C elegans SAltabe 19-5

Caenorhabditis elegans
Qué fue lo que maravilló a la comunidad
científica de este gusano tan discreto?
Buscando un organismo modelo para el estudio de desarrollo
animal , Sydney Brenner ……..
“--Excerpts from Proposal to the
Medical Research Council, 1963
Sydney Brenner
http://www.dailymotion.com/video/x72v4a_c-elegans-ungusano-nobel_school
C. elegans: el gusano elegido!
Cultivado facilmente
Tiempo corto de generación : 3 días
Es pequeño: 1 mm
Pocas células: Los adultos 959
hermafrodita (XX) o 1031 (XO)
Susceptible de análisis genetico:
El genoma es pequeño-100 Mb
Transparente:
Anatomía de C. elegans
• ES UN NEMATODO
•Organismo multicelular
simple
•Alargado en forma de tubo
•Recubierto por cutícula
-959 células somáticas
organizadas formando
órganos y sistemas simples
302 son neuronas
95 son miocitos pared en la
hermafrodita
1031células somáticas 381
son neuronas en el macho
1% de la población
Anatomía de C. elegans
Tiene un sistema digestivo formado
por estoma (o boca), faringe e
intestino
Pharynx
Intestine (yellow)
Gonad (pink)
Anus
Rectum
También dispone de órganos sexuales
(gónadas)
Vulva Epidermis
Sistema nervioso rudimentario
head
anterior
~1 mm
tail
posterior
Es movil, se alimenta, defeca, pone huevos, forma larvas dauer, tiene respuesta sensitiva
al tacto, al sabor , olor y a la temperatura, otros comportamientos complejos como
apareamiento, comportamiento social, aprendizaje y memoria (Rankin, 2002; de Bono,
2003).
boca
Variedad de tejidos
(nervioso, intestinal, muscular).
Pseudoceloma
esqueleto
hidrosttico
Cuticula
Seccion del cuerpo circular: cavidad pseudoceloma no es de origen mesodermico
• Tienen sexos
separados
• Las hembras son
más grandes que los
machos
• Tamaños varían
entre milímetros y
metros
• La mayoría son
ovíparos (producen
huevos
Macho XO
•Dimorfismo
sexual:
hermafroditas XX
(útiles
para
mantener
línea
homocigota)
y
machos X0 (0,2%
población, útiles
para
realizar
cruzas).
Sistema reproductor del macho
túbulo que comienza como testículo, seguido de la
vesícula seminal, vas deferente, conducto eyaculatorio y
termina en una apertura llamada cloaca
Favorece la variabilidad genética
C. elegans gonadas: tiene un sistema reproductivo
eficiente
, tienen oviductos, ovarios y una cavidad para almacenar el
esperma
Similitudes del Sistema nervioso
Tiene dos sistemas nerviosos
independientes el somático de
282 neuronas y dos anillos
alrrededor de la faringe y al final
del cuerpo de unas 20 neuronas
comunicados entre sí
Caenorhabditis elegans
•Cultivo en laboratorio:
•En placas Petri sobre
pasto de E. coli OP50
(auxótrofa para uracilocrecimiento lento).
Suplemento de
colesterol (esencial).
C. elegans como modelo de estudio
•Muy importante :
pueden conservarse
congeladas en 15% de
glicerol a -80°C por
largos períodos de
tiempo
C. elegans como modelo de estudio
•Sistema nervioso sencillo (302 neuronas). Cerebro primitivo en
región anterior: anillo neural. Mapa completo de conexiones
neuronales. Estudios de comportamiento.
C. elegans como modelo de estudio
•Microscopía: cuerpos transparentes en todas las etapas de
desarrollo: fusiones transcripcionales y traduccionales a GFP, otros
fluoróforos. Localización.
400x
1000x
1000x
Cepa AA278
daf9::GFP
L2-L3
120x
Cepa AA278
daf9::GFP
L2-L3
1000x
C. elegans como modelo de estudio
•Tiempo de generación corto (3 días a 20°C). Dependiente de la
temperatura.
•Ciclo de vida alternativo: dauer.
C. elegans como modelo de estudio
22°C
http://www.dailymotion.com/video/x72v4a_c-elegans-ungusano-nobel_school
C. elegans como modelo de estudio
•Genoma completo secuenciado (1998). Diploides para 5
autosomas + cromosoma sexual X (diploide o haploide).
•40% de genes relacionados con enfermedades humanas se
encuentran presentes en el nematodo.
-100 Mb, 19 000 genes,
~5 000 essential.
Algunas técnicas…
• Microscopía de fluorescencia
• Knock-down de genes por RNA de interferencia
• Western blot
• qRT-PCR
• Análisis genético: mutantes, cruzas
• Microinyección
•Estrategia de ARN de interferencia (RNAi) para el estudio de la
función génica.
FUNCIÓN
¿Cuál es el rol natural del iRNA en la célula?
PROTECCIÓN
Este mecanismo actúa como un sistema inmune
a nivel celular.
REGULACIÓN
Este sistema regula la expresión de genes,
especialmente en el desarrollo.
MECANISMO
RNA de interferencia
A
A
siRNA se
introduce
en la célula
B
siRNA se acopla RISC
(RNA induced silencing complex)
y se le remueve la hebra
sentido
B
C
C
iRNA se une al RNAm
Slicer Ago 2 corta el
RNAm
D
D
Se evita
traducción y se
silencia el gen
•Efecto sistémico: dsRNA capaz de cruzar las paredes intestinales
y dispersarse a tejidos somáticos y gónadas.
