MADURACIÓN DEL OVOCITO

MADURACIÓN DEL OVOCITO
Cambios fisiológicos durante la fase pre-ovulatoria
Capacitan al ovocito para ser fecundado e iniciar el programa que
dirige el desarrollo embrionario hasta la implantación
Provocada por el pico pre-ovulatorio de LH
Abarca:
• Maduración nuclear
• Maduración citoplasmática
• Maduración de las células foliculares
Maduración nuclear
Vesícula germinal (Profase 1ª división meiótica ) →Metafase 2ª división meiótica
(Extrusión del 1er corpúsculo polar)
Maduración citoplasmática
Síntesis de proteínas:
Tubulina, actina, histonas, proteínas ribosomales (de 30 a 50%), lactato
deshidrogenasa (de 80 a 90%), glicoproteínas de la zona pelúcida, glucosa 6
fosfato deshidrogenasa, creatinina quinasa
MPGF: Descondensación de la cabeza del espermatozoide
Reorganización orgánulos intracitoplasmáticos:
Mitocondrias, Golgi, REL: formas menos activas
Gránulos corticales: distribución uniforme → periférica
Maduración de las células foliculares
Células del cumulus oophorus: intervienen en la síntesis de proteínas
Tras el pico de LH, la FSH → secreción de ácido hialurónico → ruptura entre las
células del cumulus y el ovocito → expansión del cumulus →
¾Aumento de la superficie de contacto y adhesividad del complejo ovocito-cumulus
¾Interrupción de la llegada al ovocito de factores que impidan el reinicio de la meiosis
MADURACIÓN IN VITRO DEL OVOCITO
Conseguir en el laboratorio que el ovocito siga los mismos pasos que durante el
periodo de maduración folicular previo a la ovulación
Criterios para seleccionar la fuente y el tipo de ovocito
Condiciones necesarias para que se dé la maduración completa del ovocito
ORIGEN DE LOS OVOCITOS
Hembras vivas: Elevado valor genético
Animales prepúberes (2-3 meses): disminuye intervalo generacional
Animales gestantes (primeros 3 meses de gestación)
Hembras infértiles: oviductos obstruidos
Hembras que no responden a tratamientos de SO
Uso de diferentes machos
OPU: Ovum Pick Up: Aspiración transvaginal guiada por ecografía
-Repetición de la hembra
-Situación fisiológica/patológica de la hembra conocida: raza, edad,
estado de lactación, nutrición, estado reproductivo, patologías,…
Nº de ovocitos recogidos: 4.5-10 ovocitos/OPU y vaca
Hembras ovariectomizadas:
No repetición de la hembra
Pocos ovocitos/precio elevado
Tratamientos de pre-estimulación: FSH
Situación fisiológica/patológica de la hembra conocida: raza, edad,
estado de lactación, nutrición, estado reproductivo, patologías,…
Hembras de matadero:
Fuente de obtención de ovocitos más utilizada
No repetición de la hembra
Ovocitos a bajo precio
Recogida de un elevado número de ovocitos: en función de las hembras
sacrificadas
Desconocimiento total o parcial de la situación fisiológica/patológica de la
hembras
TÉCNICAS DE RECOGIDA DE LOS OVOCITOS
Disección
Consiste en aislar cada folículo ovárico del resto de tejido con ayuda de
pinzas y tijeras, liberando posteriormente los ovocitos tras la ruptura
controlada del folículo intacto
Diámetro y grado de atresia del folículo conocidos
Elevado rendimiento: 90-100 ovocitos/ folículo diseccionado
Mayor proporción de ovocitos de buena calidad (60%)
Máxima integridad de las células del cumulus oophorus
Limitación: tiempo
experimentos con pocos ovocitos
importancia del origen folicular de los ovocitos
Aspiración
Consiste en la punción y extracción del contenido de los folículos mediante
una aguja conectada a una jeringa u otro método de succión
Bovino: el método más utilizado
Menor rendimiento: 30-60 ovocitos / 100 folículos aspirados
Menor proporción de ovocitos de buena calidad (45%):
‰
Menor integridad del cumulus (disgregación de las células a la aspiración)
‰
Ovocitos de mayor calidad firmemente anclados en el folículo
Mayor rapidez de recogida de ovocitos: s/ovarios disponibles
selección más estricta
Slicing
Consiste en realizar cortes longitudinales y transversales con una hoja de
bisturí en la superficie de los ovarios para liberar los ovocitos
Mayor % de ovocitos recuperados/ ovario
Menor proporción de ovocitos de buena calidad (30-45%):
‰
Menor integridad del cumulus
‰
Ovocitos de mayor calidad firmemente anclados en el folículo
Mayor rapidez de recogida de ovocitos: s/ovarios disponibles
selección más estricta
Bovino: Solución salina + heparina
Slicing tras aspiración
Bovino: no ha presentado ventajas:
‰ recuperación de ovocitos
‰ calidad de los ovocitos recuperados
Otros métodos de recogida en masa
Digestión del tejido ovárico con tripsina durante 1 h + filtración: 221
ovocitos/ovario
Digestión de tejido ovárico con colagenasa (ovocitos preantrales)
Temperatura ovocitos: > 25ºC
SELECCIÓN DE LOS OVOCITOS
Parámetros visuales:
¾ 3 o más capas de células del cumulus (Mayor % blastocistos: >5 capas)
Intercambio de metabolitos y señales entre ovocito y células del cumulus →
maduración citoplasmática
Desechar ovocitos denudados o con cumulus incompleto
Geshi et al. (1999): terneros a partir de ovocitos madurados sin cumulus en un
medio de maduración suplementado con piruvato sódico y sin suero
¾ Cúmulus compacto vs cumulus expandido
Blondin and Sirard (1992): cumulus ligeramente expandido vs cumulus
compacto o expandido
Wurth and Kriup (1992): cumulus ligeramente expandido y células más
oscuras vs cumulus compacto y células brillantes
¾Apariencia homogénea del citoplasma vs heterogénea
Nagano et al. (1999): citoplasma heterogéneo > potencial de desarrollo
embrionario: presentan una mejor distribución de los gránulos corticales
(ME) disminución de la poliespermia
¾Test Blue Cresyl Brilliant
Glucosa 6 fosfato deshidrogenasa: sólo está presente durante el periodo de
crecimiento del ovocito
La G6PD reduce el BCB (azul) a un componente incoloro
Ovocito en crecimiento (sí BCB) + BCB = ovocito incoloro→ no MIV
Ovocito que ha terminado su crecimiento ( no G6PD) + BCB= ovocito azul
→ MIV
SISTEMAS DE MADURACIÓN IN VITRO
Medios de maduración
De soluciones salinas a medios + complejos
TCM 199: sales, piruvato sódico, lactato sódico, aminoácidos, vitaminas,
purinas,..+/- tampones: Hepes, bicarbonato sódico
pH: 7.2-7.4
Osmolaridad: 285-320mOsm/kg
+ Suplementos
¾Sueros: fuente de proteínas, ácidos grasos, VV, hormonas, factores de
crecimiento, ..
