Región codificante de p24 Estrategia para la clonación de la p24 de
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Figura 1 Estrategia para la clonación de la p24 de VIF en un plásmido procariótico Cola de histidina BamHI NcoI Región codificante de p24 Se utilizó el plásmido pRSET C que permite la clonación de la p24 en continuidad con el marco de lectura generado en el ATG inicial. La cola de 6xHis facilita su detección en western blots y su posterior purificación para ser usada en el ELISA. Expresión de la proteína recombinante de p24 del virus de Inmunodeficiencia felina (VIF) en bacteria Se observa en la figura un gel de poliacrilamida teñido con Coomasie Brillant Blue el cual permite visualizar las proteínas producidas en la cepa control (BL21) y en la que produce la proteína recombinante (@p24) con una cola de histidina (circulo verde) El ladder es el marcador de peso molecular que indica el peso de referencia de 25 daltons. •gel 17% stacking gel 6% Coomasie Brillant Blue • corrida: 120V x 2hs •Ladder: Rainbow (BioRad) Ladder p25 Figura 2 @p24 p24 BL21 Western blot de proteína recombinante p24 (@p24) del virus de Inmunodeficiencia felina (VIF) Se observa en la figura el western blot con el lisado de bacteria BL21 que expresa la @p24 confrontado con un anticuerpo anti histidina que reconoce la 6xHis presente en la proteína recombinante. Obsérvese la diferencia con la bacteria BL21 control. La flecha azul indica la banda correspondiente a la proteína recombinante. Western Blot WB para @p24: α-His • separating gel 17% stacking gel 6% ladder • corrida: 120V x 2hs @p24 • transferencia: 400mA x 1h • Bloqueo: ON 4% leche TTBS @p24 BL21 35 30 25 • 1º Ab: 1:3000 x 1h α-His Amersham • 2º Ab: 1:15000 x 1h α-IgG mice Amersham 15 10 • Rev. Luminiscente: BioRad • Ladder: Rainbow (BioRad) • Membrana: PVDF Figura 3
