ajustar el pH a 6.5 con HCl
concentrado y aforar a 1 L. Esterilizar por
filtración. Distribuir en los tubos estériles.
Medio para movilizadores de fósforo
Medio basal de Ramos-Callao.
Extracto de levadura
2.0 g
Glucosa
20.0 g
Agar
18.0 g
Agua destilada
1000 mL
pH
7.0
Para mineralizadores:
En condiciones de asepsia colocar una yema de huevo en un matraz Erlenmeyer de
250 mL estéril. Agregar agua estéril hasta un volumen aproximado de 100 mL y
homogeneizar perfectamente. De ésta mezcla agregar 10mL a 100 mL del medio basal
de Ramos-Callao (sin glucosa) previamente esterilizado y enfriado a aproximadamente
45ºC, mezclas perfectamente y verter en las cajas de Petri ya inoculadas con las
diferentes diluciones del suelo.
Para solubilizadores:
Solución A
K2HPO4 al 10% Mezclar una parte de la solución A con dos
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Solución B
CaCl2 al 10%
partes de la Sol. B y homogeneizar el
precipitado obtenido. De esta suspensión
agregar 5.0mL a 100 mL de medio basal de
Ramos-Callao (Con glucosa) previamente
esterilizado y enfriado a 45ºC. Verter en cajas
de Petri previamente inoculadas con las
diferentes diluciones de suelo.
Medio para sulfato reductoras
Sulfato reductoras medio Postgate C modificado
KH2PO4
Na2SO4
NH4Cl
MgSO4•7H2O
CaCl2•6H2O
Citrato de sodio
FeSO4•7H2O
H2O destilada c.s.p.
0.5 g
4.5 g
1g
0.06 g
0.06 g
0.3 g
0.004 g
1000 mL
Disposición de desechos
1. El material plástico como las cajas Petri desechables, papel filtro y palillos de madera
deberán colocarse en los contenedores de incineración previamente atadas con
masking las cajas petri.
2. Las pruebas de Nessler y Griess realizadas en portaobjetos deberán recolectarse por
separado y entregar para el tratamiento de residuos químicos.
3. Esterilizar el material de vidrio en los que realizó sus lecturas y posteriormente lavar.
Bibliografía complementaria







Atlas, R. M. (1997). Handbook of Microbiological Media. 2nd edition. Edited by Lawrence
C. Parks. CRC Press. USA.
Atlas, R. M. Y Bartha R. (2002). Ecología Microbiana y Microbiología Ambiental. 2ª
edición en español. Pearson Education. Madrid, España.
Ayres, G. H. (1968). Análisis Químico Cuantitativo. 2ª edición. Traductor: Santiago V.
Pérez. Oxford University Press. México DF.
Mac Faddin, Jean F. 2003. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de
importancia clínica. 3ª edición. Médica Panamericana, Argentina. QR67 M3318 2003
Madigan, M. T. and J. M. Martinko. 2006. Brock Biology of microorganisms. 11th edition.
Pearson Prentice Hall. USA. QR41.2 B753 2006
Ramírez-Gama, R. M., B. Luna Millán, O. Velásquez Madrazo, L. Vierna García, A. Mejía
Chávez, G. Tsuzuki Reyes, L. Hernández Gómez, I. Müggenburg, A. Camacho Cruz y M
del C. Urzúa Hernández. 2006. Manual de Prácticas de Microbiología General. 5ª
edición. Facultad de Química, UNAM. México.
Widdel F., Bak F., The prokariotes, 2a ed. New York, Springer-Verlag, 1992.
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