Suero fetal bovino, suero de vaca en celo, suero de buey
¾Hormonas: FSH, LH, estrógenos:
¾Epidermal Growth Factor
¾Cisteina, cisteamina, β-mercaptoetanol: precursores del glutation
Glutatión: su concentración intracitoplasmática aumenta durante la maduración
Protege al ovocito de reacciones oxidativas
Favorece la descondensación de la cromatina→ formación del PN masculino
Condiciones de cultivo
Temperatura: 38.5ºC
¾Si < 25ºC: ↑ anormalidades del huso cromosómico
¾Si > 40ºC: ↑ poliespermia
¾Atmósfera: 5% CO , sobretodo si el medio de MIV contiene bicarbonato
2
¾Tiempo: 24 h (vaca), 26 h (oveja), 27 h (cabra), 40-44h (cerda)
¾
Sistemas de maduración
Microgotas 50 o 100 μl recubiertas por aceite mineral
¾Placas de 4 pocillos: 500 μl
¾Placas de petri : 2 ml
¾Co-cultivo:
células de la granulosa
células Vero: células de riñón de Green monkey.
¾Estático sin células / no estático + células granulosa
¾
VALORACIÓN DE LA MADURACIÓN IN VITRO
¾Expansión de las células del cumulus
¾Extrusión del 1er corpusculo polar
50% de pérdida
¾Maduración nuclear
Fijación ovocito: etanol/ácido acético, paraformaldehido
Lacmoide, orceina (óptico), Hoechst, DAPI, yoduro de propidio (fluorescencia)
¾Maduración citoplasmática
Cambios ultraestructurales: poco práctico
Síntesis de proteínas ???
¾Capacidad de desarrollo del ovocito una vez fecundado
Descodensación de la cabeza del espermatozoide
Mórula,blastocisto: viabilidad inferior
¾Nacimiento de un animal vivo
Grupos de embriones seleccionados
Pocos nacidos
FACTORES QUE AFECTAN A LA CALIDAD DEL OVOCITO
¾Diámetro del folículo
Ovocitos procedentes de folículos pequeños (1-2 mm) : maduración nuclear pero
immaduros citoplasmáticamente
Ovocitos procedentes de folículos medianos (2-5 mm) o grandes (5-8mm): > %
maduración nuclear y blastocistos
¾Diámetro del ovocito
Relación entre el tamaño del folículo y el desarrollo del ovocito ⇒ relación entre
crecimiento del ovocito y su capacidad de desarrollo in vitro
Competencia meiótica aparece cuando el ovocito alcanza el 80-90% de su tamaño
pero hasta que no alcanzan su tamaño máximo, no puede completar la maduración
citoplasmática (Thibault et al)
≤ 90 μm: Incapaces de reiniciar la meiosis
<100 μm: 21 % ovocitos alcanzan la MII
100-109 μm: 42% ovocitos alcanzan la MII
110-119 μm: 76% ovocitos alcanzan la MII
≥ 120 μm: 81% ovocitos alcanzan la MII
Folículo<1: ovocito 98.9 μm
Folículo 1-1.9: ovocito 106.8 μm
Folículo 2-2.9: ovocito 112.9 μm
Folículo 3-3.9: ovocito 116.0 μm
Folículo >4: ovocito 117.2 μm
115 μm: reinicían la meiosis/ 120 μm: maduración nuclear y citoplasmática
¾Morfología del ovario
Gandolfi et al. (1997)
A) Presencia de un folículo > 10 mm diámetro
B) Presencia de más de 10 folículos de 2 a 5 mm de diámetro y ninguno de >
10 mm
C) Presencia de menos de 10 folículos de 2 a 5 mm de diámetro y ninguno de
> 10 mm
¾Edad
Animales prepúberes/adultos
¾Estado hormonal
Ciclo estral
Gestación
¾Tratamientos hormonales (FSH o PMSG)
Incrementa el nº ovocitos /ovario
Mejoran/no mejoran la calidad del ovocito
Respuesta variable entre hembras
Evitar activación
¾Otros
Estación: vaca< oveja y cabra
Individuo
¾Edad
Animales prepúberes/adultos
¾Estado hormonal
Ciclo estral
Gestación
¾Tratamientos hormonales (FSH o PMSG)
Incrementa el nº ovocitos /ovario
Mejoran/no mejoran la calidad del ovocito
Respuesta variable entre hembras
Evitar activación
¾Otros
Estación: vaca< oveja y cabra
Individuo