Recombinación Homóloga
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Recombinación genética Intercambio de material genético entre cromosomas homólogos, permite que no quede fijado el contenido de alelos de cada cromosoma Variabilidad: Base de la evolución “shuffling genetico”: la recombinación permite separar mutaciones favorables de no favorablesÆ selección natural 1 Recombinación homóloga (o generalizada) •2 secuencias de DNA iguales o similares (homólogas) •Ruptura de las dos moléculas de DNA •Intercambio de fragmentos de DNA en cualquier punto de las moléculas homólogas de DNA. •No hay cambio en la organización general del DNA 2 Recombinación sitio específica (o especializada) •Entre secuencias específicas •Requiere proteínas específicas que reconocen secuencias específicas y promueven recombinación •Induce cambios en la organización del DNA 3 Recombinación Homóloga • Ruptura de la doble hélice en 2 moléculas de DNA homólogas y unión cruzada • Sitio de intercambio Æ secuencias homólogas • Heteroduplex en sitio de intercambio • No hay alteración de la secuencia en el sitio de intercambio 4 Modelo de Holliday •Formación del heteroduplex •Migración de ramas (Branch migration) •Resolución: clivaje a través del punto de ramificación 5 Modelos de inicio de la recombinación: •Modelo de Holliday •Modelo de MesselsonRadding 6 Modelos de inicio de la recombinación: •Modelo de DSB 7 Conversión Génica • No todos los eventos de recombinación llevan a la formación de estructuras de “crossover” • Sin embargo, eventos de “non-crossover” (patch-like) pueden tener consecuencias genéticas Æ Conversión génica • En la conversión génica, un alelo se pierde y es remplazado por el alelo alternativo. 8 Funciones de la Recombinación homóloga en E.coli – Reparación • DSB • Bloqueo de replicación – Recombinación • Conjugación • Transducción • Transformación 9 Generación de DSB en el DNA 10 Reparación de rupturas de doble cadena en E.coli 11 Recombinación homóloga en E.coli Al menos 25 tipos distintos de proteínas involucradas en recombinación homóloga en E.coli RecA, RecBCD, RecF, RecG, RecJ, RecN, RecO, RecQ, RecR, RuvAB, RuvC, PriA, SSB, DNA polimerasas, DNA topoisomerasas y DNA ligasas. Secuencia en cis χ (hotspot de recombinación) GCTGGTGG Genoma de E.coli 1009 sitios χ (1/6kb) 12 Sistema RecBCD (E.coli) Esencial para el 99% de eventos de recombinación en DSB en E.coli • Iniciación – Procesamiento del DSB (RecBCD y RecQ) – Formación del filamento infectivo (RecA) • Apareamiento de homólogos e intercambio de cadenas – Invasión de la doble hélice • Extensión del heteroduplex – Complejo de proteínas motoras RuvAB • Resolución – Endonucleasa RuvC (parte del complejo RuvAB) 13 Sistema RecBCD de recombinación homóloga (E.coli) 14 •Extensión del heteroduplex –Complejo de proteínas motoras RuvAB 15 Distribución de sitios chi en el genoma de E.coli 16 Recombinación Homóloga (HR) en Eucariotas • Como en procariotas HR es requerida para reparación y restablecimiento de una horquilla de replicación frenada en eucariotas. • HR es crítica durante la meiosis para el apareamiento y alineamiento de los cromosomas homólogos. • Sin HR y alineamiento correcto de los cromosomas Æ no disyunción • Control general de la recombinación: 1 o 2 cross-over / par de homólogos. Probabilidad de ningún cross-over < 0,1%. • Frec. de recombinación no constante a lo largo del cromosoma • Frec. de recombinación depende del largo de las regiones homólogas > 75pb • Variabilidad 17 Meiosis- Profase I Leptotene Condensamiento de la cromatina Colocalización y coalineamiento de homólogos DS Ærequeridos para el apareamiento Zigotene Formación del complejo sinaptonémico Inicio de la recombinación Æ Filamento infectivo Paquitene Intercambio de cadenas Æ Unión de Holliday Complejo sinaptonémico Nódulos de recombinación Diplotene Recombinación completa Disolución del complejo sinaptonémico Separación cromosomas Æ Quiasmas •Diaquinesis 18 Complejo sinaptonémico 19 Recombinación homóloga en Eucariotas durante meiosis • “Factorias de recombinación”: incluyen varias proteínas y se forman durante la meiosis. • DSB Æ al menos 10 genes requeridos: Spo11 endonucleasa • Complejo MRX: RAD50, XRS2, MRE11 • Homólogos de RecA : RAD51 y DMC1 • Rad52 interactúa con Rad51 y Dmc1 para antagonizar RPA (ss binding protein) y promover más eficientemente el ensamblado del filamento de Rad51-DNA en HR • La proteína Mus81 parecería ser el análogo eucariota de la Resolvasa (RuvC) 20 21 Iniciación de recombinación homóloga durante meiosis 22 Procesamiento del DSB y formación del filamento infectivo 23 24 Overview of the main steps and factor requirements of the DNA DSB repair pathway of HR Jackson, S. P. Carcinogenesis 2002 23:687-696; doi:10.1093/carcin/23.5.687 Copyright restrictions may apply. 25 RECOMBINACIÓN SITIO ESPECÍFICA •Reacción entre dos sitios específicos •Largo de sitios blanco 14-50pb •Pueden ser secuencias homólogas o no •Enzimas involucradas específicas (recombinasas) Integración del Fago lambda (Recombinasa= Int) Fago P1 (Recombinasa Cre / sitios loxP) Resolución de cointegrados (plásmidos multiméricos) Sistema de recombinación sitio específica Xer (Cromosoma Bacteriano). En E.coli: sitio blanco (dif, 28pb) + 2 recombinasas XerC y XerD. 26 Integración del genoma del Fago Lambda en el genoma de E.coli durante el ciclo lisogénico. •Requiere secuencias específicas en el Fago Lambda y en el genoma bacteriano •Requiere proteínas específicas del Fago y de la Bacteria •Ruptura e integración sin síntesis de DNA •Ruptura sitio específica (endonucleasa específica) e intercambio de cadenasÆ unión de Holliday •Migración de rama (región homóloga) y resolución 27 Int (fago) IHF (bact) Secuencias específicas Proteínas específicas attP (Fago λ )Æ POP’ 240pb Int (fago) attB (bacteria)Æ BOB’ 23pb IHF (bacteria) 28 attP Æ POP’ aprox 240pb attB Æ BOB’ aprox 23pb O = core Æ15pb 29 30 31 Sistema de recombinación basado en recombinación sitio específica del fago lambda (sitios att) 2 Reacciones posibles: 1) attB x attP Æ attL + attR (mediada por Int + IHF) 2) attL x attR Æ attB + attP (mediada por Int + IHF + Xis) 32 attB1 y attB2 sitios attB mutantes 33 Phage lambda recombination in E. coli cos Phage λ The Gateway® System attP relies on five sets of 232 bp specific and non cross- x reacting att sequences attB E. coli 21 bp Integration (Int, IHF) Excision (Int, IHF, Xis) The specificity is given by the 7 nucleotides of the core region attL attR 96 bp 157 bp Lysogen 34 Building a Gateway® Entry Clone gene attL1 ccdB attB1 gene attB2 attP1 + attP2 Donor Vector KanR attL2 Entry Clone attR1 ccdB attR2 + KanR BP Clonase™ II 90-99% correct clones on Kan plates 35 Obtaining a Gateway® Expression Clone gene attB1 attL1 attR1 attL2 Entry Clone KanR ccdB ccdB gene + attR2 attP1 AmpR attP2 Donor Vector Destination Vector LR Clonase™ II attB2 Expression Clone + AmpR KanR 90-99% correct clones on Amp plates 36 37 Sistema Cre/LoxP 38 39