•Bibliotecas RNAi.
• Descubierto por Sydney Brenner(1963).
• Describió las primeras mutantes Brenner(1974).
• Se determinaron los linajes post embriogenicos (Sulston and Horwitz,1976).
• Muerte celular programada( Horwitz, 1982).
• Se determinaron los linages celulares completos( Deppe et al, Sulston 1983).
• Se estableció en forma complete la conectividad del Sistema nervioso(1986).
• Se descubrieron los mecanismos de RNAi y miRNA en el gusano (1991-98)
• (Nobel Prize: Fire, Mello 2006).
• Se empleó por primera vez la GFP(1994) (Nobel Prize: Chalfie, 2008).
• Fue el primer animal cuyo genoma se secuenció completamente (97Mb,now 100.3Mb).28
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Uso para estudio de enfermedades[editar]
Estudio de la obesidad
Muchos de los genes implicados en la regulación lipídica de C. elegans se han conservado en humanos. Se han
encontrado genes implicados en regulación de la función intestinal, metabolismo y apetito cuya inactivación mediante
RNAi causa reducción de la obesidad o incremento del almacenamiento lipídico, según el caso.El estudio de la
obesidad en C. elegans se puede realizar fácilmente mediante tinción de sus grasas, cuantificación y estudio de su
evolución tras la exposición de diversas sustancias.
Estudio de la diabetes
C. elegans es similar a la humana y regula tanto el metabolismo como el desarrollo y la longevidad. Los mutantes
de C. elegans con defectos metabólicos en esta vía de señalización permiten el estudio de compuestos capaces de
resolver estos defectos.
Estudio del envejecimiento
C. elegans es una excelente elección para estudiar el envejecimiento debido a su corta vida media, la facilidad para
inducir estrés oxidativo y los parecidos con el proceso de envejecimiento humano. Los factores genéticos y
ambientales que afectan a C. elegans son similares a aquellos que afectan a humanos, principalmente estrés
oxidativo junto a restricción calórica y sarcopenia.
Estudio del Alzheimer
El progresivo envejecimiento de la población ha aumentado el interés por el estudio de la enfermedad de Alzheimer.
Existen gusanos transgénicos que desarrollan agregadosamiloides de diferentes tamaños, parecidos a los que
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Kavya Leo
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aparecen en cerebros afectados de Alzheimer. El estudio estos agregados ha convertido a C. elegans en un
Desarrollo de drogas.
C. Elegans Versus cells and other model organisms
C.elegans
Living
test tube
experiments in disease
relevant genetic
backgrounds
experiments in complex
multi-cellular physiology
amenable to high throughput
screening in an entire
animal model
Ventajas del uso de C. elegans frente a otros modelos





Ahorro en tiempo: la esperanza de vida de C. elegans es de 2-3 semanas
frente a 2-5 años de ratones. Esto permite obtener resultados en menos
tiempo.
Ahorro en costes: el mantenimiento y estudio de C. elegans en laboratorio
es más barato y sencillo que otros modelos animales como ratones o
mosca de la fruta.
Ahorro en espacio, frente a otros modelos animales de mayor tamaño como
ratones.
Mayor valor estadístico: el grupo habitual de trabajo es de 300 individuos
para C. elegans frente a 30-50 en ratones, aumentando la fiabilidad de los
resultados.
Permite añadir una etapa intermedia entre estudios in vivo y ensayos
clínicos para ciertos modelos de enfermedades de los que no existe modelo
en ratones.
The Nobel Prize in Physiology
or Medicine 2002
"for their discoveries concerning ’
genetic regulation of organ development
and programmed cell death'"
Sidney Brenner
H. Robert Horvitz
John Sulston
A SHORT HISTORY OF C. elegans RESEARCH
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Kavya Leo
33
Síntesis de lípidos en C. elegans: rol en el desarrollo
Composición de ácidos grasos de C. elegans
20
18
20:5
17
18:1
n7
17Δ
15
14
19
16
18:2
18:0
19Δ
Columna wax
Espectro de GCMS del primer estadío larval de C. elegans
(x1,000,000)
4.5
4.0
18:1n7
18:2n6
18:0
3.5
3.0
16:0
PUFAs
wt
17Δ
2.5
Pod-2
2.0
1.5
1.0
Fas-n1
0.5
0.0
7.5
10.0
12.5
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
30.0
32.5
35.0
Pod-2
ARNi
N2
Fasn-1
Aumento 12,6 X
Comparación fenotípica
Fasn-1
Pod-2
EV
Aumento 6,3X
Tipo de AG
Huevos
Control
pod-2
fasn-1
Ramificados
14.30±1.1
8.93±1.1
1.67±
2.17±
Ciclo
15.13±0.7
30.15±6.3
19.59±
19.41±
SFA
11.85±1.8
17.54±0.8
53.14±
51.16±
MUFA
26.77±1.9
12.87±8.1
17.55±
20.27±
18:1 n9
2.57±0.2
3.00±0.9
3.37±
3.01±
PUFA
29.39±0.2
27.52±0.7
4.68±
3.98±
Muchas Gracias